中国沙棘染色体核型及进化研究
中国沙棘染色体核型及进化研究摘要:对中国沙棘(Hippophae rhamnoides Linn. ssp. sinensis Rousi)的染色体进行了核型分析,结果表明,中国沙棘染色体数目为2n=24,基数为12,未发现具有非整倍体和多倍体的个体;其核型公式为2n=24=14M+10m,染色体中未发现随体,染色体相对长度组成为2n=4L+6M2+10Ml+4S,核型属于“1B”型,核型不对称系数As.K为54%｡同时,根据Stebbins的核型进化理论和分支系统学的编序､赋值方法,对核型的4个重要性状进行了分析,结果表明,中国沙棘染色体的进化指数为3,进化程度较低,属于较原始种;这些研究结果为中国沙棘资源的开发､良种的选育和分类提供了细胞学理论依据｡关键词:中国沙棘;染色体核型;进化Study on the Chromosome Karyotype and Evolution of Hippophae rhamnoides Linn. ssp. sinensis RousiAbstract: The chromosome karyotype of Hippophae rhamnoides Linn. ssp. sinensis Rousi was analyzed. The results indicated that the chromosome number of H. rhamnoides ssp. sinensis was 2n=24, basic number was 12, no aneuploidy and polyploid was observed in the chromosome; The karyotype formula was 2n=24=14M+10m, no satellites were observed in the chromosome, the relative length of the chromosome composition was 2n=4L+6M2+10Ml+4S, the karyotype belonged to “1B” type, the asymmetry coefficient of karyotype was 54%. Based on the Stebbins’ evolution theory of th e chromosome karyotype and the method for ordering and assignment of cladistic systematics, four important traits were analyzed. The results indicated that the evolution index of chromosome karyotype of H. rhamnoides ssp. sinensis was three, the evolution extent was low, belonging to the more primitive species; this study provided the cytology theory basis for the development of the resources, breeding and variety classification.Key words: Hippophae rhamnoides Linn. ssp. sinensis Rousi; chromosome karyotype; evolution中国沙棘为胡颓子科(Elaeagnaceae)､沙棘属(Hippophae Linn)､沙棘(H. rhamnoides Linn.)的亚种(H. rhamnoides Linn. ssp. sinensis Rousi);世界上有9个亚种,中国有5个,广泛分布于西北､华北等地｡中国沙棘果实富含维生素和有机酸,可制作各种保健食品､饮料,种子可榨油,树皮可提取栲胶,根具根瘤,能够增加土壤肥力,也是防风固沙､水土保持及供庭园观赏的良好树种[1]｡中国沙棘因其亚种､群体和生态型的差异,导致果实内营养成分差异很大,直接影响其经济价值的利用,因此在开发利用时有必要进行分类和整理｡当前,中国沙棘在形态､地理分布等方面的研究已有很多,而有关中国沙棘染色体核型方面的研究较少｡基于此,笔者在国内首次对中国沙棘染色体核型的演化进行了分析和讨论,旨在为中国沙棘的选育提供理论依据[2]｡1材料与方法试验所用的材料是在青海省林业科学研究所实验基地于早晨8∶00至9∶00采集的中国沙棘雌雄株枝条,选择生长良好的一年生嫩枝的茎尖组织,切下茎尖,放入预处理液内(8-羟基喹啉)2~3 h;预处理后的茎尖经水洗后,放入卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1,V/V)中固定;固定好的材料放入1 mmol/L盐酸于60℃下处理25 min;将解离好的材料用清水冲洗2~3次,采用改良的卡宝品红染色15 min,然后进行压片,镜检,显微摄影[3-5]｡选择30个染色体分散良好的､处于有丝分裂中期的细胞进行计数,统计染色体的数目,选取5个染色体形态清楚的细胞进行核型分析[6,7],根据中期染色体的相对长度和臂比两项主要指标进行核型分类[8],核型不对称系数按Arano[9]的方法计算,核型分析依照Stebbins[10]提出的标准进行｡2结果与分析2.1中国沙棘染色体的形态特征中国沙棘染色体的形态特征分别见图1､图2､图3､表1｡从图1､图2､图3､表1可见,中国沙棘染色体中第四对､第五对､第七对､第八对､第十对､第十一对､第十二对染色体属于正中部着丝粒染色体(M),第一对､第二对､第三对､第六对､第九对染色体属于中部着丝粒染色体(m),最长染色体与最短染色体的比值为 3.75,臂比的变化范围为1.0~1.5之间｡2.2中国沙棘染色体的核型特征中国沙棘染色体数目为2n=24,基数为12,未发现具有非整倍体和多倍体的个体,表明中国沙棘染色体的杂合程度低,种的遗传性稳定｡中国沙棘染色体组的总长度为19.54 μm,其中最长染色体长度为2.92 μm,不超过3 μm;染色体相对长度系数I.R.L≤1.00的比例接近60%,这在植物中属于较小的染色体｡中国沙棘染色体的长度比值(LR,指最长染色体长度/最短染色体长度)为3.75,臂比大于2∶1的染色体比例为0,属于“1B”型,核型不对称系数As.K为54%,在进化上属于较原始的种类｡由以上核型分析结果表明,中国沙棘染色体的核型公式为2n=24=14M+10m｡2.3中国沙棘染色体的进化指数Stebbins认为,核型的进化趋势是由对称向不对称方向发展的,对称性大的较为原始,对称性小的较为进化[10]｡根据中国沙棘染色体的几个重要性状,借用分支系统学的常规编序､赋值方法[11,12],可求出反映种群发育程度的进化指数,从而得出中国沙棘的进化水平｡2.3.1染色体长度比(LR)染色体长度的比值越大,则核型越倾向于不对称｡染色体长度比可分为4个进化段,即 2.20以下(赋值为0)→2.20~2.60(赋值为1)→2.60~3.00(赋值为2)→3.00以上(赋值为3)｡2.3.2平均臂比(MAR)染色体平均臂比的数值越大,则核型越倾向于不对称｡染色体平均臂比大致可分为3个进化段,即1.30以下(赋值为0)→1.30~1.40(赋值为1)→1.40以上(赋值为2)｡2.3.3不对称系数(As.K)染色体核型不对称系数的数值越大,则核型越倾向于不对称｡染色体核型不对称系数也可分为3个进化段,即56.00以下(赋值为0)→56.00~58.00(赋值为1)→58.00以上(赋值为2)｡2.3.4臂比大于1.7的染色体比例染色体臂比值越大,核型也越倾向于不对称｡染色体臂比大于1.7的染色体比例也存在3个进化段,即由0.14以下(赋值为0)→0.14~0.19(赋值为1)→0.19~0.24(赋值为2)｡将上述性状的赋值叠加起来,便能得到中国沙棘的进化指数结果(表2)｡从表2可见,中国沙棘染色体的核型进化指数较小,其值为3,因此进化程度较低,属于较原始的种,这与其在核型类型下的判断是一致的｡3小结与讨论通过对中国沙棘雌雄株的染色体核型进行对比分析,发现中国沙棘染色体较小,最长的不超过3 μm,通过30个染色体分散良好的茎尖细胞观察计数,最后确定中国沙棘的染色体数目为2n=24,这与国内外的文献报道相同｡但染色体的核型特征与目前国内外的研究结果有所差异,如王柏青等[13]研究报道,中国沙棘染色体具中部着丝粒,核型属于“2B”型,第三对染色体上有随体｡而笔者的研究认为,中国沙棘雌雄株的核型均属于“1B”型,未发现有随体存在｡目前,关于对中国沙棘染色体的核型进化研究国内还未见报道,本研究采用核型常规分析和进化指数两方面结合进行讨论,综合得出中国沙棘染色体核型属于“1B”型,核型进化指数较小,数值为3,进化程度较低,属于较原始的种类｡可供以后的中国沙棘育种及分子生物学研究作为参考｡参考文献:[1] 周以良,董世林,聂绍荃. 黑龙江树木志[M]. 哈尔滨: 黑龙江科学技术出版社,1986. 444-445.[2] 杜凤国,吴榜华,孙振良,等. 鱼鳞松的核型分析[J]. 河南农业大学学报,1996,30(2):172-173.[3] 李懋学,张学方. 植物染色体研究技术[M]. 哈尔滨: 东北林业大学出版社,1991.[4] 陈瑞阳,宋文芹,李秀兰. 植物有丝分裂染色体标本制作的新方法[J]. 植物学报,1979,21(3):297-298.[5] 李晓玲,杨进,王洪涛,等. 树型金银花染色体制片优化及核型分析[J]. 河南农业科学,2009(7):102-106.[6] 姜丽,计巧灵,张丕鸿. 三个亚麻品种染色体核型分析[J]. 中国麻业科学,2008,30(5): 241-245.[7] 穆尼热,张清斌,赵茂林,等. 新引1号东方山羊豆染色体核型分析[J]. 草业科学,2009,26(17):94-96.[8] 李懋学, 陈瑞阳. 关于植物核型分析的标准问题[J]. 武汉植物学研究,1985,3(4):297-302.[9] ARANO H. Cytological studies p [12] 徐克学. 数量分类学[M]. 北京: 科学出版社, 1994.[13] 王柏青,王耀辉. 中国沙棘的染色体核型分析[J]. 北华大学学报(自然科学版),2000,1(5):407-409.。
