革兰氏染色和抗酸染色法汇总.
基本染色方法
基本染色方法更新时间：2005-12-20 浏览次数：37一、革兰染色本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。
染色结果将细菌分为革兰阳性（紫色）和革兰阴性（红色）两类。
原理：1、等电点学说。
2、化学学说。
3、通透性学说。
试剂1、结晶紫溶液A液：结晶紫2g95%乙醇20mlB液：草酸铵0.8g蒸馏水80ml需在用前24 h将A液，B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。
2、碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300ml将碘与碘化钾混合并研磨，加入少量水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解。
最后补足水量。
也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。
3、脱色液：95%乙醇4、复染液A：贮存液：沙黄 2.5g95%乙醇100mlB：应用液：A液10ml蒸馏水90ml(应用液也可用：石炭酸复红10ml加90ml蒸馏水）染色方法1、涂片经火焰固定，加结晶紫液染1min，清水冲去染液。
（用滤纸吸去玻片上水分）2、加碘液染1min，水洗。
（吸去水分）3、加脱色液，不时摇动约10～30秒，至无紫色脱落为止，水洗。
（吸去水分）4、加复染液，染30秒,水洗。
（吹干）5、镜检。
二、抗酸染色抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。
厚涂片时，须掌握染色时间。
如果背景过深，影响镜检。
（厚涂片的同时，涂薄片一张）。
原理分枝杆菌细胞壁含脂质较多其中主要成份为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与石炭酸复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用，因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到染色目的。
试剂1、萋纳石炭酸复红溶液碱性复红乙醇饱和溶液（碱性复红8克，溶于95%乙醇100亳升）碱性复红乙醇饱和溶液：10ml5%石炭酸溶液：90ml2、脱色剂：浓盐酸3ml95%乙醇97ml3、复染液（吕弗勒美蓝液）美蓝乙醇饱和溶液（美蓝0.3g，溶于95%乙醇30ml中）美蓝乙醇饱和溶液：30ml20%氢氧化钾：0.1ml蒸馏水：100ml染色方法1、涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。
微生物染色技术
简单染色法革兰氏染色法抗酸染色法死菌鉴别染色法芽孢染色法姬姆萨染色法细菌染色法活菌：美蓝或氧化三苯基四氮唑（TTC）染料：染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
前者赋予染料颜色特征，后者使染料能形成盐。
染料通过离子键、共价键或疏水作用实现染色常用的微生物细胞染料都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类：美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料；酸性复红、伊红及刚果红属于酸性染料。
碱性染料带正电荷酸性染料带负电荷。
微生物染色原理：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷；碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，易与细胞结合使其着色。
细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸），所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。
染色种类:简单染色：利用单一染料对菌体进行染色。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。
因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。
所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
操作步骤1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。
2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。
3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。
4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。
5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。
6．干燥7．镜检鉴别染色：使用两种以上的染料进行染色，以区分不同类群的细菌，如革兰氏染色。
革兰氏染色:原理：G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。
常见细菌染色及临床意义
类别：
革兰染色法 抗酸染色法
芽胞染色法 鞭毛染色法 特殊染色法 荚膜染色法 异染颗粒染色法等
革兰氏染色法（Gram Stain）
由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。
步骤：
结果:
涂片固定
阳性菌——紫色 阴性菌——红色
结晶紫初染
碘液媒染
95%乙醇脱色
番红复染
结晶紫初染１min
菌的大小、形态和排列。
染料：(1) 吕氏美蓝液；
(2) 稀释石碳酸复红液 。
方法： 结果：吕氏美蓝染色后菌体呈蓝色；
稀释石碳酸染色后菌体呈红色。
单染色方法
涂片
干燥
固定
镜检
水洗、吸干 染色 1 min
复染色法
特点：既可以观察细菌的形态结构，还可根据 染色反应及着色深浅鉴别细菌的种类，
故又称鉴别染色法。
细菌染色方法及临床意义
细菌染色法:
细菌染色意义
由于细菌个体微小，基本上无色透明，故将其用适 当染料染色观察，方能显示它的形态、大小、构造 及染色特性等，在细菌鉴别上有重要意义。
革兰染色是细菌学中使用最广泛的一种染色方法， 籍此染色法，可将所有细菌区分为两大类。
单染色法
特点：细菌为统一的单一颜色,可以观察细
Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells
革兰染色法的原理
目前尚未明了 三大学说
通透性学说 化学学说 等电点学说
通透性学说
G+细菌细胞壁致密,脂类含量低,蛋白含量高, 遇乙醇变性,通透性不强,已进入细胞内的结晶 紫不能透出,保留了紫色;
G-细菌细胞壁较疏松,脂类含量高,蛋白含量低, 遇乙醇脂类溶解,通透性加强,已进入细胞内的 结晶紫容易透出,被复红复染成红色.
