固相亚磷酰胺法——简易讲解模板共18页
DNA合成原理及操作
3. 氨解脱保护 合成完毕后取出载体进行切割并且脱保护。
一般40bp以内至少需要2小时，链越长需要 时间越长。
4. 纯化: 目前惯用的纯化方式主要有4种： OPC纯
化、 PAGE 纯化、脱盐纯化、 HPLC纯化
4.1 OPC纯化
利用OPC柱芯对DMT寡核苷酸特殊的亲和 力，将不带DMT的短片段用低浓度的有机溶剂洗 脱，吸附在柱芯里的DNA用酸除去DMT后用1ml 的20%乙腈洗脱。
缺点：不能批次生产，比较费时，有时样品接 收不好也不能有效分离。
5. 样品定量分装 样品纯化后洗脱在1ml的20%乙腈溶液
里，260紫外波长下测值，根据客户要求分 装，一般所有合成公司基本都会按1.2-1.5 倍放大给量。分装的样品干燥，经PAGE抽 样检测合格后交给市场。
合成时效：批次引物（按24条计算）在24小时之内可 以出货
DNA合成作业流程
1. 接收订单安排合成
合成部根据合成实际情况合理安排订单， 依次安排加急-测序-内部-外部，同一客户尽 量同批次安排合成，部分长链、G含量高、 合成量大的引物比较难合成，时间上可能会 有所延缓
2. 上机合成
不同型号的合成仪合成通量和合成时间均 不同，公司预定的仪器批次合成96条引物， 20bp长度合成需要2-3小时。
④氧自由基伤害 细胞代谢副产物O2-、H2O2等会造成碱基损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿 嘧啶等碱基修饰物，引起碱基配对错误。
三、 碱基插入或缺失 吖啶类分子带正电呈扁平状，易于嵌入DNA碱 基平面间，导致在复制或重组过程中缺失或插 入一个碱基。 DNA聚合酶在复个碱基的缺 失或插入。聚合酶在模板链上滑动易于造成缺 失，在生长链上滑动易于造成插入。 插入或缺失会导致读码框改变。
DNA合成仪
N1 HO
O
乙酸酐和N-甲基咪唑
CPG
O C H 3C O N1
O
CPG
5.氧化：连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三 价）与CPG上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定， 易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常 用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。此步反应速度亦很快。应 注意最后一个循环时，氧化步骤不可省略。此外亦可用其他 氧化剂来完成氧化，从而得到各种符合实验需要的寡核苷酸。 Oxidiser (0.1M) (ABI) 0.1M Iodine in THF/pyridine/water
3.连接：亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时，与其5’羟基发生亲 核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。此步单体 相对于CPG所连核苷酸上5’-羟基过量保证了连接的高效率。 形成3’，5’－磷酸二酯键。其中，磷为3价。
N2 DMTrO
O P
CH(CH3)2 N1
N
CH(CH3)2
N2 DMTrO
O
O
P
N1 O
O
CPG
OCH2CH2CN
• 上述循环完成之后进行第二个合成循环。每经历 一轮循环，接长1个核苷酸。接长的链始终被固 定在不溶的固相载体上，过量的未反应物或分解 物则通过过滤或洗涤除去。
• 6.切离，脱保护：当整个链达到预定的长
度后，从固相载体上切下，脱去保护基(氨解)。 一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、 苯甲酰基、异丙基，用三氟乙酸脱5’-DMT。
1
D M T rO
O
T C A
CPG
N1 HO
O
CPG
2.活化：在缩合之前，单体与四唑混合并进 入合成柱，此时四唑提供一个质子给3’磷 酸上二异丙胺基的N原子，质子化的二异丙 胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷 酰胺四唑这种活性中间体。此步四唑过量保 证了单体活化充分。
固相亚磷酰胺法——简易讲解模板
继续发生反应，这种短片段可以
在纯化时分离掉。
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第四步：在氧化剂碘的作用
下，亚磷酰形式转变为更稳定
第一个循环结束
的磷酸三酯。
后期处理
经过以上四个步骤，一 个脱氧核苷酸被连接到
2
固相载体的核苷酸上。 再以三氯乙酸脱去它的 5'-羟基上的保护基团 DMT，重复以上步骤， 直到所有要求合成的碱
A
可以开始了
CP G
第二步：合成DNA的原料，
亚磷酰胺保护核苷酸单体，与
活化剂四氮唑混合，得到核苷
亚磷酸活化中间体，它的3'端
被活化，5'-羟基仍然被DMT保
护，与溶液中游离的5'-羟基
发生缩合反应。
DM T
P
A
核苷酸与亚磷酰 胺，和活化剂四 氮唑混合，核苷 酸3’上的氢被 亚磷酰胺取代形 成核苷亚磷酰胺 活化中间体
具有高效、快速的偶联以及
起始反应物比较稳定的特点。
详细步骤：
第一步：将预先连接在固相载体
CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三
氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基