中国沙棘育种研究进展
并筛选出理想 的亲本组合 ，应用于杂交种子 园的营建 ；在 以不 同亲本所作 的杂交子代群体 中，选育出 “ 华
林 １号” 天水 １号”等杂种无性系品种 。到 ２ 、“ Ｏ世纪末 ，对所选育 的各 类沙棘 良种 和主要引 进品种 ，分 项进行了区域化试验 ，多数 品种 已批量的应用于生产 。目前 ，中国的沙棘育种 ，正在前期 选育无枝刺 ，大 果粒 、高产 、适应性强的总体 目标和育种 成果 的基础上 ，进 一步追求 各类 营养保 健物质 的高含量 和高品 质 研究手段也将 向多元化发展 。 关键词 ：中国｝沙棘育种 ；研究进展
作者简介 ：黄铨 （９ ９） １ ２一 ，男 ，研究员 ，从事 沙棘资源收集、引种、育种工作 。
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中国 沙 棘 育种 研 究进 展
第 ４期
业原 料林 时 ，用 无 性 系造林 ，以保 持其 性状 的稳
定 与划一 ；而 以改 造环 境为 主要 目的时 ，则 用 实 生苗 造林 。实行 有性 与无 性并 重 ，以适 应不 同造 林 目的 的需 要 。 多生态 区布 点与 多单 位协 作 ，则是 为 了加 大 工 作力 度 ，以空 间抢 时 间 ，在 获得 一定 量 的 良种
富 ，又处 于野生 、半 野生状 态 ，性状 变异 十分 复 杂 ，发掘有 益 的 变 异用 之 于 生 产 ，无 疑是 便捷 、
收稿 日期 ：２０ —８０ ０ ５０ —１
繁殖 途径应 因栽培 目的 而 区别 对待 。对 于 以
获得 高额 果实 产量 或其有 效成 分为 目的 ，建 立工
为综合 指数 法 。 在 我们 协 作组 内 ，历 经 ４个 年 度 ，在西 北 、
华 北 、东 北 ８个 省 （ ） 区 ，共 选 得 ３ ８个优 良单 ６
中国沙棘HrNHX6基因的生物信息学分析及其在盐胁迫下的表达模式
㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(１):１７~２３ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０１.００３收稿日期:２０２３－０２－２４基金项目:国家自然科学基金项目(３１６６００７１)ꎻ青海省 昆仑英才 高端创新创业人才 计划项目作者简介:肖莎莎(１９９９ )ꎬ女ꎬ重庆人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事林木遗传育种方面的研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:１５２１６２１９０９＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:马玉花(１９７８ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ教授ꎬ主要从事森林培育理论与技术㊁植物资源开发利用研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｑｈｘｎｍｙｈ＠１６３.ｃｏｍ中国沙棘ＨｒＮＨＸ６基因的生物信息学分析及其在盐胁迫下的表达模式肖莎莎ꎬ费凡ꎬ董佳伟ꎬ张丹ꎬ马玉花(青海大学农牧学院ꎬ青海西宁㊀８１００１６)㊀㊀摘要:Ｎａ＋/Ｈ＋逆向转运蛋白(ＮＨＸ)广泛存在于多种生物中ꎬ可调节植物响应盐胁迫ꎮ本研究对中国沙棘ＨｒＮＨＸ６进行结构预测和分析ꎬ并采用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术分析不同浓度ＮａＣｌ胁迫下ＨｒＮＨＸ６基因的表达情况ꎮ结果如下:①ＨｒＮＨＸ６基因总长为１３４７ｂｐꎬ与月季花等植物ＮＨＸ６基因具有较高的同源性ꎮ②ＨｒＮＨＸ６为稳定的疏水性蛋白ꎬ定位于高尔基体膜中ꎬ不具有信号肽ꎬ含７个跨膜螺旋结构ꎬ且α－螺旋和无规则卷曲为其二级结构的主要构成元件ꎬ具有多个修饰位点ꎮ③盐胁迫下中国沙棘根㊁茎㊁叶中的ＨｒＮＨＸ６基因表达上调ꎬ说明ＨｒＮＨＸ６基因在中国沙棘响应盐胁迫的过程中可能发挥着重要的调控作用ꎮ本研究结果可为阐明中国沙棘应对盐胁迫的机制奠定基础ꎮ关键词:中国沙棘ꎻ盐胁迫ꎻＨｒＮＨＸ６基因ꎻ荧光定量ＰＣＲꎻ基因表达中图分类号:Ｓ７９３.６ꎻＱ７８６㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０１－００１７－０７ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｅｎｅＨｒＮＨＸ６ｉｎＨｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓｓｕｂｓｐ.ｓｉｎｅｎｓｉｓａｎｄｉｔｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰａｔｔｅｒｎｕｎｄｅｒＳａｌｔＳｔｒｅｓｓＸｉａｏＳｈａｓｈａꎬＦｅｉＦａｎꎬＤｏｎｇＪｉａｗｅｉꎬＺｈａｎｇＤａｎꎬＭａＹｕｈｕａ(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙꎬＱｉｎｇｈａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＸｉｎｉｎｇ８１００１６ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＴｈｅＮａ＋/Ｈ＋ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ(ＮＨＸ)ｐｒｏｔｅｉｎｓｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｒｅｇｕｌａｔｅｐｌａｎｔｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｓａｌｔｓｔｒｅｓｓａｒｅｗｉｄｅｌｙｐｒｅｓｅｎｔｉｎａｖａｒｉｅｔｙｏｆｏｒｇａｎｉｓｍｓ.ＩｎｔｈｉｓｐａｐｅｒꎬｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＨｒＮＨＸ６ｆｒｏｍＨｉｐｐｏｐｈａｅｒｈ￣ａｍｎｏｉｄｅｓｓｕｂｓｐ.ｓｉｎｅｎｓｉｓｗａｓｐｒｅｄｉｃｔｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａ￣ｔｉｏｎｓｏｆＮａＣｌｓｔｒｅｓｓｗａｓａｓｓａｙｅｄｂｙｑＲＴ￣ＰＣＲ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ.①ＴｈｅｔｏｔａｌｌｅｎｇｔｈｏｆＨｒＮＨＸ６ｇｅｎｅｗａｓ１３４７ｂｐꎬｗｈｉｃｈｈａｄｈｉｇｈｅｒｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｗｉｔｈｔｈｅＮＨＸ６ｏｆＲｏｓａｃｈｉｎｅｎｓｉｅｔ.②ＨｒＮＨＸ６ｗａｓａｓｔａｂｌｅｈｙ￣ｄｒｏｐｈｏｂｉｃｐｒｏｔｅｉｎｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｈｅＧｏｌｇｉｍｅｍｂｒａｎｅｗｉｔｈｎｏｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｂｕｔｓｅｖｅｎｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｈｅｌｉｃａｌｓｔｒｕｃ￣ｔｕｒｅｓꎻα￣ｈｅｌｉｘａｎｄｉｒｒｅｇｕｌａｒｃｕｒｌｗｅｒｅｔｈｅｍａｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｉｔｓｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬａｎｄｉｔｈａｄｍａｎｙｍｏｄｉｆｉ￣ｃａｔｉｏｎｓｉｔｅｓ.③ｑＲＴ￣ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＨｒＮＨＸ６ｇｅｎｅｗｅｒｅｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｒｏｏｔｓꎬｓｔｅｍｓａｎｄｌｅａｖｅｓｏｆＨ.ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓꎬｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｏｌｅｏｆｔｈｅｇｅｎｅｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓａｂｏｖｅｃｏｕｌｄｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇｔｈｅｒｅｓｐｏｎｓｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＨ.ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓｔｏｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｈｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓｓｕｂｓｐ.ｓｉｎｅｎｓｉｓꎻＳａｌｔｓｔｒｅｓｓꎻＨｒＮＨＸ６ｇｅｎｅꎻｑＲＴ￣ＰＣＲꎻＧｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀土壤盐碱化是影响农业发展的全球性问题ꎬ由于工业污染㊁化肥过量使用和灌溉不合理等因素的影响ꎬ土壤盐碱化的程度不断上升[１]ꎬ已成为影响植物生长的重要问题之一ꎮ盐胁迫不仅会抑制植物种子的萌发ꎬ还会加速植物根系的木栓化[２]ꎬ影响根系对水分和营养物质的摄入ꎬ从而抑制植物生长发育ꎮ植物耐盐性可表现为Ｎａ＋被Ｎａ＋/Ｈ＋逆向转运蛋白(ＮＨＸ)外排或区隔化以维持细胞内的低Ｎａ＋水平[３]ꎮ研究表明ꎬ在盐胁迫下ꎬ植物利用ＮＨＸｓ将Ｎａ＋分离到液泡ꎬ可以促使细胞从外界应激环境中吸收水分以维持渗透平衡ꎬ调节细胞质中的Ｎａ＋浓度和ｐＨꎬ保护细胞器[４－５]ꎮＮＨＸ基因已在许多植物中被鉴定出来ꎬ但不同植物其成员数量不同ꎬ例如ꎬ拟南芥中有８个ＮＨＸ基因[６]ꎬ葡萄中有６个ＮＨＸ基因[７]ꎬ棉花中有２５个ＮＨＸ基因[８]ꎮ拟南芥的８个ＮＨＸ蛋白中ꎬＡｔＮＨＸ１ Ａｔ￣ＮＨＸ４定位于液泡膜上ꎬＡｔＮＨＸ５和ＡｔＮＨＸ６定位于胞体内膜ꎬＡｔＮＨＸ７(ＡｔＳＯＳ１)和ＡｔＮＨＸ８定位于质膜上ꎻ根据亚细胞定位ꎬ又可将它们分为液泡ＮＨＸｓ(ｖａｃｕｏｌａｒＮＨＸｓ)㊁内膜ＮＨＸｓ(ｅｎｄｏｓｏｍａｌＮＨＸｓ)㊁质膜ＮＨＸｓ(ｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅＮＨＸｓ)[６]ꎮＡｔＮＨＸ１ ＡｔＮＨＸ４通过形成的跨膜质子梯度提供能量ꎬ介导Ｎａ＋区隔化ꎬ以减少过量盐离子对细胞的伤害ꎬ稳定细胞渗透压ꎬ使植物适应盐旱环境ꎻＡｔＮＨＸ５和ＡｔＮＨＸ６具体定位于跨高尔基体网络ꎬ可参与囊泡运输和细胞扩增活性ꎬ特别是在液泡运输中具有重要作用ꎬ并调节ｐＨ和Ｋ＋ꎻＡｔ￣ＮＨＸ７通过盐超敏感(ｓａｌｔｏｖｅｒｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙꎬＳＯＳ)信号传导途径赋予植物耐盐性ꎬＳＯＳ途径包括ＳＯＳ１(质膜Ｎａ＋/Ｈ＋反向运输蛋白)㊁ＳＯＳ２(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)和ＳＯＳ３(钙结合蛋白)ꎬ其中ＳＯＳ２与ＳＯＳ３的复合物可调节ＳＯＳ１以去除细胞内的Ｎａ＋[９－１０]ꎻＡｔＮＨＸ８可以参与Ｌｉ＋/Ｈ＋反向转运[１１－１２]ꎮ但目前有关ＮＨＸｓ在中国沙棘应对盐胁迫时的作用机制研究报道相对较少ꎮ中国沙棘(Ｈｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓｓｕｂｓｐ.ｓｉｎｅｎ￣ｓｉｓ)是一种胡颓子科(Ｅｌａｅａｇｎａｃｅａｅ)沙棘属(Ｈｉｐｐ￣ｏｐｈａｅ)植物ꎬ具有耐旱㊁抗寒㊁抗风沙等特性ꎬ在我国西北被广泛用于水土保持ꎮ研究表明ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ沙棘渗透压降低ꎬ体内脯氨酸㊁可溶性糖等渗透介质的含量增加ꎬ渗透调节能力增强ꎬ以使植株适应外界环境[１３]ꎻ另一方面ꎬ沙棘体内抗氧化酶(ＰＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＳＯＤ等)活性增强ꎬ可减轻活性氧对植株的伤害[１４]ꎬ从而提高沙棘的耐盐性ꎮ本研究以中国沙棘的抗盐分子调节机制为切入点ꎬ对耐盐相关基因ＨｒＮＨＸ６及其编码蛋白进行结构分析和亚细胞定位预测ꎬ同时分析其在不同浓度ＮａＣｌ胁迫下的表达模式ꎬ旨在为中国沙棘应对盐胁迫的机制阐明奠定基础ꎬ同时为高效耐盐基因的发掘提供依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料供试植物材料为长势一致的中国沙棘两年生扦插苗ꎬ由青海省西宁市大通县城关苗圃(３７ʎ１４ᶄ４５ᵡＮꎬ１０１ʎ３０ᶄ１５ᵡＥꎬ海拔２９２０ｍ)提供ꎮ２０１９年７月２８日开始盐胁迫试验ꎬ将１８盆中国沙棘扦插苗随机分为６组ꎬ分别用５００ｍＬ浓度为０㊁２００㊁４００㊁６００㊁８００㊁１０００ｍｍｏｌ/Ｌ的ＮａＣｌ溶液浇灌ꎬ３天后再浇灌一次ꎮ每组处理的３盆作为３个重复ꎬ试验时在花盆底放置一个托盘ꎬ及时将漏出的溶液倒回花盆中ꎬ以防止水分和盐分的流失ꎮ８月２日采集根㊁茎㊁叶ꎬ用超纯水冲洗后用滤纸吸干水分ꎬ装入冻存管ꎬ置于液氮中速冻ꎬ随后放入－８０ħ冰箱保存备用ꎮ１.２㊀试验方法将中国沙棘根㊁茎和叶在液氮中研磨成细粉ꎬ依照植物ＲＮＡ试剂盒说明书快速提取总ＲＮＡꎬ使用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ⅱ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ反转录质量检测合格的优质ＲＮＡꎬ并通过荧光定量ＰＣＲ法分析表达模式ꎬ引物(ＨｒＮＨＸ６－Ｆ:ＣＡＡＴＧＧＡＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＣＧＴꎬＨｒＮＨＸ６－Ｒ:ＣＴＡＡＴＧＣＴＧＴＡＡＡＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴ)由宝生物工程(大连)有限公司合成ꎮ使用２－ΔΔＣｔ法对基因的相对表达量进行分析ꎬ使用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１０和ＳＰＳＳ２２软件进行数据整理与统计分析ꎮＨｒＮＨＸ６基因的全长序列通过转录组测序获得ꎮ用ＤＮＡＳＴＡＲ进行核苷酸序列分析和同源比对ꎻ用ＭＥＭＥ进行保守基序分析ꎻ用ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔ￣Ｐａｒａｍ进行蛋白理化性质分析ꎻ用ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ进行亚细胞定位ꎻ用ＮｅｔＯＧｌｙｃ４.０Ｓｅｒｖｅｒ进行信号肽和跨膜螺旋区分析ꎻＩ－ＴＡＳＳＥＲ用于预测蛋白二级结构ꎬＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ用于预测三级结构ꎻＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ用于蛋白功能位点的预测ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＨｒＮＨＸ６基因序列分析２.１.１㊀ＨｒＮＨＸ６基因的核苷酸序列分析㊀ＨｒＮ￣ＨＸ６基因序列长度为１３４７ｂｐꎬ含３４３个Ａ㊁２８８个Ｇ㊁４７０个Ｔ㊁２４６个ＣꎬＡ＋Ｔ的含量(６０.３６％)高于Ｇ＋Ｃ的含量(３９.６４％)ꎮ８１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀２.１.２㊀ＨｒＮＨＸ６蛋白的氨基酸序列分析㊀ＨｒＮ￣ＨＸ６基因编码４４８个氨基酸ꎬ其中ꎬ酸性氨基酸(Ｄ㊁Ｅ)３６个ꎬ碱性氨基酸(Ｋ㊁Ｒ)２２个ꎬ极性氨基酸(Ｎ㊁Ｃ㊁Ｑ㊁Ｓ㊁Ｔ㊁Ｙ)１１９个ꎬ疏水性氨基酸(Ａ㊁Ｉ㊁Ｌ㊁Ｆ㊁Ｗ㊁Ｖ)１９０个ꎬ分别占氨基酸总量的８.０％㊁５.０％㊁２６.６％㊁４２.４％ꎮ在该蛋白中Ｌｅｕ(Ｌ)和Ｓｅｒ(Ｓ)含量较高ꎬ所占比例分别为１２.３％和９.８％ꎮ２.１.３㊀ＨｒＮＨＸ６基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分析㊀将ＨｒＮＨＸ６与１０种植物ＮＨＸ６基因的核苷酸和氨基酸序列进行同源比对分析ꎬ结果(图１㊁图２)表明ꎬＨｒＮＨＸ６与其他植物ＮＨＸ６基因核苷酸序列的同源性为８２.９％~８５.７％ꎬ氨基酸序列的同源性则达到８４.９％~８９.７％ꎬ其中中国沙棘与月季花的序列同源性最高ꎮ中国沙棘:Ｈｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓꎻ茶树:Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓꎻ橡胶树:Ｈｅｖｅａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓꎻ麻疯树:Ｊａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓꎻ欧洲野苹果:Ｍａｌｕｓｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓꎻ杧果:Ｍａｎｇｉｆｅｒａｉｎｄｉｃａꎻ木薯:Ｍａｎｉｈｏｔｅｓｃｕｌｅｎｔａꎻ阿月浑子:Ｐｉｓｔａｃｉａｖｅｒａꎻ毛白杨:Ｐｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａꎻ山谷白栎:Ｑｕｅｒｃｕｓｌｏｂａｔａꎻ月季花:Ｒｏｓａｃｈｉｎｅｎｓｉｓꎮ下图同ꎮ图１㊀中国沙棘与其他１０种植物ＮＨＸ６基因的同源比对图２㊀中国沙棘与其他１０种植物ＮＨＸ６蛋白的同源比对２.１.４㊀ＨｒＮＨＸ６基因保守基序分析㊀通过ＭＥＭＥ软件对ＨｒＮＨＸ６的保守基序进行分析ꎬ共得到１５个保守结构域ꎬ每个结构域的长度为５０个保守氨基酸ꎬ具有１１个位点ꎬ且Ｅ值都显著ꎮＨｒＮＨＸ６保守基序与橡胶树㊁山谷白栎㊁欧洲野苹果等植物ＮＨＸ６基因保守基序完全一致(图３)ꎮ２.２㊀ＨｒＮＨＸ６蛋白结构预测２.２.１㊀ＨｒＮＨＸ６蛋白理化性质及亚细胞定位㊀ＨｒＮＨＸ６蛋白分子式为Ｃ２２６０Ｈ３４３６Ｎ５５２Ｏ６３６Ｓ２０ꎬ分子量为４９１５６.８４Ｄａꎬ理论等电点为５.４７５ꎬ脂肪系９１㊀第１期㊀㊀㊀㊀肖莎莎ꎬ等:中国沙棘ＨｒＮＨＸ６基因的生物信息学分析及其在盐胁迫下的表达模式数为９９.２２ꎬ蛋白质不稳定系数为３５.０２ꎬ为稳定蛋白ꎮＨｒＮＨＸ６蛋白的疏水分布区域较大ꎬ且有多个连续疏水区ꎬ疏水性最大值为３.５８９ꎬ而亲水区域较小ꎬ亲水性最大值为－２.５１１(图４)ꎬ具有跨膜蛋白疏水性较强的特征ꎬ表明该蛋白是一种疏水性蛋白ꎮ图３㊀ＮＨＸ６的保守基序０２山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀图４㊀ＨｒＮＨＸ６蛋白亲水性２.２.２㊀信号肽预测㊀ＮｅｔＯＧｌｙｃ４.０Ｓｅｒｖｅｒ分析表明ꎬ切割位点Ｃ的最大值为０.２４３ꎬ位于第３３位氨基酸ꎻ信号肽分数Ｓ的最大值为０.