细菌常用染色方法
细菌常用染色方法
细菌常用的染色方法包括：
1. 革兰氏染色法：根据细菌细胞壁的不同组成，将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
该方法使用革兰氏紫染料染色，然后使用碘酒处理和洗涤，最后用洋红染色，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
2. 厌氧杆菌染色法：用甲基蓝和碘溶液混合物染色，可以区分厌氧杆菌和其他菌种。
3. 浓缩染色法：用詹氏菲洛染料染色，然后用酒精淋洗和乙醚蒸发，最后用洋红染色。
这种方法可以观察到细菌的形态、结构等细节。
4. 封闭染色法：将细菌培养在带有染色剂的琼脂上，细菌会吸收染料并形成深色颗粒。
5. 微胞溶解染色法：将细菌培养在含有亚甲蓝的琼脂平板上，细菌会吸收染料并产生颜色。
6. 阴离子染色法：使用负电染料如酸性染料贾氏深蓝染色或卡尔巴查染色，细菌细胞呈现颜色。
这些染色方法可以帮助鉴定细菌的形态、结构和组成，辅助进行细菌分类和鉴定。
常用细菌染色技术
三、结果:
阳性菌——紫色
阴性菌——红色
固定 初染
媒染 脱色 复染 革兰氏阳性菌，用符号“G+”或“GP” （Gram’s Positive）表示。 革兰氏阴性菌，用符号“G¯”或“GN” （Gram’s Negative）表示。
四、影响因素
1.操作：
涂片的厚薄，不宜过厚 染色时间的把握，尤其是脱色时间，脱色不宜过度 固定过程不可用酒精灯直接加热，避免过热使菌体变性而影
二、步骤
标本处理
涂片固定
结晶紫初染
碘液媒染
乙醇脱色
复红复染
用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。 媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力， 即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。 不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不 能，脱色剂常用95％的酒精(ethanol)。 复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的 目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色 的细胞仍然保持初染的颜色，常用的复染液是番红。
革兰氏阴性杆菌例子 (大肠杆菌 x 1000)
抗酸染色法
一、原理
结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌，因其菌体
表面有一层类脂或脂质之皮膜不易着色，但一经着色后
酸或乙醇的作用亦是不容易把它脱色。利用这特性并以
增强的染色液予染色，然后再以酸及乙醇加以处理，使
其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色
常用细菌染色技术
细菌染色方法
燃料与细胞 结合而染色
细菌染色
活菌染色
死菌染色
正染色
负染色
细胞不染色 而背景染色
细菌的染色方法
细菌的染色方法细菌的染色方法主要有革兰氏染色,抗酸色法和特别染色法(包括英膜染色法,芽抱染色法, 鞭毛染色法)1.革兰氏染色法：1)器材:金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,结晶紫染液，革兰氏碘液，0.4 %复红乙醇液,接种环,泗精灯,载玻片等。
2)方法:先制片,接着染色。
(1 )结晶紫染液染色1分钟，水冲洗；(2 )革兰氏碘液色1分钟；水冲洗；(3 ) 0.4 %复红乙醇液染色3秒钟,水冲洗,吸纸吸干后镜检。
2.抗酸染色法：1)器材:卡介苗与大肠杆菌和葡萄球菌的混合菌液,石炭酸复红,3 %的盐酸酒精,碱性美兰染液,接种环,酒精灯,载玻片等。
2)先制片一,接着染色。
(1 )石炭酸复红染液先沸水浴1 0分钟，滴加2 一3滴掩盖菌膜染色5分钟,水冲洗；(2 )3 % 的盐酸酒精脱色3 0秒钟,水冲洗；(3 )碱性美兰复染3。
秒钟,水冲洗，吸水纸吸干后镜检.3.芽抱染色法：1)器材:破伤风杆菌厌氧培育物,5 %孔雀绿水溶液,0.5 %沙黄水溶液,载玻片,酒精灯等。
