9血清学反应讲述
血清学反应
同种异型抗体
抗人免疫球蛋白
间接Coombs试验
双功能抗体
自身红细胞凝集试验（一）
双功能抗体抗 原交联物
自身红细胞凝集试验（二）
第三节 沉淀反应
一、液相沉淀反应 二、凝胶内沉淀反应
液相沉淀反应
1、絮状试验 2、环状试验 3、免疫浊度测定
液相内沉淀反应
絮状沉淀反应
环状沉淀反应
单向扩散试验
医学全在线网站
T1 T2 T3
Mancini曲线
T1 T2 T3
Fahey曲线
Mancini曲线：K=C/d2 适用于大分子抗原，长时间扩散
Fahey曲线：K=logC/d 适用于小分子抗原，短时间扩散
单向扩散试验的适用对象
有特异性单价抗血清 有已知含量的标准品 待检标本抗原蛋白质含量大于1.25g
抗血清 抗原
+—
抗原 抗体
+
—
微量免疫沉淀测定
1、方法：免疫透射浊度测定法 免疫速率散射浊度测定法
2、原理：
散射光
入射光
透射光
检测器 检测器
凝胶内沉淀反应
1、扩散试验 2、免疫电泳技术
免疫扩散技术 单向扩散试验 双向扩散试验
免疫电泳技术 火箭电泳 对流电泳 免疫电泳
扩散试验
单向扩散试验 双向扩散试验
（ml）1
2
3
4
CH50示意
补体结合试验
1、补体结合试验原理 2、补体结合试验应用
补体结合试验原理
待检系统
补体
指示系统
补体结合试验原理（结果阳性）
补体消耗
待检系统
指示系统（不溶血）
补体结合试验原理（结果阴性）
免疫学实验-血清学反应
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实验内容
直接凝集试验
双向扩散试验 补体溶血试验 观看细胞免疫的示教片
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教材P299
• 一、直接凝集试验——试管法（1份/人）
• 试管法凝集试验是一种半定量的试验方法，是在 试管内将抗原或抗体稀释不同倍数后加入等量的 待检抗体或抗原，根据每管内的凝集程度，判定 待检样品中相应抗原或抗体的有无及其效价。 • 试验中可能由于电解质浓度或pH 值不适宜等原 因，而引起抗原非特异性凝集，出现假阳性反应 ，所以应设立阴性对照管。
19
血型鉴定
20
（2）间接凝集反应（3）间接凝集抑制试验
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（二）沉淀反应
• 1、概念：可溶性抗原+抗体→沉淀现象。
• 可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、 菌体裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、组 织浸出液等）与相应的抗体结合，在适量电 解质存在下，形成肉眼可见的细微的白色沉 淀。
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2、分类 （1）液相中的沉淀反应： 环状沉淀、絮状沉淀 （2）凝胶扩散： ①单向扩散：
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静电引力 （electrostatic forces） 范德华引力:作用最小 （van der Waals interactions） 氢键:最具特异性 （hydrogen bond ） 疏水作用力:作用最大 （hydrophobic interactions）
2、可逆性：抗原与抗体的结合是非共价键 结合，在一定条件下又可解离为游离状态， 反应具有可逆性。
此时自第一管至第七管血清的稀释倍数分别是1:10， 1:20，1:40……1:320，具体稀释方法可参阅下图。 42
血清０.１ml
０ .５
０ .５
０ .５
０ .５
０ .５
第九章血清学试验
第九章血清学试验§9-1血清学试验概述一、血清学试验的概念概念：抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。
