第八章 特殊毒性及其试验与评价方法(1)
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药物特殊毒性评价
人类基因库是指人群生殖细胞所具有的能传给下一代的 全部基因总和。 基因组是指单一个体所具有全部基因 在人群中每个个体新携带的有害基因的平均水平叫做人 群的遗传负荷（Genntic load）或突变负荷（mutation
load)
突变后果
体细胞突变的后果
体细胞突变的后果中令人最关心的是致癌问题 其次是致畸 体细胞的突变可能与动脉硬化有关 体细胞突变是老化的起因
一、Ames试验
菌株鉴定
③uvrB缺失的鉴定（紫外线敏感试验） uvrB缺失，即切除修复系统缺失 ④R因子的鉴定：带有R因子的菌株具有抗氨苄 青霉素的特性
一、Ames试验
菌株鉴定
（2）自发回变数测定 受试菌株在保存或培养过程应 经过体外代谢活化系统后的自发回变数，要比不 经体外代谢活化系统的自发回变数略高。
和TA102四种标准菌株。
一、Ames试验
一、Ames试验
[菌株鉴定]
基因型鉴定
A. 组氨酸需求试验 B. 深粗糙型(rfa)鉴定 C. urvB缺失的鉴定 D. R因子的鉴定(抗生素抗性试验)
自发回变数测定 对鉴别性致突变物的反应
菌株鉴定
一、Ames试验
（1）基因型鉴定 ①组氨酸营养缺陷型鉴定（组氨酸需求试验） 组氨酸营养缺陷型菌株只能在补充有组氨酸的培养皿上 生长 ②深粗糙型（rfa）鉴定（结晶紫抑菌试验） 深粗糙型突变细菌，缺乏脂多糖屏障，一些大分子能进 入菌体
二、染色体畸变 在诱变因素的作用下，染色体从
长轴上断下一个片段
2.染色体结构的畸变 断裂是造成染色体结构变 染色体的断片未与断裂端连接 化的根本原因，根据断片不同的重接方式，形 结果：失去一个片段及所携带的遗 成以下四种畸变： 传密码 （1）缺失 断片与同源染色体连接 结果：使部分遗传密码重复出现 （2）重复 断片作180°倒转后，再接到断端 （3）倒位 结果：所携带的遗传密码紊乱 两条非同源染色体同时断裂，两个 （4）易位
load)
突变后果
体细胞突变的后果
体细胞突变的后果中令人最关心的是致癌问题 其次是致畸 体细胞的突变可能与动脉硬化有关 体细胞突变是老化的起因
一、Ames试验
菌株鉴定
③uvrB缺失的鉴定（紫外线敏感试验） uvrB缺失，即切除修复系统缺失 ④R因子的鉴定：带有R因子的菌株具有抗氨苄 青霉素的特性
一、Ames试验
菌株鉴定
（2）自发回变数测定 受试菌株在保存或培养过程应 经过体外代谢活化系统后的自发回变数，要比不 经体外代谢活化系统的自发回变数略高。
和TA102四种标准菌株。
一、Ames试验
一、Ames试验
[菌株鉴定]
基因型鉴定
A. 组氨酸需求试验 B. 深粗糙型(rfa)鉴定 C. urvB缺失的鉴定 D. R因子的鉴定(抗生素抗性试验)
自发回变数测定 对鉴别性致突变物的反应
菌株鉴定
一、Ames试验
（1）基因型鉴定 ①组氨酸营养缺陷型鉴定（组氨酸需求试验） 组氨酸营养缺陷型菌株只能在补充有组氨酸的培养皿上 生长 ②深粗糙型（rfa）鉴定（结晶紫抑菌试验） 深粗糙型突变细菌，缺乏脂多糖屏障，一些大分子能进 入菌体
二、染色体畸变 在诱变因素的作用下，染色体从
长轴上断下一个片段
2.染色体结构的畸变 断裂是造成染色体结构变 染色体的断片未与断裂端连接 化的根本原因，根据断片不同的重接方式，形 结果：失去一个片段及所携带的遗 成以下四种畸变： 传密码 （1）缺失 断片与同源染色体连接 结果：使部分遗传密码重复出现 （2）重复 断片作180°倒转后，再接到断端 （3）倒位 结果：所携带的遗传密码紊乱 两条非同源染色体同时断裂，两个 （4）易位
[课件]第八章 安全性毒理学评价PPT
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第八章 安全性毒理学评价
概述
目前，已知人类可能接触或销售的化学物有500 万种，进行了化学物毒性登记的只有10万余种， 而其中人类经常使用或接触的化学物种类已逾7万 种。此外，许多新化学物正以每年1000种的速度 不断涌现。这些化学物在影响生态环境的同时，
对人类的健康也造成了严重的威胁。
基本概念
3 显性致死试验﹑睾丸生殖细胞染色体畸变分析试验和 精子畸变试验中任选一项 4 DNA修复合成试验。
第三阶段：亚慢性毒性试验和代谢试验 亚慢性毒性试 验的目的是观察受试物以不同剂量较长期喂养，对动物 的毒性作用性质和靶器官，并确定最大无作用剂量；了 解受试物对动物繁殖功能的影响及对子代的致癌作用； 为慢性毒性和致癌试验的剂量选择提供依据，并为评价 受试动物能否应用于食品提供依据。
安全性毒理学评价程序的基本内容
化学结构 组成成分和杂质 收集化学物有关的基本资料 试 验 前 的 准 备 工 作 理化性质 化学物的定量分析方法 了解化学物的使用情况 原料和中间体
进行适用人畜实际接触和 应用的产品形式的试验
急性毒性试验
第一阶段 毒不 理同 学阶 试段 验安 项全 目性 评 价 的 动物皮肤﹑黏膜试验 吸入刺激阈浓度试验 第二阶段 蓄积毒性试验 致突变试验 亚慢性毒性试验
第四阶段
致癌试验
安 注全 意性 的评 问价 题中 需
实验设计的科学性
试验方法的标准化
评价结论的高度综合性
食品与兽药安全性毒理学评价程序
一 食品安全性毒理学评价程序
我国食品安全性毒理学评价程序包括4个评价阶 段，即第一阶段急性毒性阶段；
第二阶段蓄积毒性突变试验；
第三阶段亚慢性毒性试验（包括繁殖试 验和致畸试验）和代谢试验； 第四阶段慢性毒性试验（包括致癌试验）。
概述
目前，已知人类可能接触或销售的化学物有500 万种，进行了化学物毒性登记的只有10万余种， 而其中人类经常使用或接触的化学物种类已逾7万 种。此外，许多新化学物正以每年1000种的速度 不断涌现。这些化学物在影响生态环境的同时，