2)先制片,接着染色。
(1 )加孔雀绿染液2 — 3滴于小试管中，并使其与菌液混合匀称,然后将试竹放厂沸水浴的烧杯中，加热染色15分钟：(2 )涂片、固定：(3 )水冲洗,至到流出的水无绿色为止；(4)用0.5 %沙黄液复染2分钟，弃去多余的染液,吸水纸吸干镜检(此步骤不用水冲洗)。
4荚膜染色法：1)器材:肺炎球菌(小鼠腹腔液)，石炭酸复红,9 5 %的乙醇,2 0 %鞅酸水溶液,0.8 %孔雀绿水溶液。
2)方法:(1 )石炭酸复红染色1分钟，水冲洗：(2)95 %乙醇短暂脱色(几秒钟为宜)，水冲洗(3 ) 2 0 %糅酸溶液染色1 0分钟,水冲洗；(4 ) 0.8 %孔雀绿溶液染色1分钟，水冲洗,吸水纸吸干后镜检。
5.鞭毛染色法(镀银染色法)1)器材:变形杆菌新奇菌液,镀银染色法1液(糅酸5克，5 0%氯化铁2. 0ml, 1.5 %甲醛2. 0 ml, 1 %氢氧化钠1. 0 ml,蒸储水100 nd),糅银染色法2液(2 %硝酸银溶液,少量氨水) 2)方法：(1 )糅银染色1液染色5分钟,水冲洗；(2 )糅银染色法2液染色1分钟，水冲洗,吸纸吸干后镜检。
常用微生物染色方法
原理
一 通透性学说 二 等电点学说
三 化学学说
革兰氏阳性菌含有大量核糖 核酸镁盐，其可与结晶紫-碘 结合成大分子复合物，因而 不易被95％酒精脱色；而阴 性菌中此物质含量较少，因 而吸附染料量很少，分子量 也较小，故易被酒精脱色。
细菌涂片的制备
涂片：取一张洁净载玻片，用已灭菌的接种环取一环 生理盐水于玻片中央，再将接种环灭菌，取菌与生理 盐水磨匀，涂布成1cm×1cm大小区域的均匀薄膜，使 盐水磨成灰白色为宜，接种环灭菌后放回试管架。 干燥：涂片最好在室温下自然干燥或将标本片涂抹面 向上，置酒精灯火焰上半尺高处慢慢烘干。 固定：常用火焰加热法，手执载玻片一端，标本面向 上，迅速来回通过火焰三次。
操作步骤 1、涂片经火焰固定，加石碳酸复红溶液用火 焰微热至出现蒸气约3分钟（防止染液蒸发干， 必要时可续加第一液数滴，水洗。 2、用3%盐酸酒精脱色约1分钟，直至涂片无色 或淡粉红色为止，水洗 3、再加复染液复染1分钟，水洗，干后镜检。 结果判断 抗酸杆菌呈红色，其他细菌及细胞 呈蓝色。
注意事项 1．抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加 标本涂片的厚度，发提高检出率。染厚涂片时， 须掌握复染时间，如果背景过深，会影响镜检。 痰标本找抗酸杆菌，应先高压杀菌，避免实验室 污染。 2．尿、粪中找到抗酸杆菌须作潘氏染色，排除 耻后杆菌，才能报告。 标本中找到抗酸杆菌，须作传染病报告。 3．离心应为3000转/分，30分钟。 4．涂片至少保留三个月。
注意点
⒈取菌量不可太多，涂片应均匀，否则影响染色结果 ⒉干燥时切忌高热，以免细菌变形 ⒊固定时温度不可过高时间不可长，以防涂抹面 烧焦及玻片烧裂
固定的目的
杀死细菌，使菌体蛋白凝固，染料易于着色 改变细菌通透性，以利于染料进入细胞内 使菌体与玻片粘附牢固，在染色时不致被染 料和水冲掉
兽医微生物学诊断方法
兽医微生物学诊断方法兽医微生物学是研究动物体内和外界的微生物，尤其是病原微生物对动物健康和疾病产生的影响的学科。
在兽医微生物学中，诊断方法是十分重要的，它们可以帮助兽医师快速准确地确定病原微生物的存在和类型，从而制定适当的治疗方案。
直接检查主要是通过观察和分离动物体内或分泌物中的微生物来确定病原微生物的存在。
其中最常用的方法是细菌的染色和培养。
细菌的染色是通过染色剂将微生物着色，然后在显微镜下观察颜色的变化来判断微生物的种类和数量。
常用的染色方法有革兰氏染色法和抗酸染色法。
革兰氏染色法可以将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，从而帮助兽医师确定细菌的种类；抗酸染色法可以检测酸性杆菌，如结核杆菌。
细菌的培养是将动物体内或分泌物中的微生物放入含有适当营养物质的培养基中，利用适当的培养条件（如温度、湿度等）进行培养，从而使微生物增殖。
通过观察培养基上的生长情况和形态特征，可以确定微生物的种类和数量。
同时，还可以通过培养基上的一系列生化试验来进一步确定微生物的特征，如氧需求情况、代谢能力等。