因抗体主要存在于血清中，所以将体外发生的抗原抗体结合反应称为血清学反应或血清学试验。
在体内发生的抗原抗体反应是体液免疫应答的效应作用。
二、血清学试验的特点（一）特异性和交叉性（二）敏感性（三）可逆性（四）反应的二阶段性（五）最适比例与带现象（六）用已知测未知三、影响血清学试验的因素（一）电解质常用0.85%～0.9%（人、畜）或8%～10%（禽）的氯化钠或各种缓冲液（免疫标记技术）作为抗原和抗体的稀释液或反应液。
（二）温度在一定温度范围内，温度越高，加速抗原抗体结合和反应现象的出现。
（三）酸碱度血清学试验要求在一定的pH下进行，常用的pH值为6～8，（四）振荡适当的机械振荡能加速抗原抗体的结合反应（五）杂质和异物每批血清学试验都应设阳性对照和阴性对照试验。
四、血清学试验的应用及发展趋向（一）血清学试验的应用传染病、寄生虫病、肿瘤、自身免疫病、变态反应性疾病的确诊。
在动物疫病的群体检疫、疫苗免疫效果监测和流行病学调查。
生物活性物质的超微定量、物种及微生物鉴定和分型等方面。
基因分离，克隆筛选，表达产物的定性、定量分析和纯化等，已经成为现代分子生物学研究的重要手段。
（二）血清学试验的发展趋向反应的微量化和自动化方法的标准化和试剂的商品化技术的敏感特异和精密化检测技术的系列化方法简便快速。
§9-2凝集试验一、凝集试验的概念凝集试验：细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在红细胞、乳胶等颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，经过一定时间，复合物互相凝聚形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验（Agglutination test）。
参与凝集试验的抗原称凝集原，抗体称凝集素。
二、凝集试验的类型（一）直接凝集试验(Direct agglutination test)颗粒性抗原与相应抗体直接结合并出现凝集现象的试验称直接凝集试验。
09第九章 诊断制剂(兽医生物制品学)
特异性检测：以新制菌素与标准菌素，对10匹健康马作点眼试验， 用量为2~3滴，5匹马左眼点标准菌素，右眼点新制菌素，另5匹马相反， 点眼后3、6、9、24h检查，全部试验马对两种菌素须均无反应。
阳性血清的 各种稀释度
1:10 1:25 1:50 1:75 1:100
1:10
0 0 10 20 40
抗原稀释度
1:50 1:100 1:150 1:200 1:300 1:400 1:500
补 体 结 合 反 应 结 果（溶 血，%）
0
0
0
0
10
20
40
0
0
0
0
10
30
60
0
0
0
10 20
40
60
第九章 诊断制剂
利用微生物、微生物提取物或动物血清等材料制成的，用于传染病、 寄生虫病血清学和变态反诊断应用的制品，称为诊断用生物制剂 (diagnosticum)，也称为诊断液。主要包括诊断抗原、诊断抗体(血清)和标 记抗体等三大类。
诊断生物制剂用于诊断的原理，是基于抗原和抗体能特异性结合这一 基本特性，故诊断中可以用已知抗原检测未知抗体，或用已知抗体检测未 知抗原。
(2)制造要点
将种子菌液接种肝汤琼脂培养基上37C培养2～7天,或液体通气培养36h，用 0.5%石炭酸生理盐水洗下培养物，70～80C水浴中加热灭菌lh，离心去上清， 菌体悬浮于0.5%石炭酸生理盐水，再离心沉淀洗一次。菌体悬浮于0.5%硫酸水 溶液中，121C加热30～40min，促使菌体水解。室温或冰箱放置12～24h，吸 取上清液，用NaOH液调整为pH6.8～7.0，再静置沉淀未水解部分。上清液用蔡 氏滤器过滤后75～80C加温热，凯氏法测定总氮量(用标准水解素作对照)，用灭 菌蒸馏水稀释滤液，使其最终总氮量为0.4～0.5mg/ml(或与标准的水解素相同)。
血清学反应-沉淀反应
二 凝胶内沉淀实验
（一）免疫琼脂实验(Immunodiffusion test）