对人类的健康也造成了严重的威胁。
基本概念
3 显性致死试验﹑睾丸生殖细胞染色体畸变分析试验和 精子畸变试验中任选一项 4 DNA修复合成试验。
第三阶段：亚慢性毒性试验和代谢试验 亚慢性毒性试 验的目的是观察受试物以不同剂量较长期喂养，对动物 的毒性作用性质和靶器官，并确定最大无作用剂量；了 解受试物对动物繁殖功能的影响及对子代的致癌作用； 为慢性毒性和致癌试验的剂量选择提供依据，并为评价 受试动物能否应用于食品提供依据。
安全性毒理学评价程序的基本内容
化学结构 组成成分和杂质 收集化学物有关的基本资料 试 验 前 的 准 备 工 作 理化性质 化学物的定量分析方法 了解化学物的使用情况 原料和中间体
进行适用人畜实际接触和 应用的产品形式的试验
急性毒性试验
第一阶段 毒不 理同 学阶 试段 验安 项全 目性 评 价 的 动物皮肤﹑黏膜试验 吸入刺激阈浓度试验 第二阶段 蓄积毒性试验 致突变试验 亚慢性毒性试验
第四阶段
致癌试验
安 注全 意性 的评 问价 题中 需
实验设计的科学性
试验方法的标准化
评价结论的高度综合性
食品与兽药安全性毒理学评价程序
一 食品安全性毒理学评价程序
我国食品安全性毒理学评价程序包括4个评价阶 段，即第一阶段急性毒性阶段；
第二阶段蓄积毒性突变试验；
第三阶段亚慢性毒性试验（包括繁殖试 验和致畸试验）和代谢试验； 第四阶段慢性毒性试验（包括致癌试验）。
第八章 外源化学物的毒作用表现
➢“多次”：当一次最大染毒剂量 不能达到以充分了解该毒物急性 毒性作用的目的，从而在24h内分 9
急性毒性概述
➢中毒效应出现时间
➢瞬间死亡：氰化钾、煤气等 ➢迟发毒效应和死亡：有机磷农药 ➢快速和剧烈的毒效应后恢复 ➢轻微症状—恢复—严重中毒—死亡
（毒菇）
➢7~14d
➢中毒效应的强度：一般行为、外观、 大体形态、死亡
250g、狗10～15kg。同一批试验动
物体重变异范围不应超过该批动物
平均体重的20％。
13
急性毒性试验要点
➢性别
➢除特殊要求外，一针般急对性胚毒性胎试验对动
物性别要求为雌雄各半。如果在预试验
时发现化学毒物(如发农药育)对畸雌形、雄动物 毒效应的敏感性有明显情差异况，则应单独
分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。
用剂量设一个中间剂量组，最好是相当于 34
研究设计
➢染毒方式
➢尽量选择和人类接触途径相似的方式。 一般采用口染毒方式。
➢染毒时间
➢亚慢性毒性染毒1~3个月； ➢慢性毒性染毒6个月~2年。
35
研究观察
➢染毒方式
外观 生长发育 行为功能 毒性体征
最终体重 脏器湿重 脏/体比
脏器系数
亚慢性、慢性 毒性试验过程
蓄积剂量与一次染毒使半数动物出现相同效应
（或死亡）的剂量的K比值。蓄积毒性分级
ED50 K=E（Dn）50（1）
<1 高度蓄积 1~ 明显蓄积
3~ 中等蓄积
5~ 轻度蓄积
26
研究方法
➢蓄积系数法
➢K值越小，表示化学毒物的蓄积性越大 ➢K=1：化学毒在动物体内全部蓄积或每 次染毒后毒效应是叠加的。 ➢K<1：反复染毒出现过敏现象 ➢K>5：蓄积毒性极弱
急性毒性概述
➢中毒效应出现时间
➢瞬间死亡：氰化钾、煤气等 ➢迟发毒效应和死亡：有机磷农药 ➢快速和剧烈的毒效应后恢复 ➢轻微症状—恢复—严重中毒—死亡
（毒菇）
➢7~14d
➢中毒效应的强度：一般行为、外观、 大体形态、死亡
250g、狗10～15kg。同一批试验动
物体重变异范围不应超过该批动物
平均体重的20％。
13
急性毒性试验要点
➢性别
➢除特殊要求外，一针般急对性胚毒性胎试验对动
物性别要求为雌雄各半。如果在预试验
时发现化学毒物(如发农药育)对畸雌形、雄动物 毒效应的敏感性有明显情差异况，则应单独
分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。
用剂量设一个中间剂量组，最好是相当于 34
研究设计
➢染毒方式
➢尽量选择和人类接触途径相似的方式。 一般采用口染毒方式。
➢染毒时间
➢亚慢性毒性染毒1~3个月； ➢慢性毒性染毒6个月~2年。
35
研究观察
➢染毒方式
外观 生长发育 行为功能 毒性体征
最终体重 脏器湿重 脏/体比
脏器系数
亚慢性、慢性 毒性试验过程
蓄积剂量与一次染毒使半数动物出现相同效应
（或死亡）的剂量的K比值。蓄积毒性分级
ED50 K=E（Dn）50（1）
<1 高度蓄积 1~ 明显蓄积
3~ 中等蓄积
5~ 轻度蓄积
26
研究方法
➢蓄积系数法
➢K值越小，表示化学毒物的蓄积性越大 ➢K=1：化学毒在动物体内全部蓄积或每 次染毒后毒效应是叠加的。 ➢K<1：反复染毒出现过敏现象 ➢K>5：蓄积毒性极弱
新药药理学：特殊毒性试验
特殊毒性试验
特殊毒性试验
❖ 狭义的特殊毒性试验：指遗传毒性试验、生 殖毒性试验、致癌试验，即一般常说的“三 致”试验
❖ 广义的特殊毒性试验：除“三致”试验以外， 还包括依赖性试验、过敏性试验、局部刺激 性试验、溶血性试验、免疫毒性试验、光敏 试验、眼毒试验、耳毒试验等等
药物依赖性试验
❖ 药物依赖性是指药物长期与 机体相互作用，使机体在生 理机能、生化过程和/或形态 学发生特异性、代偿性和适 应性改变的特性，停止用药 可导致机体的不适和/或心理 上的渴求
GPMT和BT试验
试验动物皮内或涂皮给予诱导剂量，经过 10~14天诱导期，此时免疫反应发生，然后 给予激发剂量，以观察是否出现过敏反应。 将诱导期和攻击期的皮肤反应及其程度进 行对比，并与赋形剂组进行比较
试验动物：成年豚鼠，受试物组不少于20 只/组
试验分组：设阴性、阳性（苯佐卡因等） 对照
ASA和PCA试验
过敏性试验
