DNA合成仪的使用方法
dna化学合成法操作流程
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在进行 DNA 化学合成之前，需要进行充分的准备。
基因合成技术实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握基因合成的基本原理和操作步骤。
2. 熟悉基因合成仪器的使用方法。
3. 了解基因合成的应用领域。
二、实验原理基因合成是指利用化学方法，按照特定的DNA序列，合成出具有生物学活性的DNA 片段。
该技术是现代生物技术领域的重要手段之一，广泛应用于基因克隆、基因编辑、基因治疗等领域。
基因合成的原理基于DNA双螺旋结构和碱基互补配对原则。
在实验过程中，首先根据设计好的基因序列，合成相应的寡核苷酸引物；然后，通过PCR技术扩增目的基因；最后，将扩增的目的基因克隆到载体上，进行后续的实验操作。
三、实验材料1. 基因合成仪2. PCR仪3. DNA序列分析软件4. DNA合成试剂5. PCR试剂6. 载体DNA7. 质粒提取试剂盒8. 琼脂糖凝胶电泳试剂盒9. DNA连接酶10. DNA标记物四、实验步骤1. 设计基因序列：根据实验目的，设计目的基因的DNA序列，并利用DNA序列分析软件进行优化。
2. 合成寡核苷酸引物：根据设计好的基因序列，合成相应的寡核苷酸引物。
3. PCR扩增目的基因：将合成的寡核苷酸引物、模板DNA、PCR试剂等混合，进行PCR扩增。
4. 琼脂糖凝胶电泳检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察目的基因的扩增情况。
5. 质粒提取：将PCR产物克隆到载体上，进行质粒提取。
6. DNA连接：将质粒与目的基因进行连接。
7. 转化：将连接后的质粒转化到宿主细胞中。
8. 筛选阳性克隆：通过PCR、测序等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。
9. 阳性克隆的验证：对阳性克隆进行DNA测序，验证目的基因的正确性。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过琼脂糖凝胶电泳检测，观察到目的基因的扩增条带，表明目的基因已成功克隆。
2. 阳性克隆的筛选：通过PCR和测序，筛选出含有目的基因的阳性克隆。
3. 阳性克隆的验证：DNA测序结果表明，目的基因序列与设计序列一致，验证了目的基因的正确性。
DNA合成仪的使用方法
DNA合成仪的使用方法亚磷酰胺寡核苷酸合成为例介绍该类仪器的一般操作步骤。
亚磷酰胺DNA合成的试剂有：保护碱基的5／—DMT，A、G、C、T亚磷酰胺单体，四唑偶联催化剂，乙酐，N—甲基咪唑封闭试剂，三氯乙酸（TCA）脱保护溶液，12氧化混合物，乙腈清洗溶剂，氨水切除溶液。
使用步骤如下：1）仔细检查合成仪上所有试剂瓶中的试剂量，必要时换掉试剂瓶，特别注意乙腈的量，因为该溶剂用量较大。
2）将标记好的清洁的收集瓶装在合成仪上。
3）将要合成的DNA序列输入合成仪。
4）检查选择的合成步骤是否正确。
5）选择结束方法：TritylOffAuto是仪器的原始状态，若打算以5，—DMT基团连接纯化寡核苷酸，将其转变为TritylOnAuto结束状态。
6）选择结束方法，一般为系统的原始状态。
7）在每个柱监视器的Username下，输入你所希望的保存名字。
8）以代码代替相应的DNA序列标记每一个收集瓶。
9）打印出每一个柱设置的详细资料。
10）检查打印出来的资料是否正确。
11）运行StartColumn步骤检查每一个柱的位置，确保合成仪上合成柱处于正确的位置。
12）检查连接在合成仪上的溶剂残留（废液瓶）是否充满。
13）如果分部收集器用来收集每个DMT脱保护步骤的流出物，确保试管充分清洁干净，并打开分部收集器，确保DMT废液管路通向分部收集器。
14）启动循环，运行开始程序清洗试剂管路，除去原来的试剂。
注意：TritylOnAuto表示在合成寡核苷酸的5’端核苷酸带有一个DMT，并将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；TritylOffAuto表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；TritylOnManual表示合成寡核苷酸的5’端核苷酸带有一个DMT，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中；TritylOffManual表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中。
PCR仪器的使用及注意事项
PCR仪器的使用及注意事项PCR仪器（聚合酶链式反应仪）是用于在体外合成DNA的关键仪器，其具有高灵敏度、高特异性和高效率的特点。
在科研领域，PCR仪器被广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变分析等实验中。
本文将介绍PCR仪器的使用方法及注意事项。
1.使用方法（1）准备样品：将需要进行PCR的DNA模板、引物、dNTPs和聚合酶按照配比加入PCR反应管中，并确保样品完全溶解。
（2）设置PCR程序：根据实验需要设置PCR程序，包括温度梯度、循环次数等参数。
（3）装载PCR反应管：将混合好的PCR反应管放入PCR仪器的样品槽中，注意不要产生气泡。
（4）运行PCR程序：启动PCR程序，跟踪反应过程中的温度变化，确保程序正常运行。
（5）分析PCR产物：将PCR产物进行电泳分析或其他实验操作，检查PCR反应的效果。
2.注意事项（1）严格遵守无菌操作规范：在进行PCR实验前，必须保证实验操作环境和操作工具的无菌干净，以防止外源DNA的污染影响PCR反应结果。
（2）避免反应管交叉污染：在操作PCR反应管时，要避免反应液的溅出和反应管之间的交叉接触，保持每个反应管的PCR反应独立进行。