１７９ꎬ位于第４４位氨基酸ꎻ合并切割位点Ｙ的最大值为０.１６４ꎬ位于第３３位氨基酸(图５)ꎮＳ的平均值为０.１１７ꎬ预测剪切点在１~２８位氨基酸ꎮＳ的平均值远低于０.５ꎬ表明ＨｒＮＨＸ６蛋白是一种没有潜在信号肽位点的非分泌蛋白ꎮ２.２.３㊀ＨｒＮＨＸ６蛋白结构及功能位点预测㊀ＨｒＮ￣ＨＸ６蛋白二级结构中α－螺旋㊁无规则卷曲㊁延伸链㊁β－折叠分别占４９.３３％㊁３３.２６％㊁１３.６２％㊁３.７９％ꎬα－螺旋和无规则卷曲是其主要构成成分(图６)ꎮ蛋白三维构象如图７所示ꎮ跨膜区预测结果(图８)显示ꎬＨｒＮＨＸ６含７个跨膜螺旋结构ꎬ属于跨膜蛋白ꎮＨｒＮＨＸ６蛋白功能位点的预测结果显示该蛋白包含多个修饰位点:２个Ｎ－糖基化位点ꎬ即始于２１５位氨基酸的ＮＬＳＥ和始于３７５位的ＮＥＳＦꎻ２个蛋白激酶Ｃ磷酸化位点ꎬ分别为始于２２位的ＳＰＫ和始于２２０位的ＳＱＲꎻ５个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点ꎬ分别为始于７７位的ＳＡＴＤꎬ始于２３３位的ＳＬＡＥꎬ始于３１７位的ＳＩＨＤꎬ始于３５０位的ＴＭ￣ＬＥꎬ始于４１４位的ＴＡＬＤꎻ９个Ｎ－豆寇酰基化位点ꎬ分别为始于３１位的ＧＡＩＶＴＦꎬ始于４０位的ＧＴＦＩＡＳꎬ始于７３位的ＧＳＬＩＳＡꎬ始于９２位的ＧＳＤ￣ＶＮＬꎬ始于１４５位的ＧＳＬＳＡＧꎬ始于１５２位的ＧＶＧ￣ＦＴＳꎬ始于１９２位的ＧＬＧＬＳＧꎬ始于３０４位的ＧＬＲ￣ＧＡＭꎬ始于３４５位的ＧＧＳＴＧＴꎮ图５㊀ＨｒＮＨＸ６的信号肽预测图６㊀ＨｒＮＨＸ６蛋白二级结构预测２.３㊀不同浓度ＮａＣｌ胁迫下ＨｒＮＨＸ６基因的表达模式分析ＮａＣｌ胁迫下ꎬ中国沙棘根㊁茎㊁叶中的ＨｒＮＨＸ６基因均上调表达(图９)ꎮ在中国沙棘叶中ꎬ其表达量随着ＮａＣｌ浓度的增加逐渐升高ꎬ当ＮａＣｌ浓度超过６００ｍｍｏ/Ｌ后ꎬ表达量显著升高ꎻ在茎中ꎬ其表达量呈现先升高后降低的趋势ꎬ在４００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ处理下最高ꎬＮａＣｌ浓度继续升高ꎬ其表达量略有下降且变化趋于平缓ꎬ但均显著高于０~２００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ处理ꎻ在根中ꎬ其表达量则表现为波动上升趋势ꎬ在１０００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ处理下达到最高ꎬ除与６００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ处理差异不显著外ꎬ显著高于其他处理ꎮ１２㊀第１期㊀㊀㊀㊀肖莎莎ꎬ等:中国沙棘ＨｒＮＨＸ６基因的生物信息学分析及其在盐胁迫下的表达模式图７㊀ＨｒＮＨＸ６蛋白三维结构模型图８㊀ＨｒＮＨＸ６蛋白跨膜结构域图９㊀不同浓度ＮａＣｌ胁迫下ＨｒＮＨＸ６基因在㊀㊀中国沙棘不同部位中的表达情况３㊀讨论与结论本研究结果表明ꎬ中国沙棘ＨｒＮＨＸ６基因序列全长为１３４７ｂｐꎬ有１５个保守结构域ꎻＨｒＮＨＸ６为稳定蛋白ꎬ定位于高尔基体膜中ꎬ这与拟南芥中ＡｔＮＨＸ６定位于胞体如高尔基体内膜[１５]的结论一致ꎮ高尔基体网络被认为是细胞成分运输的中心ꎬ连接到内质网㊁液泡和质膜[１６]ꎮ在盐胁迫下ꎬ植物产生大量的次生代谢物并分离破坏细胞结构的盐离子ꎬ这都取决于高尔基体网络的作用ꎮ因此推测ＨｒＮＨＸ６的耐盐作用机制可能依赖于高尔基体网络的功能ꎮＨｒＮＨＸ６蛋白的疏水性较强ꎬ具有多个疏水区ꎬ且含有７个跨膜结构域ꎮ此外ꎬＨｒＮＨＸ６蛋白为非分泌蛋白ꎬ没有潜在的信号肽位点ꎬ这与杨平等[１７]的研究结果一致ꎬ符合植物ＮＨＸ的基本特征ꎮＨｒＮＨＸ６蛋白二级结构的主要构成元件为α－螺旋与无规则卷曲ꎬ分别占４９.３３％和３３.２６％ꎮα－螺旋靠链内氢键维持ꎬ两侧分别由疏水性和亲水性氨基酸组成ꎮ疏水侧通过疏水键与磷脂双分子层相互作用将蛋白固定在膜上使得ＨｒＮＨＸ６蛋白具有稳定跨膜结构域ꎬ亲水侧则形成空桶状结构使得ＨｒＮＨＸ６蛋白可进行水分跨膜运输ꎮ这些结构特征赋予了ＨｒＮＨＸ６蛋白高效转运水分的功能ꎬ与该蛋白具有７个跨膜螺旋结构的分析结果一致ꎮ此外ꎬ功能位点预测表明ꎬ中国沙棘ＨｒＮ￣ＨＸ６具有２个Ｎ－糖基化位点㊁２个蛋白激酶Ｃ磷酸化位点㊁５个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点㊁９个Ｎ－豆寇酰基化位点ꎬ说明ＨｒＮＨＸ６蛋白可通过糖基化㊁磷酸化㊁豆蔻酰化等修饰调节该蛋白的功能和构造进而完成Ｎａ＋的转运ꎮ植物ＮＨＸ在耐盐㊁调节ｐＨ㊁保持Ｋ＋稳态以及细胞扩张㊁细胞囊泡的转运等方面发挥着关键作用ꎬ可增强石榴[１８]㊁玉米[１９]㊁桃[２０]等的耐盐性ꎮ盐胁迫下ꎬ苜蓿ＭｔＮＨＸ６基因在不同组织中的表达水平不同ꎬ且在叶片和根部的表达量较高[２１]ꎻ玉米ＺｍＮＨＸ６基因在根中显著表达[１９]ꎻ而在拟南芥幼苗中几乎检测不到ＡｔＮＨＸ６基因的表达[２２]ꎮ这些结果表明不同植物的ＮＨＸ６基因在盐胁迫下行使功能的主要组织部位不同ꎮ本研究结果表明ꎬＮａＣｌ胁迫下ＨｒＮＨＸ６基因在中国沙棘根㊁茎㊁叶中均上调表达ꎬ这与在石榴[１８]和拟南芥[２３]等植物中的研究结果一致ꎻ但不同ＮａＣｌ浓度下其表达量差异较大ꎬ且同一胁迫浓度下其在不同组织中的表达也不同ꎮ此外ꎬ中国沙棘ＨｒＮ￣ＨＸ６基因受盐胁迫显著诱导ꎬ表明中国沙棘ＨｒＮ￣ＨＸ６基因在盐胁迫中行使重要的生物学功能ꎮＳａｎｄｈｕ等[２１]研究发现ꎬ盐胁迫下ＭｔＮＨＸ６基因在苜蓿根部上调表达的幅度显著高于其他组织ꎮ本研究亦得到相似结果ꎬ这可能是由于根组织最先接触到盐胁迫的缘故ꎮ另外ꎬ根中ＨｒＮＨＸ６基因表达显著上升有助于根中细胞的Ｎａ＋外排或区隔２２山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀化ꎬ以维持细胞内低Ｎａ＋水平ꎬ从而减轻盐胁迫对植物地上部分的伤害ꎬ同时通过渗透调节促进根系吸水ꎮ本研究结果可为中国沙棘ＨｒＮＨＸ６基因功能研究提供一定的理论参考ꎬ并为中国沙棘耐盐育种基因的挖掘奠定基础ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＺｈｕＪＫ.Ｐｌａｎｔｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００１ꎬ６(２):６６－７１.[２]㊀ＴａｔｔｉｎｉＭꎬＧｕｃｃｉＲꎬＣｏｒａｄｅｓｃｈｉＭＡꎬｅｔａｌ.Ｇｒｏｗｔｈꎬｇａｓｅｘ￣ｃｈａｎｇｅａｎｄｉｏｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎＯｌｅａｅｕｒｏｐａｅａｐｌａｎｔｓｄｕｒｉｎｇｓａｌｉｎｉｔｙｓｔｒｅｓｓａｎｄｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｒｅｌｉｅｆ[Ｊ].ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔａｒｕｍꎬ１９９５ꎬ９５(２):２０３－２１０.[３]㊀ＡｐｓｅＭＰꎬＢｌｕｍｗａｌｄＥ.Ｎａ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓꎬ２００７ꎬ５８１(１２):２２４７－２２５４.[４]㊀ＹａｍａｇｕｃｈｉＴꎬＦｕｋａｄａ￣ＴａｎａｋａＳꎬＩｎａｇａｋｉＹꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｓｅｎ￣ｃｏｄｉｎｇｔｈｅｖａｃｕｏｌａｒＮａ＋/Ｈ＋ｅｘｃｈａｎｇｅｒａｎｄｆｌｏｗｅｒｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２００１ꎬ４２(５):４５１－４６１. [５]㊀ＡｐｓｅＭＰꎬＡｈａｒｏｎＧＳꎬＳｎｅｄｄｅｎＷＡꎬｅｔａｌ.ＳａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｃｏｎｆｅｒｒｅｄｂｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｖａｃｕｏｌａｒＮａ＋/Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ１９９９ꎬ２８５(５４３１):１２５６－１２５８. [６]㊀ＢｒｅｔｔＣＬꎬＤｏｎｏｗｉｔｚＭꎬＲａｏＲ.Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｏｒｉｇｉｎｓｏｆｅｕｋａｒｙ￣ｏｔｉｃｓｏｄｉｕｍ/ｐｒｏｔｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ[Ｊ].ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｓｉ￣ｏｌｏｇｙ:ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２００５ꎬ２８８(２):Ｃ２２３－Ｃ２３９. [７]㊀ＡｙａｄｉＭꎬＭａｒｔｉｎｓＶꎬＢｅｎＡｙｅｄＲꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉ￣ｆｉｃａｔｉｏｎꎬｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎꎬａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａ￣ｌｙｓｅｓｏｆｇｒａｐｅｖｉｎｅＮＨＸａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈｅｉｒｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｇｒｏｗｔｈꎬｒｉｐｅｎｉｎｇꎬｓｅｅｄｄｏｒｍａｎｃｙꎬａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ[Ｊ].