❖ 过敏性：又称超敏反应，指机体受同一抗原 再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理 功能紊乱的特异性免疫反应，是异常或病理 性免疫反应
过敏性反应分类
❖ Ⅰ型：快发或速发过敏型 ❖ Ⅱ型：细胞毒型或溶细胞型 ❖ Ⅲ型：免疫复合物型或血管炎型 ❖ Ⅳ型：免疫迟发型或结核菌型
（光过敏性）
过敏性试验分类
药物依赖性
❖ 依赖性可分为躯体依赖性和精神依赖性
❖ 躯体依赖性主要是机体对长期使用依赖性药物所产 生的一种适应状态，包括耐受性和停药后的戒断症 状
❖ 精神依赖性是药物对中枢神经系统作用所产生的一 种特殊的精神效应，表现为对药物的强烈渴求和强 迫性觅药行为
身体依赖性试验
❖ 自然戒断试验：连续给予动物一段时间的受试药后， 突然停药，观察动物出现的戒断症状，与同类的代 表药物做对比，按照戒断症状和严重程度判断受试 药的依赖性潜力
特殊毒性试验
❖ 狭义的特殊毒性试验：指遗传毒性试验、生 殖毒性试验、致癌试验，即一般常说的“三 致”试验
❖ 广义的特殊毒性试验：除“三致”试验以外， 还包括依赖性试验、过敏性试验、局部刺激 性试验、溶血性试验、免疫毒性试验、光敏 试验、眼毒试验、耳毒试验等等
药物依赖性试验
❖ 药物依赖性是指药物长期与 机体相互作用，使机体在生 理机能、生化过程和/或形态 学发生特异性、代偿性和适 应性改变的特性，停止用药 可导致机体的不适和/或心理 上的渴求
GPMT和BT试验
试验动物皮内或涂皮给予诱导剂量，经过 10~14天诱导期，此时免疫反应发生，然后 给予激发剂量，以观察是否出现过敏反应。 将诱导期和攻击期的皮肤反应及其程度进 行对比，并与赋形剂组进行比较
试验动物：成年豚鼠，受试物组不少于20 只/组
试验分组：设阴性、阳性（苯佐卡因等） 对照
ASA和PCA试验
过敏性试验
❖ 过敏性：又称超敏反应，指机体受同一抗原 再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理 功能紊乱的特异性免疫反应，是异常或病理 性免疫反应
过敏性反应分类
❖ Ⅰ型：快发或速发过敏型 ❖ Ⅱ型：细胞毒型或溶细胞型 ❖ Ⅲ型：免疫复合物型或血管炎型 ❖ Ⅳ型：免疫迟发型或结核菌型
（光过敏性）
过敏性试验分类
药物依赖性
❖ 依赖性可分为躯体依赖性和精神依赖性
❖ 躯体依赖性主要是机体对长期使用依赖性药物所产 生的一种适应状态，包括耐受性和停药后的戒断症 状
❖ 精神依赖性是药物对中枢神经系统作用所产生的一 种特殊的精神效应，表现为对药物的强烈渴求和强 迫性觅药行为
身体依赖性试验
❖ 自然戒断试验：连续给予动物一段时间的受试药后， 突然停药，观察动物出现的戒断症状，与同类的代 表药物做对比，按照戒断症状和严重程度判断受试 药的依赖性潜力
一般毒性作用及其试验与评价方法
、皮肤等途径进 入生物体，影响其正常生理功能。
毒性作用的预防与控制
01
风险评估
对有毒化学品的潜在风险进行评 估，以确定其对人群健康的危害 程度。
预防措施
02
03
控制策略
采取有效措施降低人群暴露于有 毒化学品的程度，如加强监管、 改进生产工艺等。
制定和实施控制策略，以减少有 毒化学品的环境释放和暴露，保 护人群健康。
慢性毒性试验
总结词
慢性毒性试验是在长期（通常为3个月以上）的时间范围内评估物质对生物体的 毒性作用。
详细描述
慢性毒性试验旨在检测受试物在长期暴露下引起的慢性毒性效应，如致癌性、致 畸性和致突变性等，为制定安全限值和风险管理措施提供依据。
生殖毒性试验
总结词
生殖毒性试验是评估物质对生物体生殖功能和后代发育的毒 性作用。
毒性作用机制研究进展
细胞凋亡机制
研究化学物质诱导细胞凋亡的机制，了解其对 细胞生存的影响。
氧化应激机制
研究化学物质引起的氧化应激反应，揭示其对 细胞和组织的损伤作用。
信号转导机制
研究化学物质对细胞内信号转导通路的干扰，探讨其对细胞功能的影响。
毒性作用影响因素研究进展
暴露条件与毒性作用
研究不同暴露条件下化学物质的吸收、分布、代谢和排泄过程，以 及这些过程对毒性作用的影响。
危险度评价
危险度评价是在剂量-反应关系评价和暴露评价的基础上，综合分析受试物的潜在危害，并对其所致 健康影响的可能性及严重程度进行预测。
危险度评价需要考虑多种因素，如受试物的理化性质、暴露特征、毒性作用机制等，同时需要参考类 似化合物的毒理学资料和数据。根据危险度评价的结果，可以制定相应的风险管理措施，以降低受试 物对人类健康的潜在危害。
毒性作用的预防与控制
01
风险评估
对有毒化学品的潜在风险进行评 估，以确定其对人群健康的危害 程度。
预防措施
02
03
控制策略
采取有效措施降低人群暴露于有 毒化学品的程度，如加强监管、 改进生产工艺等。
制定和实施控制策略，以减少有 毒化学品的环境释放和暴露，保 护人群健康。
慢性毒性试验
总结词
慢性毒性试验是在长期（通常为3个月以上）的时间范围内评估物质对生物体的 毒性作用。
详细描述
慢性毒性试验旨在检测受试物在长期暴露下引起的慢性毒性效应，如致癌性、致 畸性和致突变性等，为制定安全限值和风险管理措施提供依据。
生殖毒性试验
总结词
生殖毒性试验是评估物质对生物体生殖功能和后代发育的毒 性作用。
毒性作用机制研究进展
细胞凋亡机制
研究化学物质诱导细胞凋亡的机制，了解其对 细胞生存的影响。
氧化应激机制
研究化学物质引起的氧化应激反应，揭示其对 细胞和组织的损伤作用。
信号转导机制
研究化学物质对细胞内信号转导通路的干扰，探讨其对细胞功能的影响。
毒性作用影响因素研究进展
暴露条件与毒性作用
研究不同暴露条件下化学物质的吸收、分布、代谢和排泄过程，以 及这些过程对毒性作用的影响。
危险度评价
危险度评价是在剂量-反应关系评价和暴露评价的基础上，综合分析受试物的潜在危害，并对其所致 健康影响的可能性及严重程度进行预测。