间接检查主要是通过检测动物体内或分泌物中的免疫反应来推断微生物的存在。
常用的方法有免疫学检测和分子生物学检测。
免疫学检测是利用抗原与抗体之间的特异性反应来确定微生物的存在。
通过收集动物血清或分泌物，将其与已知的微生物抗原反应，观察是否产生特异性抗体。
常用的免疫学检测方法有免疫沉淀、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等。
免疫沉淀可以通过观察血清与抗原之间的沉淀反应来确定微生物的存在；ELISA可以通过观察染色反应的强度来判断抗体的浓度，从而推断微生物的存在与否；免疫荧光可以通过观察染色反应的光亮程度和分布情况来判断微生物的存在。
分子生物学检测是通过检测微生物体内的核酸来确定微生物的存在。
常用的方法有PCR、实时荧光定量PCR和DNA测序。
PCR可以在体外扩增微生物体内的核酸，通过观察扩增产物的带型来判断微生物的存在；实时荧光定量PCR可以准确测量扩增产物的数量，从而推断微生物的存在量；DNA测序可以通过对扩增产物进行测序，从而确定微生物的种类和亲缘关系。
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【方法】
1．涂膜
痰的涂片：用灭菌的接种环采取痰中干酪
坏死的小块或带血的痰液，在载玻片上涂
成薄而均匀的膜（在烧接种环时为防止痰
中的细菌溅出，可先将接种环在内焰烧干，
然后再于外焰中灭菌）。
2．染色
（1）在已固定好的涂片上放置滤纸片（滤纸的作用是 滤去染液中的沉渣，使标本清晰），滴加石炭酸变红染色 液于滤纸片上（应滴满滤纸片）。 （2）将加有染液的涂片加温，在火焰上保持一定的高 度，直到出现蒸汽（不得沸腾）如此反复2—3次（约5分 钟）。在加温过程中防止将染液烘干（应及时添加染液）。 （3）去掉滤纸片，使涂片冷却，水洗。
精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核
杆菌及其它分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸
菌和细胞杂质等呈蓝色。
【材料】
①结核病人的咳痰液：采取清晨第一口粘 痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。 ②石炭酸复红染色液，3%盐酸酒精，碱性 美蓝染液 ③生理盐水
④载物玻片，滤纸片、接种环、玻片夹、 酒精灯、蜡笔等
微生物学两大经典染色： 革兰氏染色法 抗酸染色法
革兰染色法
革兰氏染色法是1884年由丹麦病 理学家汉斯· 克里斯蒂安· 革兰 （Hans Christain Gran ）创立的。
实验目的和要求
1. 掌握革兰氏染色方法的操作步骤及 注意事项。 2. 了解革兰氏染色的临床意义。
一、实验原理 二、实验器材 三、操作步骤 四、注意事项 五、革兰染色的临床意义
四、注意事项
1、注意涂片不宜过于浓厚。 2、火焰固定温度要适宜。 3、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如 脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳 性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多 少等因素的影响，难以严格规定。 4、染色过程中应吸去玻片上的残水，以免染色 液被稀释而影响染色效果。 5、选择幼龄的细菌。G+菌培养12-16h，E.coli 培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使 G+菌转呈阴性反应。
（4）用3%盐酸酒精脱色，直到流下的脱色剂无色为
止，水洗。 （5）用碱性美蓝染液复染30秒，水洗、干燥、镜检。
【结果观察】 1.结核杆菌染成红色，细长，直的或为微 弯曲，有的可表现出分枝特征，偶而有着 色不匀，成颗粒状者。亦可以见到有纵行 条索状排列。标本的其余部分及非抗酸性 细菌染成蓝色。必须逐一观察各个视野， 直待全部涂片找不到结核杆菌时，才可报 告阴性。
2.涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要