Ｂｉ￣ｏｃｈｅｍｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０２０ꎬ５８:１０２－１２８.[８]㊀ＡｋｒａｍＵꎬＳｏｎｇＹꎬＬｉａｎｇＣꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ￣ｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＮＨＸｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｕｎｄｅｒｓａｌｉｎｉｔｙｓｔｒｅｓｓｉｎＧｏｓｓｙｐｉｕｍｂａｒｂａｄｅｎｓｅａｎｄｉｔｓｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈＧｏｓｓｙｐｉ￣ｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍ[Ｊ].Ｇｅｎｅｓꎬ２０２０ꎬ１１(７):８０３. [９]㊀ＱｉｕＱＳꎬＧｕｏＹꎬＤｉｅｔｒｉｃｈＭＡꎬｅｔａｌ.ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＳＯＳ１ꎬａｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅＮａ＋/Ｈ＋ｅｘｃｈａｎｇｅｒｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａꎬｂｙＳＯＳ２ａｎｄＳＯＳ３[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２００２ꎬ９９(１２):８４３６－８４４１.[１０]ＱｕｉｎｔｅｒｏＦＪꎬＯｈｔａＭꎬＳｈｉＨꎬｅｔａｌ.ＲｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｉｎｙｅａｓｔｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＳＯＳｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｆｏｒＮａ＋ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２００２ꎬ９９(１３):９０６１－９０６６.[１１]ＷａｎｇＭꎬＺｈｅｎｇＱＳꎬＳｈｅｎＱＲꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｏｆｐｏ￣ｔａｓｓｉｕｍｉｎｐｌａｎｔｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０１３ꎬ１４(４):７３７０－７３９０.[１２]ＭｅｎｇＫꎬＷｕＹ.ＦｏｏｔｐｒｉｎｔｓｏｆｄｉｖｅｒｇｅｎｔｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎｔｗｏＮａ＋/Ｈ＋ｔｙｐｅａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｆａｍｉｌｉｅｓ(ＮＨＸａｎｄＳＯＳ１)ｉｎｔｈｅｇｅ￣ｎｕｓＰｏｐｕｌｕｓ[Ｊ].ＴｒｅｅＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ３８(６):８１３－８２４. [１３]阮成江ꎬ谢庆良.盐胁迫下沙棘的渗透调节效应[Ｊ].植物资源与环境学报ꎬ２００２ꎬ１１(２):４５－４７.[１４]乔枫ꎬ耿贵工.盐碱胁迫对沙棘种子萌发及幼苗抗氧化酶活性的影响[Ｊ].东北林业大学学报ꎬ２０１２ꎬ４０(２):１７－１９. [１５]ＢａｓｓｉｌＥꎬＯｈｔｏＭꎬＥｓｕｍｉＴꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＮａ＋/Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｓＮＨＸ５ａｎｄＮＨＸ６ａｒｅｅｎｄｏｓｏｍｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｄｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２０１１ꎬ２３(１):２２４－２３９.[１６]ＬａｒｋｉｎＨꎬＣｏｓｔａｎｔｉｎｏＳꎬＳｅａｍａｎＭＮＪꎬｅｔａｌ.Ｃａｌｎｕｃｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｅｎｄｏｓｏｍａｌｓｏｒｔｉｎｇｏｆｌｙｓｏｓｏｍａｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓ[Ｊ].Ｔｒａｆｆｉｃꎬ２０１６ꎬ１７(４):４１６－４３２.[１７]杨平ꎬ蔡小宁ꎬ贲爱玲.盐芥ＴｈＮＨＸ１基因的克隆及序列分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２００７ꎬ２３(６):５５６－５６３.[１８]ＤｏｎｇＪＭꎬＬｉｕＣＹꎬＷａｎｇＹＹꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉ￣ｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＮＨＸｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎＰｕｎｉｃａｇｒａｎａｔｕｍＬ.ａｎｄｔｈｅｉｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｌｐａｔｔｅｒｎｓｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].Ａｇｒｏｎｏｍｙꎬ２０２１ꎬ１１(２):２６４.[１９]ＺöｒｂＣꎬＮｏｌｌＡꎬＫａｒｌＳꎬｅｔａｌ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮａ＋/Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｓ(ＺｍＮＨＸ)ｏｆｍａｉｚｅ(ＺｅａｍａｙｓＬ.)ａｎｄｔｈｅｉｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏ￣ｇｙꎬ２００５ꎬ１６２(１):５５－６６.[２０]李淼ꎬ李桂祥ꎬ刘伟.桃ＮＨＸ基因家族的全基因组鉴定与表达分析[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０２１ꎬ５３(１２):８－１６. [２１]ＳａｎｄｈｕＤꎬＰｕｄｕｓｓｅｒｙＭＶꎬＫａｕｎｄａｌＲꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒ￣ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＮａ＋/Ｈ＋ｅｘｃｈａｎｇｅｒｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎＭｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ[Ｊ].Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ＆Ｉｎｔｅｇｒａ￣ｔｉｖｅＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０１８ꎬ１８:１４１－１５３.[２２]ＹｏｋｏｉＳꎬＱｕｉｎｔｅｒｏＦＪꎬＣｕｂｅｒｏＢꎬｅｔａｌ.ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＮＨＸＮａ＋/Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００２ꎬ３０(５):５２９－５３９.[２３]ＷａｎｇＬＧꎬＷｕＸＸꎬＬｉｕＹＦꎬｅｔａｌ.ＡｔＮＨＸ５ａｎｄＡｔＮＨＸ６ｃｏｎｔｒｏｌｃｅｌｌｕｌａｒＫ＋ａｎｄｐＨｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ:ｔｈｒｅｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｃｉｄｉｃｒｅｓｉｄｕｅｓａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔ[Ｊ].ＰＬｏＳＯＮＥꎬ２０１５ꎬ１０(１２):ｅ０１４４７１６.３２㊀第１期㊀㊀㊀㊀肖莎莎ꎬ等:中国沙棘ＨｒＮＨＸ６基因的生物信息学分析及其在盐胁迫下的表达模式。
中国沙棘雌雄株的染色体核型分析_王彬
沙棘核DNA含量与杂交种起源的相关性研究
沙棘核DNA含量与杂交种起源的相关性研究沙棘核DNA含量与杂交种起源的相关性研究摘要：沙棘（Hippophae rhamnoides L.）是一种重要的果树和药用植物，具有广泛的药用价值和经济价值。
近年来，随着杂交育种技术的迅速发展，杂交种的获取和利用成为沙棘育种的重要途径。
本研究旨在探究沙棘核DNA含量与杂交种起源之间的相关性，为沙棘的杂交育种提供理论依据。
关键词：沙棘；核DNA含量；杂交种；起源；相关性引言：沙棘作为我国特产的果树和药用植物，在药用价值和经济价值上具有广泛的应用前景。
然而，沙棘的遗传改良和育种研究相对滞后，种质资源有限，育种方法单一。
然而，以沙棘为母本与其他近缘种进行杂交，能够获得具有丰富营养价值、生长快、抗逆性强的杂交种，有着巨大的潜力。
因此，探究沙棘核DNA含量与杂交种起源之间的相关性对于沙棘的育种具有重要的意义。
方法：本研究选择了10个沙棘栽培品种和5个近缘种，通过染色体溶解技术获取沙棘和近缘种的样品，并利用流式细胞术测定核DNA含量。
同时，通过评估沙棘与近缘种之间的杂种后代的营养价值和生长性状来判断杂交种的起源。