危险度评价需要考虑多种因素，如受试物的理化性质、暴露特征、毒性作用机制等，同时需要参考类 似化合物的毒理学资料和数据。根据危险度评价的结果，可以制定相应的风险管理措施，以降低受试 物对人类健康的潜在危害。
特殊毒性及其试验与评价方法3
使细胞由促长阶段
进入进展阶段的化学
分化 程度 高
物称为进展剂
(progressor)。进展剂 可引起染色体畸变， 但不一定具有引发活 性。 引发、促长及进展都可自发发生。有些化学 致癌物可同时具有引发、促长及进展的作用， 称为完全致癌物。
低
在引发阶段主要是细胞原癌基因和肿瘤
抑制基因的突变；
在促长阶段主要是遗传外机制； 在进展阶段主要是核型不稳定性。 正常细胞经过遗传学改变的积累才能转变为 癌细胞。
毒症状或病理损伤。 低剂量组：一般不低于高剂量的10％。最好相当于 或低于人类实际接触的剂量，应不影响动物的正常 生长、发育和寿命，即不产生任何毒性效应。
中剂量组：介于高、低剂量之间（高剂量的
1/3~1/4），如有可能按受试物的毒物动力学性质
来确定。
对照组除不给受试物外，其他条件均与试验组相 同。 同时应设阴性（溶剂或赋形剂）对照组。 必要时可设阳性对照组，阳性致癌物最好与受试 物的化学结构相近。
理化生物因素、营养等
生物体
内源性因素
遗传、免疫、激素、精神等
引起癌基因、抑癌基因等发生点突变、 扩增、易位、重排、缺失等使癌基因活化， 抑癌基因失活，导致细胞的增殖、分化、 凋亡异常引起肿瘤。
三、致癌试验设计
1. 哺乳动物致癌试验
哺乳动物致癌试验是鉴定化学致癌物的标准
体内试验。
哺乳动物致癌试验用来确定受试物对实验动
DNA损 伤修复
引发 细胞
多阶段致癌 理论图解
肿瘤
癌前病变 促癌物
正常 上皮
上皮过 度增殖
早期 中期 晚期 原 浸润 腺瘤 腺瘤 腺瘤 位 转移 癌
引发 阶段
促长 阶段
进展阶段
创新药物学 特殊毒性评价
特殊毒性评价
第一节：特殊毒性评价的目的和意义 第二节：评价原则 第三节：内容和步骤 第四节：致突变试验 第五节：生殖毒性试验 第六节：致癌试验 第七节：其他特殊毒性试验
第一节 特殊毒性评价的目的和意义
毒理学
一般毒性评价
特殊毒性评价
急性毒性
长期毒性
局部毒性
遗传毒性 致癌性
生殖毒性 依赖性
➢ 特殊毒性：主要包括遗传毒性、致癌毒性和生殖毒性等，是新药安 全性评价的主要内容之一，同时也是临床前研究与评价中的重要内 容之一。
➢ （一）实验条件的遵循
➢ 根据《中华人民共和国药品管理法》的规定，毒性试验研究必须执行《药物非临床研究质量 管理规范》。
➢ （二）受试物的选择
➢ 受试物应能充分代表临床试验样品和上市药品。一般用中试或中试以上规模的样品，并注明 其名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及调配方法等。外用药物和注射剂一般以 制剂作为受试物。
四：动物体内骨髓细胞微核试验
➢ （一）原理
➢ 微核实验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速 检测方法。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤体受影响而在 细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。所以，微核实验能 检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分 离改变这两种遗传学终点。
➢ 2.浓度设置 至少设3个浓度组。高浓度以40%细胞生长抑制为基 准，中、低浓度组可采用倍量稀释法，最低浓度不得小于有效浓度。
➢ 3.代谢活化 采用药酶诱导剂处理后的哺乳动物肝微粒体酶（S9） 进行体外代谢活化实验，即在加S9mix和不加S9mix平行的条件下 测试。
➢ 4.药物作用时间 在非代谢活化条件下，药物和细胞分别作用24小 时和48小时收获细胞；而在代谢活化条件下，药物和细胞接触至少 6小时以上。
第一节：特殊毒性评价的目的和意义 第二节：评价原则 第三节：内容和步骤 第四节：致突变试验 第五节：生殖毒性试验 第六节：致癌试验 第七节：其他特殊毒性试验
第一节 特殊毒性评价的目的和意义
毒理学
一般毒性评价
特殊毒性评价
急性毒性
长期毒性
局部毒性
遗传毒性 致癌性
生殖毒性 依赖性
➢ 特殊毒性：主要包括遗传毒性、致癌毒性和生殖毒性等，是新药安 全性评价的主要内容之一，同时也是临床前研究与评价中的重要内 容之一。
➢ （一）实验条件的遵循
➢ 根据《中华人民共和国药品管理法》的规定，毒性试验研究必须执行《药物非临床研究质量 管理规范》。
➢ （二）受试物的选择
➢ 受试物应能充分代表临床试验样品和上市药品。一般用中试或中试以上规模的样品，并注明 其名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及调配方法等。外用药物和注射剂一般以 制剂作为受试物。
四：动物体内骨髓细胞微核试验
➢ （一）原理
➢ 微核实验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速 检测方法。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤体受影响而在 细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。所以，微核实验能 检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分 离改变这两种遗传学终点。
➢ 2.浓度设置 至少设3个浓度组。高浓度以40%细胞生长抑制为基 准，中、低浓度组可采用倍量稀释法，最低浓度不得小于有效浓度。