团DMT，获得）
DM H T
将核苷酸 固定在载 体上
P
在三氯乙酸作用下， 在某反应下，磷酸基 脱去DMT产生游离的 团被DMT取代以保护 羟基 5‘端的羟基
原理：
将核苷3'固定在固相载体（如CPG，可控微
孔玻璃珠）上,并在5'上连接一个保护基团DMT,使
合成的方向由待合成引物的3'端向5'端合成的。
相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。 每个循环过程中都经过高效率且化学 性质活泼的核苷酸3′-亚磷酸酰胺中间体， 其氧化后成为稳定的五价磷酸三酯。
DNA合成及组装
微矩阵及微流控
Twist 工作流程
1. 全程自动化
2. 实现云服务，与 客户云端交流， 实时跟踪
3. 高通量（100w孔， 9600 gene）， 试剂节省，
4. 操作方便，信息 保密。
5. 开放API，支持用 户自定义编程
寡核苷酸及基因合成服务公司
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分类
设备+服务
设备+服务 设备 设备
服务平台 服务平台 服务，试剂 服务，试剂
平台 服务 服务 服务平台
扩展服务 试剂，修饰
DEL
高通量微矩阵 技术
生物全系
生物全系 生物全系
优点：高效（99.5%）、快速，精准可控 缺点：1. 内部缺陷，错误率1%。
2. 单突变。 3. 纯化损耗大, OPC与HPLC的得率约为30%～50%，PAGE的得率约为10%～30%
DNA合成仪
Dr.Oligo 96DNA/RNA核酸合成仪 K&A H-64型核酸合成仪
ABI 394合成仪
德国PolyGen公司DNA合成仪
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工业金标准 高通量，云操作
服务全面
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引物-生产及使用详解
引物-生产及使用详解（一）引物的合成和纯化1. 引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
安基生物公司采用的合成仪为最新引进的Dr.Oligo192高通量合成仪，效率高，合成量大，质量稳定。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下：第一步：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。
第二步：合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步：带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC、PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
Oligo DNA合成原理
Oligo DNA 合成
固相亚磷酰胺三酯法是目前最常用的Oligo DNA化学合成方法，它具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
合成步骤：
1、脱保护：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基；
2、缩合：合成DNA的原料-单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应；
3、带帽(capping)反应：缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应；
4、氧化：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯；
通过上述步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被连接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率；
5、氨解：通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来；
6、纯化：切下来的Oligo粗品根据实验目的不同选择不同的纯化手段进行纯化，OD260定量及抽干后根据定单要求对Oligo进行分装。
寡核苷酸的制备与纯化
寡核苷酸的制备与纯化DNA的合成有磷酸三酯法、亚磷酰胺法、氢磷酸法等，现在常用的是固相亚磷酰胺法，它具有快速、方便、偶联效率高等特点。
一般从3′向5′合成，通过下列四个步骤加上一个核苷酸。
第一步，脱保护：用三氯乙酸或二氯乙酸脱去连在固相载体上的核苷酸5′羟基上的保护基团DMT，使它暴露出来进行下一步反应。
第二步，偶联：将亚磷酰胺单体用四唑活化，形成高反应性的亚磷酰四唑，进入合成柱，与连在固相载体上的寡核苷酸5′羟基偶联，这一步效率一般在98％以上。
第三步，封闭：为了防止少量未反应（＜2％﹞的连在固相载体上的5′羟基进入下一循环，用醋酐对其进行乙酰化封闭，大大提高了最后产品的纯度。
第四步，氧化：缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酯转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
经过上面四个步骤，核苷酸被逐个加到合成的寡核苷酸链上。