结果：通过核DNA含量的测定，发现不同沙棘品种及近缘种之间的核DNA含量存在较大差异。
在杂交种中，核DNA含量也存在一定的变异。
研究结果显示，沙棘与某些近缘种的杂交种在核DNA含量上表现出更高的变异性。
此外，通过对杂交种后代的营养价值和生长性状的评估发现，核DNA含量与营养价值和生长性状之间存在一定的相关性。
讨论：核DNA含量是一种重要的遗传特征，能够反映物种遗传多样性和进化关系。
本研究中，核DNA含量的测定结果说明了沙棘与近缘种之间存在着较大的核DNA差异，这为沙棘与近缘种的成功杂交提供了基础。
此外，核DNA含量与杂交种后代的营养价值和生长性状之间的相关性结果表明，核DNA含量可能与杂交种的品质和表现有一定的关联，进一步证明了核DNA含量作为育种指标的重要性。
中国沙棘雌雄株的染色体核型分析_王彬
2 .1 中国沙棘雌株染色体核型 由表 1 、图 1 和图 2 可见 , 中国沙棘雌株染色
体中第 4 、5 、7 、8 、10 、11 、12 对染色体属于正中部 着丝粒染色体(M), 第 1 、2 、3 、6 、9 对染色体属于 中部着丝粒染色体(m), 最长染色体与最短染色 体的比为 3 .75 , 臂比的变化范围为 1 .0 ～ 1 .5 。中 国沙棘雌株染色体核型具有以下特征 :①染色体 数目为 2n =24 , 基数为 12 , 未发现非整倍体和多 倍体的个体 , 表明中国沙棘染色体杂合程度低 , 种 的遗传性稳定 ;②染色体组总长度为 19 .54 μm , 其中最大染色体长度为 2 .92 μm , 不超过 3 μm , 染色体相对长度系数 I .R.L ≤1 .00 的比例接近 60 %, 在植物中属于较小染色体 ;③染色体的长度 比值 (L R)=最长染色体长度/ 最短染色体长度 为3 .75 , 臂比大于 2 ∶1 的染色体比例为 0 , 属于 1B 型 , 核型不对称系数 As .K .c 为 54 %, 在进化 上属于较原始的种类 ;④核型分析表明中国沙棘 雌株染色体的核型公式为 :2n =24 =14M +10m 。 2 .2 中国沙棘雄株染色体核型
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西 北 农 业 学 报 19 卷
近年来 , 对沙棘属的核型研究已有一些报道 , 国外 学 者主 要 研 究 了 H .rhamnoi des 的 核 型 ; Darmer(1974)等 认 为沙 棘是 多 倍体 。 Rousi A 等[ 2] 对 H .rhamnoi des 进行核型分 析 , 证明沙棘 为二倍体 :2n =24 。 曹亚玲和吕荣森[ 3] 报道了中 国沙棘属植物 4 种 5 亚种的核型 , 对各种之间进 行了比较 , 它们的染色体数目都是 2n =24 , 全由 中部着丝点和近中部着丝点染色体组成 。梁万福 等[ 4] 对青海地产的 4 种沙棘染色体进行了核型分 析 , 得出沙棘有 24 条染色体 , 所有染色体具中部 着丝点 , 核型归属 2A 的结论 。 王柏青等[ 5] 对中 国沙棘的染色体核型分析 , 得出核型归属 2B 的 结论 。不同的研究者得出的结论有一定的差别 , 但关于中国沙棘雌雄植株在染色体核型上是否有 差异未作描述 , 关于中国沙棘雌雄株染色体核型 的对比研究 , 尚未见报道 。为了更准确的了解中 国沙棘染色体的数目和核型特征 , 本研究从雌雄 株 2 种材料入手 , 进行核型对比分析 , 为中国沙棘 选育提供理论依据[ 6] 。
不同生境中亚沙棘亚种表型遗传分化规律研究
基 金 项 目 ： 中国 林业 科学 研 究 院林 业 研 究所 重 点 项 目 （ Ｄ ０ ９４ 科 技 部 农 业 科 技 成果 转化 资 金 项 目 “ Ｚ ２０ ０ ） 大果 沙 棘
优 良引进 品种 产 业 化 示 范 （ ０ ９ Ｂ ４ ２ ４ ０ ” 资 助 。 ２０ Ｇ ２３ ０ ７ ） 作 者 简 介 ：乌 丽 雅斯 （ ９ ３ ） １ ６ 一 ，女 ，博 士 ，主 要 从 事 沙棘 良种 选 育 及栽 培 技 术 研 究 。
国家林 业局林 木培育 重点实验 室 ，北京 １ ０ ９ ） ０ ０ １
摘 要 ：在 新 疆 和 田、 喀什 和 伊 宁 ３ 不 同地 区 采 取 中 亚 沙 棘 样 本 ４ 株 ，主 要 从 果 实 形 态 、种 子 形 态 和 叶 个 ９ 片 特 性 方 面 对 中 亚 沙棘 进 行 了 比较 分 析 ，结 果 表 明 ：中亚 沙 棘 ３ 居 群 的 种子 长度 未 达 到 显 著 差 异 水 平 ， 个 但 宽 度 、厚 度则 呈 极 显 著 差 异 水 平 ；种 子 千 粒 重 在 ５ ３ ～ １． ７ ． ６ ６ ７ｇ之 间 ，３个 居 群 的 千 粒 重 达 到 极 显 著 差
征 为依据 ，将 中国沙棘划分 为大红梨 型 、小橘红
型等 ２ 个种 下变异 。黄铨口＝ １ ｚ研究 中 国沙棘 的性 状变 异与演化 趋势 ，认 为 中国沙棘 的性状存 在很 大 幅度 的 随机 变 异 ，也 存 在 着 地 理种 群 间 的差 异 。本 研究 针 对 沙 棘 属 植 物 的 表 型性 状 进 行 研 究 ，通 过对分 布于我 国西北新疆 不同生境条件 下
的 中亚 沙 棘 亚 种 （ Ｈ．ｒａ ｏｄ ｓｓ ｂｐ ｕｋ — ｈ ｍｎ ｉｅ ｕ ｓ ．ｔｒ ｅ
沙棘生物技术研究进展
沙棘生物技术研究进展摘要综述了近年来国内外沙棘生物技术的研究进展，主要涉及组织培养、原生质体操作与基因工程，以及分子标记技术在沙棘遗传多样性检测、亲缘关系分析、性别鉴定的应用等方面内容。
关键词沙棘；组织培养；原生质体操作；基因工程；分子标记沙棘（Hippophae rhamnoides L.）又名醋柳，是胡颓子科沙棘属落叶乔木或灌木，其果实营养价值和药用价值极高，共有7种11亚种。
我国产7种7亚种，是沙棘分布面积最大、种类最多的国家，也是沙棘资源蕴藏最丰富的地区。
近10年来，生物技术已被应用于沙棘育种改良，本文主要对组织培养、原生质体操作、基因工程、分子标记等方面研究进展进行综述。
1组织培养沙棘组织培养技术在种苗快速繁殖、种质资源离体保存、遗传转化等方面都有极其重要的应用价值。
20世纪90年代以来，沙棘组织培养研究报道不断增多，并取得了一定的进展。
建立快速、稳定、高效的繁殖体系仍然是当今沙棘组织培养研究的主要目的。
Liu等（2007）通过优化培养基、植物生长调节物质和碳源等措施，以子叶、下胚轴、叶片为外植体，采用直接体细胞胚发生途径获得了再生植株，最高成活率达到55%；该试验中形成的体细胞胚与其合子胚具有相似的组织结构。
沙棘组织培养过程中愈伤组织易发生褐化，从而影响无性系的诱导和增殖，杜研等（2007）对外植体取材类型、光照和培养温度、无机盐浓度、不同的6-BA浓度、转接周期、培养基硬度以及活性炭等7种影响外植体褐化的因子进行了研究，为解决褐化问题提供了重要的参考。
2原生质体操作与基因工程原生质体分离、培养及融合技术是生物技术领域中的一个重要组成部分，为作物遗传育种工作开辟了一条新思路，它已成为烟草、小麦、马铃薯、柑橘等作物和果树改良的重要手段。
原生质体操作首先要建立在成熟的原生质体分离和培养再生体系基础上。
迄今，沙棘原生质体研究仅有1篇报道。
北京林业大学朱俊英等（2005）为了开展沙棘属木本植物细胞的电生理特性及其耐盐性机制关系的研究，以中国沙棘子叶为材料分离原生质体，探索了适合膜片钳封接的原生质体的游离条件。
中国沙棘、俄罗斯沙棘及杂交子代光合特征比较研究
效 益 。近 年来 ，利 用抗逆 性 强 的中 国沙棘 和经 济 效 益高 的俄 罗斯 大果 沙棘 开展 杂交 育 种工作 ，取
得 了重 要进 展Ｉ１ ，获 得 了多 个 抗 性强 经 济 价 值 ５１ ．ｊ 高 的优 良杂 交种 。对 杂交 子代 与亲 本 的研究 可 为
供试 材 料为 ６年生 中 国沙 棘 （ １号 ） ２ 、俄 罗 斯 沙棘 （ ３号 ） 及 其 杂 交 子代 （ ×２ ） 的健 康 ３ １ 植 株 ，采 用 美 国 Ｌ —Ｃ ｉ ＯＲ公 司生 产 的 ｕ一 ６ ｏ ４Ｏ
便携 式 光合作 用测 定仪 在野 外对供 试植 株活体 测 定光 合速 率 （ ｎ 、蒸 腾 速 率 （ ｒ 、胞 间 Ｃ 。 Ｐ） Ｔ） Ｏ 浓度 （ ｉ Ｃ ）及 气 孔 导 度 （ ） 等 指 标 。每 种 选 Ｇｓ
择 ３株 代 表 性 植 株 ，每 次 选 择 树 体 中部 生 长 良
植 物 的光合 作用 日变 化是在 一定 天气条 件下
院坝 口水 利水 保试 验站 沙棘 园 ，位 于 阴山 山脉大
各种生 理 生态 因子 综 合 效应 的最 终 反 映 ，Ｐ ｎ日
４ ６
中国 沙 棘 、俄 罗斯 沙棘 及 杂 交 子代 光合 特 征 比较 研 究
第３ 期
变化 的研 究结 果可作 为分 析植 物生 长 限制 因素 的 依 据之一 ｌ ＿ 】 。测定 结 果 表 明 ３个 品种 的光 合 速
摘 要 ：利 用 Ｕ 一 ６ Ｏ ４ ０便携 式 光 合 仪 对 中 国沙 棘 （ ｐ ｏ ｈ ｅ ａ ｏｄ ｓ ｉｅｓ ） Ｈｉ ｐ ｐ ａ Ｒｈ ｍｎｉｅ ｎｎｉ 、俄 罗斯 沙 棘 （ ｐ — Ｓ ｓ Ｈｉｐ ｏ ｈ ｅ ａ ｏｄ ｓ ｐ ａ Ｒｈ ｍｎｉ ｅ）及 其 杂交 子代 的 光 合 特 征 进 行 测 定 ， 比较 其 亲 本 及 子 代 的差 异 性 。结 果 表 明 光 合 速 率 日变 化 曲线 中 国沙 棘 及 俄 罗 斯 沙 棘 呈 “ 峰 ” 型 ，杂 交 子 代 呈 “ 峰 型 ” 双 单 ；全 天 蒸 腾 速 率 以 俄 罗 斯 沙 棘 最 大 ， 中国 沙 棘 最 小 ；胞 间 Ｃ ｚ浓 度 日变 化 规 律 三 者 相 似 ，均 在 １ ：０ 到 最 小 值 ；全 天 气 孔 导 度 以 俄 罗 Ｏ ４ ０达
山西五台山不同海拔中国沙棘居群的遗传变异