（3）严格控制温度：PCR反应的温度是影响反应结果的重要因素，必须严格控制PCR仪器的温度梯度和循环次数，避免因温度波动导致PCR 反应不稳定。
（4）避免电泳误判：在对PCR产物进行电泳分析时，要注意区分PCR产物和非特异产物，避免因PCR产物的数量或大小而误判实验结果。
（5）及时清理PCR仪器：使用完PCR仪器后，要及时清理反应槽和反应管槽，避免因污染影响下次实验的结果。
总之，PCR仪器的正确使用方法和注意事项对实验结果的准确性和可靠性至关重要。
科研人员在使用PCR仪器时，务必严格遵守操作规范，保证实验操作的准确性和可重复性，从而获得稳定可靠的实验数据。
PCR技术的应用将为生物学、医学和其他领域的研究提供重要支持和帮助。
DNA合成原理及操作
3. 氨解脱保护 合成完毕后取出载体进行切割并且脱保护。
一般40bp以内至少需要2小时，链越长需要 时间越长。
4. 纯化: 目前惯用的纯化方式主要有4种： OPC纯
化、 PAGE 纯化、脱盐纯化、 HPLC纯化
4.1 OPC纯化
利用OPC柱芯对DMT寡核苷酸特殊的亲和 力，将不带DMT的短片段用低浓度的有机溶剂洗 脱，吸附在柱芯里的DNA用酸除去DMT后用1ml 的20%乙腈洗脱。
缺点：不能批次生产，比较费时，有时样品接 收不好也不能有效分离。
5. 样品定量分装 样品纯化后洗脱在1ml的20%乙腈溶液
里，260紫外波长下测值，根据客户要求分 装，一般所有合成公司基本都会按1.2-1.5 倍放大给量。分装的样品干燥，经PAGE抽 样检测合格后交给市场。
合成时效：批次引物（按24条计算）在24小时之内可 以出货
DNA合成作业流程
1. 接收订单安排合成
合成部根据合成实际情况合理安排订单， 依次安排加急-测序-内部-外部，同一客户尽 量同批次安排合成，部分长链、G含量高、 合成量大的引物比较难合成，时间上可能会 有所延缓
2. 上机合成
不同型号的合成仪合成通量和合成时间均 不同，公司预定的仪器批次合成96条引物， 20bp长度合成需要2-3小时。
④氧自由基伤害 细胞代谢副产物O2-、H2O2等会造成碱基损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿 嘧啶等碱基修饰物，引起碱基配对错误。
三、 碱基插入或缺失 吖啶类分子带正电呈扁平状，易于嵌入DNA碱 基平面间，导致在复制或重组过程中缺失或插 入一个碱基。 DNA聚合酶在复个碱基的缺 失或插入。聚合酶在模板链上滑动易于造成缺 失，在生长链上滑动易于造成插入。 插入或缺失会导致读码框改变。
DNA合成仪
N1 HO
O
乙酸酐和N-甲基咪唑
CPG
O C H 3C O N1
O
CPG
5.氧化：连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三 价）与CPG上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定， 易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常 用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。此步反应速度亦很快。应 注意最后一个循环时，氧化步骤不可省略。此外亦可用其他 氧化剂来完成氧化，从而得到各种符合实验需要的寡核苷酸。 Oxidiser (0.1M) (ABI) 0.1M Iodine in THF/pyridine/water
3.连接：亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时，与其5’羟基发生亲 核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。此步单体 相对于CPG所连核苷酸上5’-羟基过量保证了连接的高效率。 形成3’，5’－磷酸二酯键。其中，磷为3价。
N2 DMTrO
O P
CH(CH3)2 N1
N
CH(CH3)2
N2 DMTrO
O
O
P
N1 O
O
CPG
OCH2CH2CN
• 上述循环完成之后进行第二个合成循环。每经历 一轮循环，接长1个核苷酸。接长的链始终被固 定在不溶的固相载体上，过量的未反应物或分解 物则通过过滤或洗涤除去。
• 6.切离，脱保护：当整个链达到预定的长
度后，从固相载体上切下，脱去保护基(氨解)。 一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、 苯甲酰基、异丙基，用三氟乙酸脱5’-DMT。
1
D M T rO
O
T C A
CPG
N1 HO
O
CPG
2.活化：在缩合之前，单体与四唑混合并进 入合成柱，此时四唑提供一个质子给3’磷 酸上二异丙胺基的N原子，质子化的二异丙 胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷 酰胺四唑这种活性中间体。此步四唑过量保 证了单体活化充分。
DNA合成仪
不同型号DNA/RNA合成仪的特点与性能简介
PE公司391型DNA／RNA合成仪
美国贝克曼公司01ig01000系列DNA合成仪
DNA合成仪的使用方法操作步骤
1)仔细检查合成仪上所有试剂瓶中的试剂量，必要时换掉试剂瓶，特别注 意乙腈的量，因为该溶剂用量较大。 2)将标记好的清洁的收集瓶装在合成仪上。 3)将要合成的DNA序列输入合成仪。 4)检查选择的合成步骤是否正确。 5)选择结束方法：TritylOffAuto是仪器的原始状态，若打算以5，—DMT基 团连接纯化寡核苷酸，将其转变为TritylOnAuto结束状态。 6)选择结束方法，一般为系统的原始状态。 7)在每个柱监视器的Username下，输入你所希望的保存名字。 8)以代码代替相应的DNA序列标记每一个收集瓶。 9)打印出每一个柱设置的详细资料。 10)检查打印出来的资料是否正确。 11)运行StartColumn步骤检查每一个柱的位置，确保合成仪上合成柱处于 正确的位置。 12)检查连接在合成仪上的溶剂残留(废液瓶)是否充满。 13)如果分部收集器用来收集每个DMT脱保护步骤的流出物，确保试管充分 清洁干净，并打开分部收集器，确保DMT废液管路通向分部收集器。 14)启动循环，运行开始程序清洗试剂管路，除去原来的试剂。