➢ 3.代谢活化 采用药酶诱导剂处理后的哺乳动物肝微粒体酶（S9） 进行体外代谢活化实验，即在加S9mix和不加S9mix平行的条件下 测试。
➢ 4.药物作用时间 在非代谢活化条件下，药物和细胞分别作用24小 时和48小时收获细胞；而在代谢活化条件下，药物和细胞接触至少 6小时以上。
特殊毒性试验
（三）试验期限与染毒时间
原则上试验期限要求长期或终生。致 癌试验通常与慢性毒性试验结合起来进 行
✓ 小鼠最少1.5年 ✓ 大鼠2年
（四）结果的观察、分析和评定
致癌试验常用的指标
1．肿瘤发生率 2．多发性 3．潜伏期
注意事项
➢ 对于阴性结果的认定应非常慎重 ➢ 两个物种，两种性别，至少三个剂量水 平且其中一个接近最大耐受量 ➢ 每组有效动物数至少50只（动物数量与 其自发肿瘤率成正比）
三、化学致癌过程
➢ 引发阶段 (initiation) ➢ 促长阶段 (promotion) ➢ 进展阶段 (progression)
1．引发阶段 / 启动阶段 突变细胞（启动细胞，initiated cell）
致癌物对靶细胞DNA产生损伤作用，经 细胞分裂增殖固定下来，造成单个或少量细 胞发生永久性、不可逆的遗传性改变
第二节 化学致癌物的分类
化学致癌物的分类
➢ 组1，对人类是致癌物，87种； ➢ 组2，对人类是很可能或可能致癌物
❖ 组2A，对人类很可能是致癌物，63种； ❖ 组2B，对人类是可能致癌物，234种； ➢ 组3，现有证据不能对人类致癌性进行分类， 493种； ➢ 组4，对人类可能是非致癌物，1种
二、根据致癌物作用机制的分类
形成的具有致癌作用的代谢物的统称
二、化学致癌作用的分子机制
（一）DNA加合物
有致癌活性的终致癌物，含有亲电子结 构基团的化合物，它能与细胞靶分子发生 共价结合，形成加合物使这些生物大分子 烷基化，导致DNA的突变
接触环境致癌物的标志
（二）DNA修复与化学致癌
➢ 正确修复，使机体内受损的DNA完 全回复原有的结构和功能
抑癌基因对细胞的生长、增殖和分化 起负调节作用，即抑癌作用
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一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这 些已断裂的节段远远分开，常将无着丝粒断片简称 为断片。有着丝粒的部分称为缺失，缺失有末端缺 失和中间缺失。
③环状染色体（ring chromosome） 染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒 的节段的两断端连接形成一个环时，称为环 状染色体。
④倒位（inversion） 当某一染色体发生两次 断裂后，其中间节段倒 转180再重接，称为 倒
观察化学毒物致突变作用一般通过致突变试验来
进行。主要目的：
①检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动
物和人的致癌性； ②检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒 性，预测其对人体的遗传危害性。
观察项目的选择
基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致 突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。 但是还有许多试验所观察到的现象并不直接反映基因
突变、染色体畸变和染色体分离异常，仅反映致突变
过程中发生的其他事件。将试验观察到的现象所反映 的各种事件统称为遗传学终点(genetic mdpoint)。
突变发生中的事件及遗传学终点的关系
细胞屏障 遗传毒物 正常DNA
DNA损伤
DNA修复过程 易错 修复 未修复的DNA 细胞分裂 损伤表达 断裂的DNA分子
二、突变类型
遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤： 基因突变
染色体畸变
端粒
着丝粒
姊 妹 染 色 单 体
端粒
染色体畸变 染色体的结构及数目改变。
组 蛋 白
基因突变 一个或几个DNA碱基对的改变。
碱基对
双 螺 旋
这些损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA
以外的靶组织受损所致。
基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本
4、细胞周期、有丝分裂与减数分裂
细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂
终了所经历的过程。
G0 ：DNA合成前期； G1 ：DNA合成期；
S：完成DNA复制；
G2：为有丝分裂做准备；
M：有丝分裂期
有丝分裂过程
有丝分裂指细胞核分 裂的过程，一个细胞 由此生成两个子细胞，
第八章
特殊毒性试验及其评价
第一节 致突变作用及其试验方法与评价 第二节 生殖发育毒性作用及其试验与评价 第三节 致癌作用及其试验方法与评价
第一节 致突变作用及其试验与评价方法
一、 基本概念
二、突变类型
三、突变的发生与修复机制
四、致突变试验与致突变作用评价
遗传学基础
1．DNA与基因
DNA由脱氧核糖、磷酸及碱 基组成，基本成分为四种核
公式
染色体组
二倍体
三倍体 四倍体 非整倍体 单体
2n
3n 4n
(ABCD) (ABCD)
(ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD)
2n-1
(ABCD) (ABC)
三体
四体 双三体 缺体
2n+1
2n+2 2n+1+1 2n-2
(ABCD) (ABCD) (A)
体来发现。
（1）染色体结构异常