山西五台山不同海拔中国沙棘居群的遗传变异孙坤;王瑞雪;陈纹;侯勤正;李梅【摘要】利用ISSR分子标记分析了山西五台山不同海拔中国沙棘居群的遗传多样性和遗传分化.用11条引物对3个中国沙棘居群共60个样品进行扩增,共检测到170个位点,其中多态位点162个,多态位点百分率(PPB)为95.29％.五台山中国沙棘总的Shannon's信息指数(Ⅰ)为0.455 6,Nei's指数(h)为0.301 1,表明亚种水平的遗传多样性较高.五台山中国沙棘居群水平也具有很高的遗传多样性,PPB平均为62.55％,Ⅰ平均为0.323 5,h平均为0.203 0.五台山高海拔的中国沙棘居群S15和S16较低海拔居群S14遗传多样性丰富.POPGENE分析表明,五台山中国沙棘居群间存在较高的遗传分化(Gst=0.316 1),在总的遗传变异中31.61％的变异存在于居群间,居群间的基因流仅为1.081 8,限制的基因流可能是居群间存在较高遗传分化的主要原因,较高的居群间的遗传分化暗示在资源保护和利用中应考虑对不同地方居群的保护和利用.%In this paper, Hippophae rhamnoides ssp sinensis populations are collected from different altitudes at Wutai Mountain in Shanxi Province, and their genetic diversity and genetic differentiation are analysed by using the inter simple sequence repeat (ISSR) molecular technique. ISSR amplification of 60 individuals from 3 populations is conducted with 11 primers, and 162 polymorphic loci are detected from total 170 loci, with the percentage of polymorphic bands ( PPB) being 95.29%. The Shannon's info rmation index(Ⅰ) and Nei's gene diversity (A) of H rhamnoides ssp sinensis from Wutai Mountain at species level are 0. 455 6 and 0. 301 1 respectively, indicating a high genetic diversity of H rhamnoides ssp sinensis at species level. High genetic diversity of Hrhamnoides ssp sinensis at population level is also detected, with the mean values of PPB, I and h being 62.55%, 0.323 5 and 0.203 0 respectively. Population S15 and S16, which distributed at altitude of 203 3 m and 162 4 m respectively of Wutai Mountain, have higher genetic diversity than S14 at 121 4 m. POPGENE analysis shows the genetic differentiation coefficient (Gst) among the populations being 0.316 1. That mean among population component account for 31. 61% of the total variation, the gene flow among the populations is only 1. 081 8. The high genetic differentiation between populations implies the protection and utilization of resources should be considered in different areas' populations.【期刊名称】《西北师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(049)002【总页数】5页(P75-79)【关键词】中国沙棘;五台山;海拔;遗传变异【作者】孙坤;王瑞雪;陈纹;侯勤正;李梅【作者单位】西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q943遗传变异广泛存在于各种生物体内，是生物进化的根本动力，会受到自然选择和环境因素的影响［1］.其中海拔是一个重要的环境因子，海拔的变化也影响着温度、降水和光照等因子的变化［1］.中国沙棘（H rhamnoides ssp sinensis）是我国特有的沙棘亚种，分布范围广，种下变异丰富，具有重要的生态和经济价值［2］.山西省是中国沙棘分布范围最广泛的省份，约有沙棘林33万公顷，占全国沙棘林总面积的一半［2，3］.吴琼对山西省五台山中国沙棘表型性状进行的分析表明，五台山同一海拔和生境下中国沙棘形态性状变异幅度较大［3］.然而，目前从分子水平出发研究中国沙棘遗传多样性水平沿海拔梯度变化情况的报道却很有限［4］.本文以不同海拔的3个中国沙棘居群为研究对象，运用ISSR分子标记对山西五台山不同海拔中国沙棘居群的遗传变异情况进行了初步研究，分析其是否具有与表型性状一致的遗传变异水平，以期为山西省中国沙棘的引种利用和资源保护提供理论依据.1 材料方法1.1 材料于2011年8月在山西省五台县至五台山沿海拔梯度设置采样路线，分别选取不同海拔的3个中国沙棘居群为对象，各居群随机采集20个个体.在野外分别采集新鲜叶片并迅速放入硅胶袋中干燥，带回实验室备用.各居群的分布和环境特点见表1. 表1 中国沙棘居群采集信息Tab 1Sampling information of H rhamnoides ssp sinensis居群Population生境Habitat S14 1 214 38°44.95＇113°17.21＇五台县河滩沙海拔Altitude／m纬度Latitude／N经度Longitude／E采集地Location棘灌丛S16 1 624 38°56.94＇113°28.78＇五台山山坡沙棘灌丛S15 2 033 38°57.28＇113°29.90＇五台山云杉林缘1.2 DNA提取和PCR反应采用改良的CTAB法提取植物叶片总DNA［5］.得到的植物基因组DNA经0.8%的琼脂糖凝胶结合标准λDNA统一定量为10ng·μL－1.从100条ISSR引物中筛选出11条条带清晰、重复性好的引物（表2）［6］.聚合酶链式反应在10μL反应体系中进行，包括：1μL 10×PCR buffer，200μmol·L －1 dNTPs，2.0mmol·L－1 MgCl2，0.3μmol·L－1引物，1μL基因组DNA和0.5UTaq聚合酶.PCR反应条件为：94℃ 预变性1.5min；45个循环：94℃变性45s，53℃ 退火45s，72℃延伸1.5min；循环结束后72℃延伸7min，4℃保存. PCR扩增产物加入3μL loading buffer，在含有EB的1.5%琼脂糖凝胶中120V稳压分离3.5～4.0h（缓冲液是0.5×TBE），于 UVI紫外凝胶成像系统（BTS－20.M）拍照.DL3000DNA Marker（上海生工）做分子量参照.表2 ISSR引物序列和退火温度Tab 2ISSR primer sequences and annealing temperature注：Y＝T or C引物Primer序列Primer sequences／（5’－3’）退火温度Annealing temperatur／℃UBC807 （AG）8T 51.7 UBC809 （AG）8G 52.9 UBC810 （GA）8T 55.5 UBC812 （GA）8A 52.9 UBC818 （CA）8G 51.0 UBC825 （AC）8TG 55.3 UBC827 （AC）8G 54.1 UBC834 （AG）8YT 48.5 UBC836 （AG）8YA 52.9 UBC840 （GA）8YT 53.0 UBC857 （AC）8YG 53.01.3 数据统计与分析根据电泳图谱中DNA条带的有无，将ISSR扩增结果转化为0／1二元数据.用POPGENE version1.32软件对各居群进行遗传多样性指数分析，包括：多态位点百分率（PPB）、Nei’s基因多样性指数（h）、Shannon’s信息多样性指数（I）、居群总遗传变异（Ht）、居群内遗传变异（Hs）、Nei’s遗传距离、居群间遗传分化系数（Gst）和基因的每代迁移数目（Nm）.用NTSYS软件根据无偏Nei’s遗传距离对3个居群的所有个体进行UPGMA聚类分析.2 结果与分析2.1 ISSR标记的多态性及遗传多样性11条引物进行ISSR分析，检测到的位点数在11～18个之间，各位点的DNA片段大小介于200～1 800bp之间，共检测到170个位点，其中多态位点162个，平均每个引物检测到13.5个.多态位点比率在各居群的分布情况见表3.表3 中国沙棘居群遗传参数Tab 3Genetic parameters of H rhamnoides ssp sinensis居群Population样本数Sample size有效等位基因数Effective number of alleles Nei’s基因多样性Gene diversity Shannon’s多态性信息指数Shannon’s Information index多态位点比率Percentage of polymorphic bands／%S14 20 1.311 4 0.184 0 0.277 0 54.12 S16 20 1.368 7 0.218 5 0.331 4 67.65 S15 20 1.365 1 0.215 4 0.326 0 65.88居群平均值population mean 20 1.348 4 0.203 0 0.323 5 62.55 60 1.509 2 0.301 1 0.455 6 95.29亚种Subspecies高海拔居群S15和中海拔居群S16遗传变异水平非常接近，且都比低海拔的S14高.