固相亚磷酰胺法——简易讲解模板
dna化学合成法操作流程
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在进行 DNA 化学合成之前，需要进行充分的准备。
固相亚磷酰胺法——简易讲解模板 共18页
固相亚磷酰胺法
演讲：某某某 PPT: 某某某
资料查找：某某某 某某某
发明者： Marvin H. Caruthers
背景：
（马文·H·卡拉瑟斯）
美国国家科学院院士，美国
科罗拉多大学化学及生物化
学系教授。
1968年，在西北大学获得博
士学位。现主要从事核酸化
每个循环过程中都经过高效率且化学 性质活泼的核苷酸3′-亚磷酸酰胺中间体， 其氧化后成为稳定的五价磷酸三酯。
特点：
具有高效、快速的偶联以及 起始反应物比较稳定的特点。
详细步骤：
第一步：将预先连接在固相载体
CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三 氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基 团DMT，获得游离的5'-羟基。（DMT： 二甲氧基三苯甲基）
第三步，带帽(capping)反应，
缩合反应中可能有极少数5'-羟 基没有参加反应(少于2%)，用 乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继 续发生反应，这种短片段可以在 纯化时分离掉。
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第四步：在氧化剂碘的作用
下，亚磷酰形式转变为更稳定
DTMHP
将核苷酸 固定在载 体上
A 在团5在脱羟‘某被三去基端反D氯D的MM应T乙T羟取产下酸基代生，作以游磷用保离酸下护的基，
可以开始了
CP G
第二步：合成DNA的原料，
亚磷酰胺保护核苷酸单体，与 活化剂四氮唑混合，得到核苷 亚磷酸活化中间体，它的3'端 被活化，5'-羟基仍然被DMT保 护，与溶液中游离的5'-羟基 发生缩合反应。
DNA合成原理及操作
3. 氨解脱保护 合成完毕后取出载体进行切割并且脱保护。
一般40bp以内至少需要2小时，链越长需要 时间越长。
4. 纯化: 目前惯用的纯化方式主要有4种： OPC纯
化、 PAGE 纯化、脱盐纯化、 HPLC纯化
4.1 OPC纯化
利用OPC柱芯对DMT寡核苷酸特殊的亲和 力，将不带DMT的短片段用低浓度的有机溶剂洗 脱，吸附在柱芯里的DNA用酸除去DMT后用1ml 的20%乙腈洗脱。
缺点：不能批次生产，比较费时，有时样品接 收不好也不能有效分离。
5. 样品定量分装 样品纯化后洗脱在1ml的20%乙腈溶液
里，260紫外波长下测值，根据客户要求分 装，一般所有合成公司基本都会按1.2-1.5 倍放大给量。分装的样品干燥，经PAGE抽 样检测合格后交给市场。
合成时效：批次引物（按24条计算）在24小时之内可 以出货
DNA合成作业流程
1. 接收订单安排合成
合成部根据合成实际情况合理安排订单， 依次安排加急-测序-内部-外部，同一客户尽 量同批次安排合成，部分长链、G含量高、 合成量大的引物比较难合成，时间上可能会 有所延缓
2. 上机合成
不同型号的合成仪合成通量和合成时间均 不同，公司预定的仪器批次合成96条引物， 20bp长度合成需要2-3小时。
④氧自由基伤害 细胞代谢副产物O2-、H2O2等会造成碱基损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿 嘧啶等碱基修饰物，引起碱基配对错误。
三、 碱基插入或缺失 吖啶类分子带正电呈扁平状，易于嵌入DNA碱 基平面间，导致在复制或重组过程中缺失或插 入一个碱基。 DNA聚合酶在复个碱基的缺 失或插入。聚合酶在模板链上滑动易于造成缺 失，在生长链上滑动易于造成插入。 插入或缺失会导致读码框改变。
Invitrogen合成生物学服务产品手册说明书
Invitrogen 合成生物学服务产品手册•高品质引物和探针合成生物学服务合成生物学是什么？合成生物学是分子生物学与系统生物学的组合，使用工程学的原则来设计生物系统和生物工厂，其目的是创造出改进的生物功能以应对当前与未来的挑战。
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苏州、北京和广州工厂均获得ISO 9001认证，其中苏州工厂另有ISO 14000认证。