DNA 合 成 仪
长达200个 核苷酸 每次循环12 ~15分钟
用于寡核苷酸化学合成的单体
寡核苷酸片段合成步骤
一、脱保护基(Deblocking) 用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在 CP苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得 游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。 二、活化(Activation) 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合 成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此 中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。 三、连接(Coupling) 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时， 将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一 个碱基。 四、封闭(Capping) 缩合反应后为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后 的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐 和N-甲基咪唑等混合形成的。 五、氧化(Oxidation) 缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷 酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷 酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
dna合成技术
DNA合成技术是一种人工合成DNA分子的方法。
DNA是生物体内负责存储遗传信息的分子，通过合成DNA，科学家可以在实验室中创建特定的DNA序列。
DNA合成技术通常使用化学合成方法，通过逐个添加核苷酸单元来构建DNA链。
核苷酸是DNA分子的基本组成单元，包括脱氧核糖（deoxyribose）、磷酸基团和碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶）。
在DNA合成过程中，科学家首先确定所需的DNA序列，并将其输入到合成仪器中。
合成仪器会自动按照输入的序列信息，逐个添加核苷酸单元，从而逐渐构建出完整的DNA链。
合成的DNA可以具有不同长度和序列，可以是天然DNA序列的复制品，也可以是人工设计的新序列。
DNA合成技术在生物学和医学研究中具有广泛的应用。
科学家可以利用合成的DNA来研究基因功能、构建基因工程载体、合成人工基因和蛋白质等。
此外，DNA合成技术还可以应用于基因治疗、疫苗研发、药物开发等领域。
总之，DNA合成技术是一种通过化学合成方法合成DNA分子的技术，为生物学和医学研究提供了重要的工具和方法。
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DNA合成仪的使用方法
亚磷酰胺寡核苷酸合成为例介绍该类仪器的一般操作步骤。
亚磷酰胺DNA合成的试剂有：保护碱基的5／—DMT，A、G、C、T亚磷酰胺单体，四唑偶联催化剂，乙酐，N—甲基咪唑封闭试剂，三氯乙酸（TCA）脱保护溶液，12氧化混合物，乙腈清洗溶剂，氨水切除溶液。
使用步骤如下：
1）仔细检查合成仪上所有试剂瓶中的试剂量，必要时换掉试剂瓶，特别注意乙腈的量，因为该溶剂用量较大。
2）将标记好的清洁的收集瓶装在合成仪上。
3）将要合成的DNA序列输入合成仪。
4）检查选择的合成步骤是否正确。
5）选择结束方法：TritylOffAuto是仪器的原始状态，若打算以5，—DMT基团连接纯化寡核苷酸，将其转变为TritylOnAuto结束状态。
6）选择结束方法，一般为系统的原始状态。
7）在每个柱监视器的Username下，输入你所希望的保存名字。
8）以代码代替相应的DNA序列标记每一个收集瓶。
9）打印出每一个柱设置的详细资料。
10）检查打印出来的资料是否正确。
11）运行StartColumn步骤检查每一个柱的位置，确保合成仪上合成柱处于正确的位置。
12）检查连接在合成仪上的溶剂残留（废液瓶）是否充满。
13）如果分部收集器用来收集每个DMT脱保护步骤的流出物，确保试管充分清洁干净，
并打开分部收集器，确保DMT废液管路通向分部收集器。
14）启动循环，运行开始程序清洗试剂管路，除去原来的试剂。
注意：TritylOnAuto表示在合成寡核苷酸的5’端核苷酸带有一个DMT，并将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；TritylOffAuto表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；TritylOnManual表示合成寡核苷酸的5’端核苷酸带有一个DMT，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中；TritylOffManual表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中。