其中五台山山腰的S16表现出最高水平的遗传变异，多态位点百分率（PPB）＝67.65%，有效等位位点（ne）＝1.368 7，Nei’s基因多样（h）＝0.218 5，Shannon’s信息指数（I）＝0.331 4.2.2 遗传结构五台山中国沙棘居群表现出非常显著的遗传分化，在总的遗传变异中，31.61%的变异发生在种群间，68.39%的变异发生于种群内，3个居群总基因多样性（Ht）和居群内的基因多样性（Hs）分别为0.301 1和0.206 0，基因的每代迁移数目（Nm）为1.081 8（表4）.表4 居群间的遗传分化Tab 4Genetic differentiation among populations of H rhamnoides ssp sinensisHt.居群总遗传变异；Hs.居群内遗传变异；Gst.基因分化系数；Nm.基因每代迁移数目Ht Hs Gst Nm 0.301 1 0.206 0 0.316 1 1.081 8 2.3 遗传距离和聚类分析用POPGENE软件计算的结果可知，五台山接近山顶的居群S15和山腰居群S16的Nei’s遗传距离最近，为0.105 9，海拔最高的居群S15和海拔最低的居群S14的Nei’s遗传距离最远，为0.241 0（表5）.根据Nei’s遗传距离，用UPGMA对3个居群进行聚类，结果显示，高海拔和中海拔的两个居群S15和S16的遗传相似性最高，优先聚为一支，随后才与位于低海拔的居群S14相聚，这与POPGENE分析结果一致.三个居群内的个体各自聚为一支，反映出居群间存在显著的遗传分化（图1）.表5 居群间的无偏Nei’s遗传距离Tab 5Nei’s unbiased measures of genetic distanceS14 S15 S16 S14 0.000 0 S15 0.241 0 0.000 0 S16 0.231 2 0.105 9 0.000 03 讨论3.1 五台山中国沙棘居群遗传多样性研究证明遗传变异越高，适应环境的能力越强［7］.本研究用11条ISSR引物对山西五台山不同海拔中国沙棘居群进行遗传变异分析，结果显示多态位点百分比、Nei’s遗传多样性指数、Shannon’s信息指数都高于孙坤等［8］用 RAPD检测中国沙棘分布区的居群遗传多样性水平的平均值（PPB＝55.81%，h＝0.168，I ＝0.259）.说明五台山中国沙棘居群具有非常丰富的遗传多样性.这一结果与吴琼等对五台山中国沙棘居群形态性状变异分析得到的结果一致.五台山不同海拔3个中国沙棘居群中，较高海拔的S15和S16居群具有更高的遗传多样性水平，其中分布于山腰的居群S16的遗传多样性稍高于山顶云杉林缘的S15居群，而分布于河滩的低海拔居群S14的遗传多样性远低于上述两个居群.繁育系统是影响植物遗传多样性的重要因素，中国沙棘是兼性繁殖的克隆植物，具有发达的克隆繁殖能力，分布于海拔400～3 500m的广大地区.研究表明，中国沙棘虽能耐大气干旱，但适宜生活于土壤水分充足的环境，常通过克隆繁殖在水分充足的河滩等地形成密集的沙棘灌丛［2］，因此，发达的克隆繁殖很可能是河滩分布的居群S14遗传多样低的主要原因.3.2 五台山不同海拔中国沙棘的遗传分化图1 中国沙棘3个居群的UPGMA聚类Fig 1Dendrogram of genetic distances of 3populations of H rhamnoides ssp sinensis based on Nei’s unbiased genetic distance coefficients居群间的遗传分化是各种因素综合作用的结果，但研究表明，繁育系统和基因交流的程度是影响居群遗传结构最重要的因素［1］.中国沙棘是雌雄异株、风媒传粉、兼性克隆繁殖的木本植物.本文结果表明，五台山不同海拔3个中国沙棘居群间的空间距离虽然不大，但居群间仍表现出明显的遗传分化（Gst＝0.316 1），且明显高于中国沙棘整个分布区不同居群间的遗传分化水平（Gst＝0.1830）［8］和异交植物遗传分化的平均水平（Gst＝0.193 0）［9］.研究距离隔离造成的遗传分化发现，在短距离内限制的基因流能够引起居群亚结构的形成［8］.五台山3个中国沙棘居群间Nm值仅为1.081 8，小于中国沙棘整个分布区居群间基因流的平均水平（Nm＝2.181）［8］，远远小于 Hamrick研究的异交风媒植物居群间基因流的平均值（Nm＝5.380）［10］.中国沙棘主要的基因交流方式是风媒传粉和鸟类吞食果实散播种子，研究表明中国沙棘花粉的传播距离一般不超过20m，其中60%～90%落在12m范围之内［11］.因此，虽然环境的差异和空间异质性会对遗传结构产生一定影响，但有限的基因流很可能是五台山不同海拔中国沙棘居群间存在较高遗传分化的主要原因.此外，由于中国沙棘居群间存在较高遗传分化，因此在沙棘资源保护和利用中应特别注意收集利用和保护不同产地的种质资源.参考文献：［1］文亚峰，韩文军，吴顺.植物遗传多样性及其影响因素［J］.中南林业科技大学学报，2010，30（12）：80－87.［2］廉永善，卢顺光，薛顺康，等.沙棘属植物生物学和化学［M］.兰州：甘肃科学技术出版社，2000：57－65.［3］吴琼，孙坤，张辉，等.山西省中国沙棘天然居群表型多样性研究［J］.西北师范大学学报：自然科学版，2007，43（2）：78－84.［4］陈国娟.卧龙自然保护区不同海拔的中国沙棘天然群体的遗传多样性分析［D］.成都：中国科学院成都生物研究所，2007.［5］DOYLE J J，DOYLE J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf material［J］.Phytochemical Bulletin，1987，19（1）：11－15.［6］温江波.青藏高原东缘西藏沙棘、肋果沙棘遗传多样性－兼论沙棘杂交带杂种及亲本的克隆繁殖适合度［D］.兰州：西北师范大学，2010.［7］SUN M.Effects of population size，mating system，and evolutionary origin on genetic diversity in spiranthes sinensis and S hongkongensis ［J］.Conservation Biology，1996，10（3）：785－795.［8］SUN K，CHEN W，MA R J，et al.Genetic variation in hippophae rhamnoides ssp sinensis（Elaeagnaceae）revealed by RAPD markers ［J］.Biochemical Genetics，2006，44（5／6）：186－197.［9］BUSSELL J D.The distribution of random amplified polymorphic DNA （RAPD）diversity amongst populations of Isotoma petraea（Lobeliaceae）［J］.Molecular Ecology，1999，8（5）：775－789.［10］HAMRICK J L，GOAT M J W.Allozyme diversity in plant species［M］／／BROWN A H D.Plant Population Genetics， Breeding，and Genetic Resources. Sunderland： Sinauer， 1990： 43－63，304－319.［11］鲁先文，马瑞君，孙坤.中国沙棘（Hippophae rhamnoides L ssp sinensis Rousi）的开花特性及风媒传粉距离的检测［J］.生态学报，2008，28（6）：2518－2525.。
沙棘育种研究进展
沙棘育种研究进展摘要：从沙棘杂交育种、选择育种、引种及实生选种等方面进行了综述，为生产和科研方面提供参考。
关键词：沙棘；育种；研究进展沙棘（Hippophae rhamnoides. L）又名醋柳、酸刺等，为胡颓子科（Elueagnaceac）沙棘属落叶灌木或小乔木，是一种新兴的小浆果树种，株高2～4 m，高者可达10 m左右，雌雄异株。
我国沙棘资源丰富，目前共有沙棘林140万hm2之多，占世界沙棘总面积的95%以上，素有“沙棘王国”之称［1 ］。
中国在生态环境建设中大多利用中国沙棘；德国、意大利、芬兰等国家，多利用鼠李沙棘；在印度、巴基斯坦等国家，中亚沙棘已被开发成许多产品。
中国沙棘、中亚沙棘2个亚种的野生资源最为丰富，但果小、刺多、含油量少及产量低等。
其他种或亚种具有刺少、维生素和油含量高、耐旱、耐寒、抗盐碱等，但这些种或亚种的繁育与栽培研究也在逐渐开展，并且也获得了可喜的成果［2 ］。
1沙棘杂交育种的研究沙棘雌雄异株，个体之间都存在差异。
通过杂交育种在F1代杂种群体中选择优系是目前沙棘育种的主要途径。
目前国内研究较多的为中国沙棘，它适应性强、生命力旺，具有刺多、果小、柄短等特点，利用杂种优势，选择纯合的亲本，将俄罗斯、蒙古大果无刺（少刺）、柄长沙棘与中国沙棘组合，选配杂交一代种子，发展生态经济型沙棘［3 ］。
黄铨从1993年开始，为选育生态经济型沙棘良种，进行了多种类型的杂交试验，其中“蒙古沙棘×中国沙棘”最有价值，在这个杂交组合中，亲本选配不同，杂种优势程度有别，以“乌兰沙林”为母本，以中国沙棘丰宁种源优良雄株为父本，效益最为显著。
从F1代杂种群体中，选出了优良无性系品种“华林1号”、“天水1号”等，用杂交种营造沙棘林，可显著提高沙棘的栽培利用价值［4 ］。
2沙棘引种培育及实生选种2.1引种培育1987年首先由中国林科院和天水水土保持试验站开始开展国外引种沙棘试验，这些材料大多大果、柄长、无刺或少刺，受到了较多重视。