我们有多样化的仪器：• 25+台Jurassics 合成仪• 3台Applied Biosystems 3900合成仪• 3台Mermade12高通量合成仪• 1台AKTA 大规格合成仪• 5台LCMS 质检仪器• 1台 Agilent 96CE PRO II • 15+台 HPLC 纯化仪满足不同类型的应用需求：• PCR • qPCR • STR • SSR • NGSInvitrogen 引物合成服务已经超过了20年，我们在20余年的专业DNA 合成中积累了丰富的经验和良好的业内声誉。
DNA合成仪
N1 HO
O
乙酸酐和N-甲基咪唑
CPG
O C H 3C O N1
O
CPG
5.氧化：连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三 价）与CPG上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定， 易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常 用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。此步反应速度亦很快。应 注意最后一个循环时，氧化步骤不可省略。此外亦可用其他 氧化剂来完成氧化，从而得到各种符合实验需要的寡核苷酸。 Oxidiser (0.1M) (ABI) 0.1M Iodine in THF/pyridine/water
3.连接：亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时，与其5’羟基发生亲 核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。此步单体 相对于CPG所连核苷酸上5’-羟基过量保证了连接的高效率。 形成3’，5’－磷酸二酯键。其中，磷为3价。
N2 DMTrO
O P
CH(CH3)2 N1
N
CH(CH3)2
N2 DMTrO
O
O
P
N1 O
O
CPG
OCH2CH2CN
• 上述循环完成之后进行第二个合成循环。每经历 一轮循环，接长1个核苷酸。接长的链始终被固 定在不溶的固相载体上，过量的未反应物或分解 物则通过过滤或洗涤除去。
• 6.切离，脱保护：当整个链达到预定的长
度后，从固相载体上切下，脱去保护基(氨解)。 一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、 苯甲酰基、异丙基，用三氟乙酸脱5’-DMT。
1
D M T rO
O
T C A
CPG
N1 HO
O
CPG
2.活化：在缩合之前，单体与四唑混合并进 入合成柱，此时四唑提供一个质子给3’磷 酸上二异丙胺基的N原子，质子化的二异丙 胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷 酰胺四唑这种活性中间体。此步四唑过量保 证了单体活化充分。
第四章 目的基因的制取
第四章目的基因的制取内容提要•目的基因的制取策略•鸟枪法制取目的基因•物理化学法分离目的基因•化学合成基因•反转录合成DNA第一节目的基因制取的策略一、外源基因与目的基因基因工程主要是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而进行遗传研究或是获得表达产物。
通常我们把插入载体的DNA片段称为“外源基因”；将那些已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的DNA片段称为“目的基因”。
原核细胞含有上千个基因，真核细胞基因组内的基因数目更是庞大。
目的基因一般都很小，都仅由几千或几百甚至更少的碱基对组成（人生长激素释放抑制因子的基因仅有42bp）。
要想获得某个特定的目的基因，必须对其性质、结构有所了解，根据其特点来制定分离方案。
二、目的基因制取的策略目的基因制取的策略可分为直接制取和间接制取。
一般来说，大部分低等生物基因组的碱基序列已测定，可以直接制取目的基因（确切定位）。
对于高等哺乳动物来说，目的基因在DNA上无法定位，只能间接制取。
获取目的基因的方法：1、直接制取法：以机械的方法或是限制性内切酶对总DNA进行切割，再直接分离特点位点的DNA分子。
2、逆转录法（互补cDNA法）：以RNA为模板，逆转录合成cDNA。
缺点是cDNA中不含天然基因的内含子。
3、PCR扩增法：对于含极微量mRNA的细胞大多采用PCR扩增，再进行目的基因的制取。
4、鸟枪法（散弹法）：可快速和高纯度地从单拷贝或多拷贝基因中筛选获得天然的目的基因。
5、人工化学合成法。
6、其它方法：mRNA差异显示法、限制性片段长度多态性探针技术等。
目前，真核基因，利用DNA合成仪合成目的基因的成本较高；利用cDNA文库获得目的基因需大量前期工作；直接以生物细胞染色体DNA为模板可获得目的基因，但模板的扩增会产生非特异性产物；一般通过构建完整的基因文库，再从文库中“钓取”出目的基因。