原理：抗原抗体在电解质存在的条件下，再合适的比例 处形成白色沉淀线，并且一种抗原抗体系统形成一种沉淀 线，另一种形成另一种沉淀线，互相不影响。 优点：能将复合的抗原成分加以区分，根据沉淀线的数 目，位置，以及相邻两条沉淀线之间的融交分支等情况即 可了解该复合抗原的组成。并且可以将沉淀线用特殊染色 法（蛋白质、多糖、之类的鉴定染色），生物活性(酶活 性)和同位素标记法鉴定抗原的成分。 实验类型：
（3） 对流免疫电泳 对流免疫电泳是双向扩散与 电泳技术相结合的一种方法。在PH8~8.6的缓冲溶 8-21火箭免疫电泳 液中，蛋白质抗原带负电，向阳极移动。抗体虽然 也是蛋白质，但等电点比抗原高，所带阴离子少且 分子质量大，移动缓慢，同电渗反而向阴极移动。 实验时，将免疫血清置琼脂板正极孔内。通电后， 在电场作用下，抗原向正极移动，抗体向负极移动， 在最适比例处相遇时即形成白色沉淀。由于电场作 用，既限制了抗原抗体向多方向扩散，有加速了泳 动速度，缩短了时间。 优点：时间短，灵敏度高。 缺点：特异性不如双扩散高。如图8-20 8-20对流免疫电泳
抗原
抗体
单向单扩散
2.单向双扩散 用内径8mm的试管，现将含有阳 性血清的琼脂加于管底，高约6mm， 中间加一层同样浓度的琼脂，先凝固 后加待测0.25ml抗原，37°或室温扩 散数日。抗原抗体在中间琼脂层相向 扩散，在平衡点上形成沉淀线。
单向双扩散
3. 双向双扩散
试验在玻璃板或平皿上进行,用1.6％~2.0％琼脂加一定 浓度的等量抗体浇成凝胶板厚度为2~3mm在其上打孔直 径为2mm，孔内滴加抗原液。抗原在孔内向四周辐射扩 散，在与凝胶中的抗体接触形成白环。此环随扩散时间 而增大。因此可用已知浓度的抗原制成标准曲线，即可 用以测定抗原的量。 此法在兽医临床已用于传染病的诊断：如马立克氏病的 诊断。将马立克氏病高免血清制成血琼脂平板，拔取病 鸡新换的有髓质的羽毛数根，将毛根剪下，插于血琼脂 平板，阳性者毛囊中病毒向四周扩散，形成白色沉淀环。
血清学反应
四、中和实验
病毒或毒素与相应Ig以一定比例混合后， 经过一定时间，病毒丧失对易感动物的致 病性，或消除毒素在试管内的溶血现象， 谓之中和反应。
该试验既可在体外进行，也可在体内进行， 可利用小动物、鸡胚、活细胞等作试验。 操作如下：
五、免疫荧光法
荧光素：如异硫氰酸荧光素（FITC）、丽 丝胺罗丹明B（RB200）等受紫外线照射 后可发荧光（FITC 为绿色，RB200为玫 瑰红色）。
补体结合反应的概念
➢ 补体结合反应（简称补反CFT）： 是指在补体参加下，以绵羊红细
胞（Ag）和抗绵羊溶血素（Ig）作为 指示系统的抗原抗体反应。
补体结合反应的原理
补反包括两个系统五种成分：
• 一是被检系统（溶菌系）中的 已知Ag、待检Ig及仅供一组 Ag-Ig系统反应的定量补体。
• 二是指示系统（溶血系）中的 红细胞和溶血素。
• 参与凝集反应的Ag称凝集原，Ig称凝集素。
• 平板法和试管法
2、间接凝集反应
• 先将可溶性Ag或Ig吸附于一种与免疫无关 的有一定大小的颗粒载体表面制成固相Ag 或Ig，再与相应的待检Ig或Ag结合产生的 反应。 分为两类： 间接血球凝集反应（HA） 间接血球凝集抑制反（HI）
• 间接血球凝集反应（HA）• 间接血球凝集抑制反（HI）
补体的特点
1、补体是酶类物质，但均以无活性的前体形 式存在于血清中
2、动物血清中尤其以豚鼠血清含量最高，故 多用豚鼠的新鲜血清作为补体的来源
3、补体性质不稳定，易失活，经56度30分 处理即灭活
4、补体本身没有特异性能与任 何一组抗原抗体复合物相结 合，一但结合后不再游离。
5、补体不与单独的抗原或单独 的抗体相结合。
血清学反应
血清学反应血清学反应介绍：血清学反应(serologic reactions)是指相应的抗原和抗体在体外进行的结合反应。
由于抗体主要存在于血清中，进行这类反应时一般都要用含有抗体的血清作为实验材料，所以把体外的抗原、抗体反应称为血清学反应。
这类反应是根据抗原、抗体具有高度特异性的原理来进行实验的，即用已知的一方来检测另一方的存在。