每ml痰液内含菌量至少应有500个以上， 甚至需达到5万以上。故材料多进行浓缩集 菌处理，以提高检出阳性率，也造成在染 色标本片观察中，不一定每个视野都能看 到结核杆菌。
3.结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临
床治疗后标本材料中，结核杆菌往往菌体断 裂，或形成非抗酸性革兰氏阳性的短杆状、 球状颗粒，亦称Much颗粒。 4.标本经高压灭菌处理，不影响染色结果， 也保证操作者的安全。
一、实验原理
（一）基本步骤：
1、初染：草酸胺结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色 4、复染：石炭酸复红复染
（二）原理：
细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它 们细胞壁的成分和结构不同而造成的。 初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝 紫色。 碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结 晶紫—碘的复合物，增强染料与细菌的 结合力。
当用脱色剂处理时，G+菌的细胞壁主要由肽聚 糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低， 用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结 构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复 合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染 后仍保留初染剂的蓝紫色。 G-菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂 质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶 解，细胞壁透性增大，使结晶紫—碘的复合物比 较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染 上复染剂的红色。
五、革兰染色的临床意义
1.对细菌的鉴别有重要意义 2.指导临床选择用药 3.研究细菌与致病性的关系
思考题： 怎样能确证你的染色技术操作正确，
结果可靠？
当你对一株未知菌进行革兰染色时，
抗酸染色法
【原理】
结核杆菌对苯胺染料不易着色，若加温或
延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒
细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为G+菌； 细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色 （红色）的细菌为G-菌。
G+G-源自二、实验器材大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革 兰氏染色液，生理盐水，载玻片，接 种环，显微镜等。
三、操作步骤
1、涂片：将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别 涂片、干燥、固定。 2、染色： （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分 钟，水洗 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一 分钟，水洗 （3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用 95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约20—30秒，立 即用水冲净乙醇 （4）复染：用番红液染1--2分钟，水洗 3、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细 菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性 菌呈红色。