有些畸变是稳定的，可通过重复细胞分裂传给子代。这些
畸变如缺失、倒位、重复及平衡易位等，多数为染色体重排，
可在机体或细胞群传递。
容易观察到的畸变有染色单体断裂、染色 体断裂、无中心粒片段、染色单体交换、 双中心粒染色体、环状染色体及某些相互 易位。
插 入
辐 射 体
(insertion) (duplication)
10、程序外DNA合成实验 11、精子畸形试验 12、小鼠特异基因座试验
5、微核试验
6、姐妹染色单体交换试验
致突变试验组合的原则 一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。
如细菌回复突变试验、微核试验、染色体畸变分析
和姐妹染色单体交换试验，这一组试验包括主要类
型遗传学终点。 体内试验与体外试验配合。一般体内试验和体外试 验各有其优缺点，应取长补短，综合考虑。 配套实验应包括多种进化程度不同的物种。如原核
Ames试验标准试验菌株有四种：TA97和TA98检 测移码突变， TA100检测碱基置换突变， TA102对
醛、过氧化物和DNA交联剂较敏感。
这四个试验菌株除了含有 his- 突变，还有一些附
加突变，检测时提高试验敏感性。
Ames 试验的方法有平板掺入法，点试法及预培 养法等。
突变型试验菌株可被各种诱变因素诱导，回复突变
①碱基置换 指DNA序列上的某个碱基被其他碱基取代。首
先在DNA复制时会使互补链的相应位点配上一个
错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的
碱基在下一次DNA复制时却能按正常规律配对，
于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即 最终产生碱基对置换或简称碱基置换。
②移码突变
移码是DNA中增加或减少了一对或几对不等于3 的倍数的碱基对所造成的突变。
染色体缺失,如果蝇的缺刻翅
染色体重复,如果蝇的棒状眼
染色体易位, 如夜来香的变异
染色体倒位
①裂隙（gap）和断裂（break）
在染色体上出现无染色质的区域，但该区域两端的
染色体仍保持线状连接者为裂隙。 指染色体上 狭窄的非染色带，
无线状连接者为
断裂。带宽超过
染色单体宽度。
②无着丝粒断片（fragment）、缺失（deletion）
细胞、低等和高等真核细胞，这样更加具有说服力。
1、细菌回复突变试验
以营养缺陷的突变体菌株为试验系统，观察受 试物引起其回复突变的作用。
试验菌株：
鼠伤寒沙门氏菌——Ames试验
大肠杆菌——大肠杆菌回复试验
Ames试验原理：
检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营
养缺陷型突变株 (his-) 回复突变成野生型 (his+)
⑥易位（translocation）
两个非同源染色体断裂后，从某个染色体断下的 节段接到另一染色体上称为易位。
（2） 染色体数目异常
整倍性畸变：单、三、四、多倍体
非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条或多多条或 少多条 2n-1,2n-2,… 2n+1,2n+2,…
染色体数目异常的基本类型
类型
整倍体 单倍体 n (ABCD)
苷酸，形成双螺旋结构。
基因（gene）：DNA分子中最小的完整功 能单位，是生物遗传信息的携带者
基因组（genome）：细胞或生物体的一套 完整单体的遗传物质
2、染色质与染色体
在间期细胞的细胞核中，通 过光镜可见一种能被碱性染料着 色的物质，即染色质。
它由DNA、组蛋白、非组蛋 白及少量的RNA组成，形似串珠 状的复合体。
在间期细胞核中，一般没有 染色体结构，只有在细胞分 裂时，染色质才螺旋化并折 叠成染色体，故染色质与染 色体是由相同物质组成的；
染色体存在于细胞中，通常
只有在细胞分裂时经过特殊 染色才能清楚地看到。
染色体与基因有着平行的关系
①染色体可以在显微镜下看到。
②染色体成对存在，基因也成对存 在。 ③个体中成对的基因一个来自母本， 另一个来自父本。
(ABCD) (ABCD) (AA) (ABCD) (ABCD) (AB) (ABC) (ABC)
注：A、B、C、D代表非同源染色体
三、突变的发生与修复机制
外源化学物引起
O6甲基鸟嘌呤修复 直接修复 光修复 核苷酸切除修复
基因突变和染色
体突变的靶部位 主要是 DNA ，而 导致染色体数目 异常的靶部位主 DNA修复
生。
遗传物质发生变化引起遗传信息的改变，并发生 新的表型效应称为突变。 自发突变 (spontaneous mutation)
是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下 发生的突变。 特点：自发突变的发生过程长，频率极低 , 与物种 的进化有关。
诱发突变 (induced mutation)
是指人为的造成突变 。它已被农、林、牧、渔业和 园艺学家利用来培育和选择新种或良种。 特点：发生过程短，频率高，既可被人类利用，也 可能对人类产生危害。
位。
⑤插入（insertion）和重复（duplication）
当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插 入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起 来，称为插入。 如果此时有缺失的染色体和插 入的染色体是同源染色体，且分别有一处断裂发生 于同一位点，则插入将使该染色体连续出现两段完 全相同的节段，此时称为重复。
质是相同的，其区别在于受损程度。
通常以光学显微镜的分辨率0.2 µ m来区 分基因突变和染色体畸变。 基因突变是用光学显微镜观察不到的，
须通过生长发育、生化、形态等表型改