既可定性，又可定量。
可用已知抗体来检测未知抗原，如鉴定病原微生物;也可用已知抗原来检测未知抗体，如协助诊断某种疾病。
血清学反应正常值：异常结果：(1)抗原与抗体结合时没有交叉反应。
(2)解离后的抗原、抗体性质不变。
(3)没有未结合的抗原或抗体游离于上清液中。
血清学反应临床意义：异常结果：(1)抗原与抗体的结合具有高度特异性，但当两种不同抗原分子上有共同抗原决定簇存在时，则与抗体结合时可出现交叉反应。
(2)抗原与抗体的结合是分子表面的结合。
两者的结合虽相当稳定，但是可逆的，在一定条件下可发生解离，解离后的抗原、抗体性质不变。
(3)抗原、抗体的结合按一定比例，只有在比例适当时才会出现可见反应。
若抗原、抗体比例不合适，就会有未结合的抗原或抗体游离于上清液中，不能形成大块免疫复合物，故不能呈现可见反应。
需要检查的人群：血液病患者，接触传染病感染源的人群。
血清学反应注意事项：不合宜人群：反复溶血。
检查前禁忌：避免服用氧化性药物，保持空腹抽血。
检查时要求：无特殊要求。
血清学反应检查过程：用末梢血主要有耳垂取血和指尖取血两个部位，婴儿可在脚后跟取血。
耳垂取血痛感较轻，但取血量较少，特别是耳垂较小的人比较难于取血。
指尖取血痛感较明显，但采血量较多，特别是对于血常规化验，可得到较为稳定的测定结果。
采血前应将皮肤清洗干净。
在冬季寒冷的室外进到室内后不要立即取血，应使身体暖和以后，特别是应使采血的耳垂和手暖和起来。
在采指血前不要用热水烫手，保持手指干燥，如指尖有伤口、甲沟炎、红肿或皮肤病应避开使用此手指。
血清病型反应的名词解释
血清病型反应的名词解释血清病型反应是指机体在接受过某种外源性抗体后对其产生的免疫反应。
这种反应在医学领域中具有重要意义，并经常涉及到诊断和治疗方面的考虑。
在了解血清病型反应的机制和特点之后，我们能更好地理解它在人体内的作用，以及在一些疾病条件下如何影响身体健康。
1. 血清病型反应的定义及机制血清病型反应是一种由非机体来源的抗体引起的过敏反应，即由外源性抗体与机体内的抗原结合而引发的免疫反应。
这些抗体通常来自血清或免疫血清制剂，如疫苗或治疗抗体制剂。
一旦这些抗体进入人体，它们可以结合到自身抗原上，形成免疫复合物，并触发炎症反应。
2. 血清病型反应的分类血清病型反应可分为急性和慢性两种类型。
急性血清病型反应通常发生在注射大剂量抗体后的数小时至数天内，临床表现为发热、关节疼痛、皮肤疹等症状。
慢性血清病型反应则是由长期低剂量抗体暴露引起，由于慢性炎症反应的存在，可导致器官损伤和功能障碍。
3. 血清病型反应的临床表现血清病型反应的临床表现因个体差异和病情严重程度而异。
常见症状包括疲乏、发热、关节疼痛、皮肤疹、肌肉痛等。
在严重病例中，血清病型反应可能导致血管炎、肾损害、神经炎等并发症。
4. 血清病型反应的诊断确诊血清病型反应通常需要综合临床表现、病史、实验室检查和影像学等综合评估。
关键的检测手段包括抗体水平测定、补体水平检测、免疫组织化学和免疫电镜等。
5. 血清病型反应的治疗和预防对于急性血清病型反应，主要治疗方法是对症处理，例如使用非甾体类抗炎药缓解症状。
对于慢性血清病型反应，治疗的重点在于控制炎症反应和器官损害。
预防血清病型反应的关键是减少外源性抗体的使用频率和剂量，以及加强监测和评估工作。
6. 血清病型反应的相关疾病血清病型反应在一些特定疾病中表现出高度的相关性。
例如，类风湿性关节炎患者可能出现长期大剂量非甾体类抗炎药的使用，这可能导致血清病型反应。
类肉芽肿性多动脉炎也与血清病型反应相关，因为该病患者常常接受免疫抑制剂治疗。
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1 ．单向单扩散
将 0.6%-1% 琼 脂 加 热 熔 化 后 ， 加 入 定 量 经 预热的稀释抗血清，混合均匀后，加入小试 管中，待凝固后加入0.5ml抗原于其上，直立， 置于37˚C中，2-3h后出现沉淀线。由于抗原 的扩散，使沉淀线不断向下推移，而最初形 成的沉淀带随抗原的扩散而向下推移，最后 稳定。沉淀带距抗原愈近，其浓度愈大，可 作抗原浓度测定。
