全脑辐照后大鼠脑组织中髓鞘的变化特征

全脑辐照后大鼠脑组织中髓鞘的变化特征1石志革，包仕尧，田野苏州大学附属第二医院，苏州（215004）E-mail：dryetian@摘要：研究电离辐射后大脑组织脱髓鞘病变的发病过程。

SD大鼠受2、10或30Gy全脑照射后的1周以及1、3和6个月时，采用酶联免疫吸附法测量脑组织中髓鞘碱性蛋白(MBP)含量、用Luxol fast blue染色法和电镜观察并分析髓鞘的病理学改变。

结果表明2 、10与30 Gy照射后1周与1个月的各组大鼠，其端脑组织中MBP的含量与对照组相比均无明显差别，但10与30 Gy照射后3个月与6个月中MBP则有明显降低。

髓鞘染色显示30 Gy照射后6月大鼠在胼胝体区有较典型的脱髓鞘病变存在。

10~30 Gy照射后1~6个月各组在超微结构上也有不同程度的髓鞘异常。

病理学变化的严重程度与剂量、观察时间有明显的相关性。

10~30 Gy照射后3~6个月的大鼠脑组织中从分子、组织形态和超微结构等方面可出现等一系列的髓鞘异常改变。

关键词：电离辐射，大脑，脱髓鞘，髓鞘碱性蛋白，大鼠以往的研究已经证明：晚期放射性脑损伤以脱髓鞘和白质坏死为病理特征，少突胶质细胞和血管内皮细胞是损伤发生的靶细胞[1-3]。

近年来，关于电离辐射对少突胶质细胞作用的研究大多集中在细胞和分子水平早期的改变方面，而对于这些分子、细胞变化与在病理组织学上发生脱髓鞘病变的相关性则不多[1,2.4,5]。

为此，笔者用髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)含量测量、髓鞘特异性染色以及超微结构观察等方法，就全脑照射后6个月之内大鼠脑组织中髓鞘的变化特征进行了研究，现将结果报告如下。

1. 材料和方法1.1实验动物的分组与全脑照射：健康成年SD大鼠，体重200 ± 15 g，苏州大学实验动物中心提供，随机分为全脑单次0、2、10和30 Gy照射、观察时间点为照射后1周、1月、3月和6个月的16个组别；其中0 Gy为对照组，受照射时被铅屏蔽，其它处理与照射组一致。

全脑照射用Philips SL-18型电子直线加速器产生的能量为4 MeV的电子线，剂量率是210~220 cGy/min，详细的投照与剂量确认方法见田野等的前文报告[6]。

1.2 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)MBP含量的测定：每组别中5只大鼠在规定时间点3.6%水合氯醛作腹腔麻醉后，用约250 ml肝素化生理盐水经升主动脉全身灌注，断头完整取脑。

随机切取其右或左侧约500 mg端脑组织，置于3倍体积缓冲液(0.5% Triton X-100 PBS，PH = 7.4)中，冰浴中充分匀浆，4℃低温离心15 min(10000 r/min)，取0.1 ml上清液。

用ELISA试剂盒（四川大学华西医学中心基础重组DNA 研究室出品）测定MBP的含量，结果以µg/ml为单位，具体步骤依据产品说明书进行。

1.3 髓鞘Luxol fast blue染色与分析：对上述每组3只大鼠另一侧大脑参照定位图谱冠状位切取3 mm厚的端脑组织块，放入4 %多聚甲醛液中固定，常规脱水、石蜡包埋后自头向尾方向进行连续切片（片厚为5 µｍ）。

取3片用Luxol fast blue法作髓鞘的特异性染色，主要试剂Luxol fast blue和Cresyl violet购于美国Sigma公司，具体步骤见[2,4]。

在光学显微镜下对胼胝体区已染色髓鞘组织进行病理学定性检查，了解脱髓鞘病变程度。

另取切片行1本课题得到江苏省卫生厅重大科研课题资助项目(K200406)和苏州大学医学发展基金资助项目(EE123504)的资助。

HE染色，进行常规病理学检查。

1.4 电子显微镜髓鞘超微结构的观察：各组别中再取各2只大鼠在生理盐水全身灌注后，继以2%戊二醛PBS固定液250ml灌注，断头取脑，选取1 mm3体积的端脑组织先后在2%戊二醛和1%锇酸PBS液中各固定2小时，梯度酒精脱水，618包埋液与环氧丙烷浸透与包埋，LKBⅤ型超薄切片机制片，枸橼酸铅电子染色后，用透射电镜(Philip CM-120型) 来定性观察少突胶质细胞及其轴突髓鞘超微结构的变化。

1.5 实验结果的处理：各组MBP含量以x ± s表示；采用单因素方差分析，先对4个时间观察点0 Gy对照组的数据进行比较，再将2、10和30 Gy照射后1周、1月、3月和6个月的各组与其相应的对照组作比较；不同剂量与不同观察时间组的组间比较用双尾t检验；P < 0.05表示差异有统计学意义。

2. 结果2.1 照射后一般状态的观察：本实验一共使用了95只大鼠，其中7只在麻醉后未醒，8只在被观察的1~4个月时不明原因死亡，其中0 Gy对照组死3只，所有死亡大鼠均被剔除。