变来判断，而染色体畸变可用光学显微 镜进行观察。
1. 基因突变
基因突变指基因中DNA序列的变化。 因基因突变限制在一特定的部位，故称为点突变。
不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致 突变物。
加S9混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致 突变物。
2. 哺乳动物细胞基因突变试验
④不同对基因形成配子时的分离与 不同对染色体在减数分裂期的分离， 都是独立分配的。
2009-6-30
3、基因型与表型
基因型指控制生物性状的基因组成，它是生物体的遗 传组成。基因型是性状发育的内因，是表型形成的根据。 表型指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体 表现。
外界环境是基因型转变成具体表型的必要条件。
成野生型(his+) ，即恢复了合成组氨酸的能力，可在此 平板上生长成可见菌落。
如果受试物处理组回变菌落数显著超过阴性对照组；
并有剂量反应关系，即可判定受试物为鼠伤寒沙门菌的 致突变物。
③环状染色体（ring chromosome） 染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒 的节段的两断端连接形成一个环时，称为环 状染色体。
④倒位（inversion） 当某一染色体发生两次 断裂后，其中间节段倒 转180再重接，称为 倒
观察化学毒物致突变作用一般通过致突变试验来
进行。主要目的：
①检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动
物和人的致癌性； ②检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒 性，预测其对人体的遗传危害性。
观察项目的选择
基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致 突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。 但是还有许多试验所观察到的现象并不直接反映基因
突变、染色体畸变和染色体分离异常，仅反映致突变
过程中发生的其他事件。将试验观察到的现象所反映 的各种事件统称为遗传学终点(genetic mdpoint)。
突变发生中的事件及遗传学终点的关系
细胞屏障 遗传毒物 正常DNA
DNA损伤
DNA修复过程 易错 修复 未修复的DNA 细胞分裂 损伤表达 断裂的DNA分子
二、突变类型
遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤： 基因突变
染色体畸变
端粒
着丝粒
姊 妹 染 色 单 体
端粒
染色体畸变 染色体的结构及数目改变。
组 蛋 白
基因突变 一个或几个DNA碱基对的改变。
碱基对
双 螺 旋
这些损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA
以外的靶组织受损所致。
基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本
4、细胞周期、有丝分裂与减数分裂
细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂
终了所经历的过程。
G0 ：DNA合成前期； G1 ：DNA合成期；
S：完成DNA复制；
G2：为有丝分裂做准备；
M：有丝分裂期
有丝分裂过程
有丝分裂指细胞核分 裂的过程，一个细胞 由此生成两个子细胞，
第八章
特殊毒性试验及其评价
第一节 致突变作用及其试验方法与评价 第二节 生殖发育毒性作用及其试验与评价 第三节 致癌作用及其试验方法与评价
第一节 致突变作用及其试验与评价方法
一、 基本概念
二、突变类型
三、突变的发生与修复机制
四、致突变试验与致突变作用评价
遗传学基础
1．DNA与基因
DNA由脱氧核糖、磷酸及碱 基组成，基本成分为四种核
公式
染色体组
二倍体
三倍体 四倍体 非整倍体 单体
2n
3n 4n
(ABCD) (ABCD)
(ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD)
2n-1
(ABCD) (ABC)
三体
四体 双三体 缺体
2n+1
2n+2 2n+1+1 2n-2
(ABCD) (ABCD) (A)
体来发现。
（1）染色体结构异常
有些畸变是稳定的，可通过重复细胞分裂传给子代。这些
畸变如缺失、倒位、重复及平衡易位等，多数为染色体重排，
可在机体或细胞群传递。
容易观察到的畸变有染色单体断裂、染色 体断裂、无中心粒片段、染色单体交换、 双中心粒染色体、环状染色体及某些相互 易位。
插 入
辐 射 体
(insertion) (duplication)
10、程序外DNA合成实验 11、精子畸形试验 12、小鼠特异基因座试验
5、微核试验
6、姐妹染色单体交换试验
致突变试验组合的原则 一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。
如细菌回复突变试验、微核试验、染色体畸变分析
和姐妹染色单体交换试验，这一组试验包括主要类
型遗传学终点。 体内试验与体外试验配合。一般体内试验和体外试 验各有其优缺点，应取长补短，综合考虑。 配套实验应包括多种进化程度不同的物种。如原核
Ames试验标准试验菌株有四种：TA97和TA98检 测移码突变， TA100检测碱基置换突变， TA102对
醛、过氧化物和DNA交联剂较敏感。
这四个试验菌株除了含有 his- 突变，还有一些附