第九章 血清学反应
第一节 概 述
一 血清学反应的概念及一般特点
抗原及相应抗体在体内或体外均能发生特
异性结合，在体外结合能发生可见免疫反应。
由于抗体主要存在于血清中，故称为血清学反
应。
血清学反应根据抗原性质、反应条件、参与
反应物质，则表现出反应有多种多样。其反应
的一般特点是：
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（一）特异性和交叉性
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（四）微生物的鉴定与分析
应用交叉凝集实验、凝集吸收实验、 沉淀实验等血清学实验，进行微生物的 鉴定及区别微生物的血清型，从而确定 微生物的类型及其亲缘关系。还可应用 琼脂扩散实验、免疫电泳等技术，对微 生物的抗原组分进行分析。
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（五）血型鉴定
用细胞直接凝集实验、血凝抑制实验、 溶血实验等技术，可作血型鉴定、亲子 关系的确定、新生儿和出生幼畜溶血病 的诊断。
血清学反应通常用pH6～8，过酸或过碱都 可使复合物离群，pH值在等电点时，可引 起非特异凝集。
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二 血清学反应的类型
沉淀、凝集、琼脂扩散、中和、补体 结合和免疫吸附试验等。
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三 血清学反应的应用方式和目的
抗原抗体反应是特异性的，在应用时必须 有一个是已知的，通过反应来鉴定另一个未 知的。例如鉴定某一病原微生物时，多用已 知抗体。诊断传染病时，对慢性病可用已知 的抗原检测未知的特异性抗体；诊断急性病 则用已知的抗体检测未知的抗原（病原）， 如炭疽病等。
血清学反应具有高度特异性。抗原只能与 相应抗体结合，而不能与其他抗体相结合。
生物体的组成是复杂的，包含有多种抗原 成分，在进化过程中形成不同的种类，有各 不相同的特异性抗原，在亲缘种系中往往含 有部分相同的抗原成分，能引起交叉反应。
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（二）结合的可逆性
抗原抗体结合是分子表面结合，这一结合 受理化因素的影响，当温度超过60˚C或pH 降至3以下时，则抗原抗体复合物又重新离 群。离群后的抗原、抗体，其理化性质、免 疫活性保留。
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二 琼脂扩散试验
琼脂是一种含有硫酸基的多糖，加热溶解于水， 冷却后凝固成凝胶，琼脂凝胶是一种多孔结构，其 孔径大小与琼脂含量有关，1%琼脂凝胶孔径为 85nm，能使许多可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。 当抗原与抗体在凝胶中的一定位置上相遇时，则两 者结合形成沉淀线。沉淀线的位置与抗原、抗体颗 粒的大小、浓度，沉淀线的数目和所含抗原组分有 关。琼脂扩散可分为单扩散（抗原或抗体中一种成 分扩散）和双扩散。
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比例不适合—不能完成第二步反应 —带现象
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（四）反应的阶段性
抗原与抗体进行结合，可分为两个阶段：
第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段，
反应快，几秒钟至几分钟即完成，但无可见
反应；
第二阶段为抗原与抗体的反应可见阶段，表
现为凝集、沉淀、补体结合等，反应进行较
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（一）抗原与抗体的快速检测