各组大鼠在实验观察期间的体重增长、活动能力无明显差别；30Gy组大鼠照射后约1个月出现照射野脱毛、皮肤充血与肿胀，在2~3个月时逐步恢复。

2.2 脑组织中MBP的含量：不同剂量全脑照射后不同时间点大鼠脑组织中MBP含量ELISA检测的结果见表1所示。

MBP含量在不同时间点的4个对照组之间没有差异，约为78~82 µg/ml；2 Gy照射后1周至6个月间4个实验组与其对应的对照组以及它们彼此之间相比较，也无明显变动。

剂量升高到10和30 Gy时，照射后1周和1月时MBP的含量正常，但在照射后3个月与6个月时，大鼠端脑组织中MBP降低至50~63 µg/ml 的水平，明显低于对照组与2 Gy照射组（P < 0.01），其中30 Gy组又低于10 Gy组（P < 0.05），说明剂量越高MBP下降越明显。

同时还发现：10和30 Gy照射后3至6个月组MBP含量明显低于同剂量照射后1周与1月的2个组（P < 0.01），但3个月与6个月组间无显著差异，说明MBP降低有一定的时限性。

x±s, n = 5)Table 1 The MBP content of irradiated rat telencephalon tissue (µg/ml,IrradiationAfter 1 week After 1month After 3month After 6monthDose0 Gy 78.0 ± 0.5 79.8 ± 0.6 82.1 ± 0.5 78.9 ± 0.52 Gy 84.1 ± 0.3 81.2 ± 0.4 85.7 ± 0.6 76.8 ± 0.410 Gy 83.2 ± 0.6 78.8 ± 0.3 62.8 ± 0.3 * $55.6 ± 0.5 * $30 Gy 79.9 ± 0.8 83.7 ± 0.6 55.3 ± 0.6 * # $50.3 ± 0.3 * # $* Compare group 0 Gy with 2 Gy at the same time-point，P < 0.01；Compare with group 10 Gy at the same time-point, P < 0.05；$ Compare 1week with 1 month after the same irradiation dose，P < 0.01。

2.3 髓鞘的组织病理学分析：对照组、2 Gy、10 Gy及30 Gy照射后1周、1月与3个月的15个组别，大鼠大脑组织在Luxol fast blue染色后，胼胝体区的髓鞘纤维与纤维间串珠样排列的少突胶质细胞在形态、结构完整性与染色致密程度等方面没有发现明显的不同，30 Gy 照射后1周大鼠的切片见图1所示。

但在30 Gy照射后6月组的大鼠，胼胝体区出现了较典型的脱髓鞘病变（见图2），主要表现为：髓鞘纤维有较大面积的染色变浅、间距稀疏、不均匀与大量空泡的存在，少突胶质细胞数目减少、排列不齐、结构不完整。

Fig.1 Compact myelin sheath and string-of-beads oligodendrocyte in corpus callosum of the rat with 30 Gy at 1 week time-point using Luxol fast blue staining. (200 magnification)Fig.2 Raritas and vacuolar degeneration myelin sheath and string-of-beads oligodendrocyte in corpus callosum of the rat with 30 Gy at 6 months time-point using Luxol fast blue staining. (200 magnification)2.4 病理学常规检查的结果：对大脑海马、胼胝体与临近皮层下区进行观察，发现除了对照与2 Gy照射各组无明显异常外，10 Gy照射后1至6个月与30 Gy照射后各组中有较典型的放射性损伤变化。

30 Gy照射后1至6个月的3组中，有程度不一的白质坏死性病灶存在，胶质细胞有数量增加、体积增大、聚集分布形成小结；血管管腔扩张、周隙扩大、内皮细胞肥大，间质组织水肿、组织疏松，淋巴细胞围管性浸润较为常见；海马区神经元变性也较明显，表现为部分神经元细胞固缩、核浓缩、核仁模糊。

随着照射剂量的加大、观测时间的延长，各组织成份的损伤有逐步加重的趋势。

2.5 电镜下髓鞘超微结构的变化特征：与病理学检查结果相似，透射电镜下髓鞘的超微结构在对照与2 Gy照射各组无明显变化，6个月对照组的髓鞘结构见图3所示，髓鞘螺旋包绕轴索，其板层排列致密、均匀且连续。

但10和30 Gy照射后1至6月的各组中可见：髓鞘的扭曲变形、板层松解、染色变浅，有髓纤维变形、分层与断裂、减少，少突胶质细胞数目减少、胞质内细胞器减少、线粒体肿胀、嵴消失。

脱髓鞘病变的严重程度与照射剂量的大小和观测时间的长短有相关性，图4为30 Gy照射后6个月大鼠的电镜图像。

Fig.3 Control group: Compact and continuous myelin sheath layers of the rat cranial nerves with 30 Gy at 6months with electron microscope.Fig.4 Loose myelin sheath layers and demyelination of the rat cranial nerves with 30 Gy at 6 months withelectron microscope.3. 讨论放射治疗是大脑与头颈部肿瘤主要的、有时是唯一有效的手段，但长期存活患者可因治疗后遗症而使生活质量降低，其中以放射性脑、脊髓损伤的病情最为严重，且无有效的早期诊治措施。