加突变，检测时提高试验敏感性。
Ames 试验的方法有平板掺入法，点试法及预培 养法等。
突变型试验菌株可被各种诱变因素诱导，回复突变
①碱基置换 指DNA序列上的某个碱基被其他碱基取代。首
先在DNA复制时会使互补链的相应位点配上一个
错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的
碱基在下一次DNA复制时却能按正常规律配对，
于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即 最终产生碱基对置换或简称碱基置换。
②移码突变
移码是DNA中增加或减少了一对或几对不等于3 的倍数的碱基对所造成的突变。
染色体缺失,如果蝇的缺刻翅
染色体重复,如果蝇的棒状眼
染色体易位, 如夜来香的变异
染色体倒位
①裂隙（gap）和断裂（break）
在染色体上出现无染色质的区域，但该区域两端的
染色体仍保持线状连接者为裂隙。 指染色体上 狭窄的非染色带，
无线状连接者为
断裂。带宽超过
染色单体宽度。
②无着丝粒断片（fragment）、缺失（deletion）
细胞、低等和高等真核细胞，这样更加具有说服力。
1、细菌回复突变试验
以营养缺陷的突变体菌株为试验系统，观察受 试物引起其回复突变的作用。
试验菌株：
鼠伤寒沙门氏菌——Ames试验
大肠杆菌——大肠杆菌回复试验
Ames试验原理：
检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营
养缺陷型突变株 (his-) 回复突变成野生型 (his+)
⑥易位（translocation）
两个非同源染色体断裂后，从某个染色体断下的 节段接到另一染色体上称为易位。
（2） 染色体数目异常
整倍性畸变：单、三、四、多倍体
非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条或多多条或 少多条 2n-1,2n-2,… 2n+1,2n+2,…
染色体数目异常的基本类型
类型
整倍体 单倍体 n (ABCD)
苷酸，形成双螺旋结构。
基因（gene）：DNA分子中最小的完整功 能单位，是生物遗传信息的携带者
基因组（genome）：细胞或生物体的一套 完整单体的遗传物质
2、染色质与染色体
在间期细胞的细胞核中，通 过光镜可见一种能被碱性染料着 色的物质，即染色质。
它由DNA、组蛋白、非组蛋 白及少量的RNA组成，形似串珠 状的复合体。
在间期细胞核中，一般没有 染色体结构，只有在细胞分 裂时，染色质才螺旋化并折 叠成染色体，故染色质与染 色体是由相同物质组成的；
染色体存在于细胞中，通常
只有在细胞分裂时经过特殊 染色才能清楚地看到。
染色体与基因有着平行的关系
①染色体可以在显微镜下看到。
②染色体成对存在，基因也成对存 在。 ③个体中成对的基因一个来自母本， 另一个来自父本。
(ABCD) (ABCD) (AA) (ABCD) (ABCD) (AB) (ABC) (ABC)
注：A、B、C、D代表非同源染色体
三、突变的发生与修复机制
外源化学物引起
O6甲基鸟嘌呤修复 直接修复 光修复 核苷酸切除修复
基因突变和染色
体突变的靶部位 主要是 DNA ，而 导致染色体数目 异常的靶部位主 DNA修复
生。
遗传物质发生变化引起遗传信息的改变，并发生 新的表型效应称为突变。 自发突变 (spontaneous mutation)
是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下 发生的突变。 特点：自发突变的发生过程长，频率极低 , 与物种 的进化有关。
诱发突变 (induced mutation)
是指人为的造成突变 。它已被农、林、牧、渔业和 园艺学家利用来培育和选择新种或良种。 特点：发生过程短，频率高，既可被人类利用，也 可能对人类产生危害。
位。
⑤插入（insertion）和重复（duplication）
当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插 入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起 来，称为插入。 如果此时有缺失的染色体和插 入的染色体是同源染色体，且分别有一处断裂发生 于同一位点，则插入将使该染色体连续出现两段完 全相同的节段，此时称为重复。
质是相同的，其区别在于受损程度。
通常以光学显微镜的分辨率0.2 µ m来区 分基因突变和染色体畸变。 基因突变是用光学显微镜观察不到的，
须通过生长发育、生化、形态等表型改
变来判断，而染色体畸变可用光学显微 镜进行观察。
1. 基因突变
基因突变指基因中DNA序列的变化。 因基因突变限制在一特定的部位，故称为点突变。
不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致 突变物。
加S9混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致 突变物。
2. 哺乳动物细胞基因突变试验
④不同对基因形成配子时的分离与 不同对染色体在减数分裂期的分离， 都是独立分配的。
2009-6-30
3、基因型与表型
基因型指控制生物性状的基因组成，它是生物体的遗 传组成。基因型是性状发育的内因，是表型形成的根据。 表型指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体 表现。
外界环境是基因型转变成具体表型的必要条件。
成野生型(his+) ，即恢复了合成组氨酸的能力，可在此 平板上生长成可见菌落。
如果受试物处理组回变菌落数显著超过阴性对照组；
并有剂量反应关系，即可判定受试物为鼠伤寒沙门菌的 致突变物。