最后用浓氨水把寡核苷酸从固相载体上切割下来，脱去碱基和磷酸基团上的保护基团，随后进行纯化和定量。
纯化方法：寡核苷酸的纯化常用的方法有OPC，HPLC，PAGE，C18等方法。
OPC柱中装有对DMT具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5'端最后一个碱基上的DMT，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有DMT 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有DMT的片段吸附能力弱，被洗脱。
然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去DMT基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。
这种方法的优点是快速，简易。
但是其专一性吸附DMT能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。
特别是对长于25碱基以上的片段纯化效果不好。
利用离子交换或反相HPLC纯化寡核苷酸是国外公司常用的方法，它具有自动化程度高、快速、简便的优点，缺点是需要仪器，对长片段效果不理想。
PAGE纯化是利用长短片段带的电荷不同，电泳迁移率不同来分离不纯物和产品，它的优点是产品纯度高、质量可靠，是国内许多公司推崇的方法，缺点是实验步骤多，费人工。
引物篇(引物合成及各种问题总结)
引物篇1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
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第四步：在氧化剂碘的作用
下，亚磷酰形式转变为更稳定
第的一磷酸个三酯循。 环结束
后期处理
经过以上四个步骤，一
个脱氧核苷酸被连接到 固相载体的核苷酸上。 再以三氯乙酸脱去它的 5'-羟基上的保护基团
2
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合 成效率。
可以开始了
CP G
第二步：合成DNA的原料，
亚磷酰胺保护核苷酸单体，与 活化剂四氮唑混合，得到核苷 亚磷酸活化中间体，它的3'端 被活化，5'-羟基仍然被DMT保 护，与溶液中游离的5'-羟基 发生缩合反应。
DTMP
A
核苷酸与亚磷酰
胺，和活化剂四 氮唑混合，核苷
亚P
酸3’上的氢被
亚磷酰胺取代形
成核亚磷酰胺
学院院士。
原理：
将核苷3'固定在固相载体（如CPG，可控微 孔玻璃珠）上,并在5'上连接一个保护基团DMT,使 合成的方向由待合成引物的3'端向5'端合成的。
相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
每个循环过程中都经过高效率且化学 性质活泼的核苷酸3′-亚磷酸酰胺中间体， 其氧化后成为稳定的五价磷酸三酯。
特点：
具有高效、快速的偶联以及 起始反应物比较稳定的特点。
详细步骤：
第一步：将预先连接在固相载体
CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三 氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基 团DMT，获得游离的5'-羟基。（DMT： 二甲氧基三苯甲基）
DTMHP
将核苷酸 固定在载 体上
A 在团5在脱羟‘某被三去基端反D氯D的MM应T乙T羟取产下酸基代生，作以游磷用保离酸下护的基，
活化中间体
PDM
T
A
P 之后产生的
核苷亚磷酸酰
H亚P
A
胺活化中间体
3’端的亚磷酸
基团与第一步
制好的固相载
体的5’端活化
CPG
的羟基缩合
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第三步，带帽(capping)反应，
缩合反应中可能有极少数5'-羟 基没有参加反应(少于2%)，用 乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继 续发生反应，这种短片段可以在 纯化时分离掉。
发明者： Marvin H. Caruthers
背景：
（马文·H·卡拉瑟斯）
美国国家科学院院士，美国
科罗拉多大学化学及生物化
学系教授。
1968年，在西北大学获得博
士学位。现主要从事核酸化
学和生物化学，利用DNA自身
的化学性质，研发出一种单
链DNA合成法。
1987年，发明“固相亚磷酰
胺法”。
1994年，被授予美国国家科
2.引物是如何合成的 ．生物 帮．2019-04-01[引用日期2019-0123]
3.《环球科学》杂志：组装生命的生 物工厂
Thank you!
谢谢！
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18
DMT，重复以上步骤，
直到所有要求合成的碱
基被接上去。
1
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下
来，通过OPC,page等手段纯化引物，成品引物用
C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，
测定OD260定量，根据定单要求分装。
3
参考资料
1.亚磷酰胺法 ．全国科学技术名词审 定委员会[引用日期2019-01-23]