第二节鸟枪法制取目的基因一、“鸟枪法”的概念“鸟枪法”是指将基因组按染色体分开后，将它全部打乱，切成碎片，进行随机测序，测序后再将它们拼接起来的方法。
引物设计（特别有用,良心推荐）
引物设计（特别有用,良心推荐）引物篇1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
PCR引物合成技巧
3.引物的OD数如何定量？
答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。
9.如何计算引物的浓度？
答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
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继续发生反应，这种短片段可以
在纯化时分离掉。
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第四步：在氧化剂碘的作用
下，亚磷酰形式转变为更稳定
第一个循环结束
的磷酸三酯。
后期处理
经过以上四个步骤，一 个脱氧核苷酸被连接到
2
固相载体的核苷酸上。 再以三氯乙酸脱去它的 5'-羟基上的保护基团 DMT，重复以上步骤， 直到所有要求合成的碱
A
可以开始了
CP G
第二步：合成DNA的原料，
亚磷酰胺保护核苷酸单体，与
活化剂四氮唑混合，得到核苷
亚磷酸活化中间体，它的3'端
被活化，5'-羟基仍然被DMT保
护，与溶液中游离的5'-羟基
发生缩合反应。
DM T
P
A
核苷酸与亚磷酰 胺，和活化剂四 氮唑混合，核苷 酸3’上的氢被 亚磷酰胺取代形 成核苷亚磷酰胺 活化中间体
具有高效、快速的偶联以及
起始反应物比较稳定的特点。
详细步骤：
第一步：将预先连接在固相载体
CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三
氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基
团DMT，获得）
DM H T
将核苷酸 固定在载 体上
P
在三氯乙酸作用下， 在某反应下，磷酸基 脱去DMT产生游离的 团被DMT取代以保护 羟基 5‘端的羟基
原理：
将核苷3'固定在固相载体（如CPG，可控微
孔玻璃珠）上,并在5'上连接一个保护基团DMT,使
合成的方向由待合成引物的3'端向5'端合成的。
相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。 每个循环过程中都经过高效率且化学 性质活泼的核苷酸3′-亚磷酸酰胺中间体， 其氧化后成为稳定的五价磷酸三酯。
特点：
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合 成效率。
基被接上去。
1
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下 来，通过OPC,page等手段纯化引物，成品引物用 C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮， 测定OD260定量，根据定单要求分装。
3
参考资料
1.亚磷酰胺法 ．全国科学技术名词审 定委员会[引用日期2015-01-23] 2.引物是如何合成的 ．生物 帮．2012-04-01[引用日期2015-0123]
亚P
DM T
P
A
之后产生的 H 亚P 核苷亚磷酸酰 胺活化中间体 3’端的亚磷酸 基团与第一步 制好的固相载 体的5’端活化 的羟基缩合
P
CPG
A
请在此添加段落内容……
请在此添加段落内容……
请在此添加段落内容……
第三步，带帽(capping)反应，
缩合反应中可能有极少数5'-羟 基没有参加反应(少于2%)，用 乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后
3.《环球科学》杂志：组装生命的生 物工厂
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目前最常用的DNA自动化固相合成方法— —固相亚磷酰胺法
固相 亚磷酰胺法
演讲：某某某 PPT: 某某某 资料查找：某某某 某某某
发明者：
背景：
Marvin H. Caruthers （马文·H·卡拉瑟斯）
美国国家科学院院士，美国 科罗拉多大学化学及生物化 学系教授。 1968年，在西北大学获得博 士学位。现主要从事核酸化 学和生物化学，利用DNA自身 的化学性质，研发出一种单 链DNA合成法。 1987年，发明‚固相亚磷酰 胺法‛。 1994年，被授予美国国家科 学院院士。