在诊断传染病、寄生虫病、变态反应、肿 瘤、自身免疫疾病时，均已广泛应用血清学 方法检查抗体或抗原（细菌、病毒）的存在， 作为诊断疾病的手段。现已应用的间接血凝 技术、对流电泳、标记抗体技术，均能快速、 简便的确诊抗原或抗体。
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（二）生物活性物质的超微定量
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一 液相沉淀试验
1．环状沉淀试验
原理：试管内，下层沉淀素与上层
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
沉淀原在液界面应形成白色沉淀环。
用途：检测皮毛中的炭疽
杆菌抗原（Ascoli试验）
2．絮状沉淀试验
抗原与抗体在试管内混合，在电解质的存在下抗
原抗体复合物可形成絮状凝聚物。此法多用于毒
素和抗毒素测定。
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慢，需几分钟或更久。第二阶段受电解质、
温度、pH值等影响。两个阶段在反应进行中
无严格界限。
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（五）影响反应的因素
1.电解质 血清学反应须在适当浓度的电解质参与下，
才出现可见反应。在凝集、沉淀反应操作时， 一般用生理盐水或8%—10%高渗盐水作稀 释，才出现较强反应。
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（三）最适比与带现象
抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现可见 反应。比例最适合，出现反应最快，反应产物 愈多。
如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的 聚合一开始时即达到饱和，形成小的复合物则 不能继续与相邻抗原、抗体结合，不出现可见 反应，谓之区带现象或带现象。为了避免血清 学反应的带现象，需要将抗原或抗体作适当的 稀释。
9
2.温度
温度升高，可增加抗原与抗体分子运动而碰 撞接触，加速反应的出现，故通常将抗原抗体 混合后，放置37˚C温箱或水浴箱中，保持一定 时间，促进反应。温度高，加速反应；温度低， 反应时间延长，但反应结合充分，故在补体结 合反应、免疫吸附实验中，采用低温放置过夜。
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3.酸碱度
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第二节 沉淀试验
可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在 下，形成肉眼可见的絮状白色沉淀，称之为沉淀试 验（Precipitationreaction test）。
0.85%Na
可溶性抗原 +免疫血清Cl 出现沉淀现象 (血清蛋白、病毒) （抗体） 比例适合 沉淀原 沉淀素 比例不适合 不出现沉淀现象
应用酶联免疫吸附实验、放射免疫等技术， 抗原抗体检测的敏感度均大为提高，已达到 能精确测出Pg的水平，其敏感度已大大超过 了常规的化学分析。此类技术已应用于测定 动物体内的激素、维生素、药物及其他病理 过程中的微量产物。
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（三）抗原或抗体在细胞与亚细胞水平的定 位
用荧光抗体、酶标抗体技术，可以检测病毒或细 菌在动物各种组织细胞中的分布。应用免疫酶组 化法及铁蛋白标记技术进行免疫电镜观察，可以 测定病毒在亚细胞水平的定位，也可测定淋巴细 胞表面免疫球蛋白及抗体的产生情况。据此可分 析传染病发生的机制及对免疫机理的探讨。