UPLC法测定奈韦拉平的含量及有关物质

文献标识码： A
文章编号： 1009 － 3656（ 2015） － 4 － 268 － 3
Determination of Nevirapine and Ｒelated Substances by UPLC
Xue Qiaoru，Liang Weiyang* ，Luo Zhuoya（ Guangdong Institute for Food and Drug Ccontrol，Guangzhou 510180）
分别取奈韦拉平对照品和杂质 A，B，C 对照品 适量，精密 称 定，加 甲 醇 溶 解 并 制 成 各 含 4 μg · mL － 1 的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。依法 注入液相色谱仪，记录色谱图，各相邻峰间的分离度 均符合规定，色谱图见图 2，奈韦拉平及各杂质的理 论板数与分离度见表 1。
Abstract Objective： To establish an UPLC method for determination of Nevirapine and related substances. Method： The assay was performed on an Acquity UPLC TSS T3 C18 column （ 2. 1 mm × 50 mm，1. 8 μm） with the mobile phase of 10 mmol·L －1 ammonium dihydrogen phosphate （ pH 5. 0） -acetonitrile （ 80∶ 20） . The flow rate was 0. 7 mL·min －1 and the detection wavelength was 220 nm. Ｒesults： The linear response range of Nevirapine was 0. 16 － 0. 96 mg·mL －1 （ r = 0. 999，n = 6） ，the average recovery was 99. 6% with ＲSD of 2. 0% （ n = 9） . Conclusion： The method is rapid，simple，accurate and specific. Key words： UPLC； Nevirapine； assaying； related substance
用甲醇溶解并定量稀释成系列浓度的溶液。依法注 入液相色谱仪，记录色谱图，绘制标准曲线。结果表 明奈韦拉平在 0. 16 ～ 0. 96 mg·mL － 1 的范围内与峰 面 积 呈 良 好 的 线 性 关 系，回 归 方 程 为 Y = 4 721 447. 5X + 76 760. 8（ r = 0. 999） ； 杂质 A 在 0. 04 ～ 4. 0 μg·mL － 1 范围内与峰面积呈良好的线 性关 系，回 归 方 程 为 Y = 4 953. 5X + 2. 5 （ r = 1. 000） ； 杂质 B 在 0. 04 ～ 4. 0 μg·mL －1 范围内与峰 面积呈良好的线性关系，回归方程为 Y = 4 550. 1X + 6. 1（ r = 0. 999） ； 杂质 C 在 0. 04 ～ 4. 0 μg·mL －1 范围 内与峰 面 积 呈 良 好 的 线 性 关 系，回 归 方 程 为 Y = 4 550. 1X + 6. 1（ r = 1. 000） 。 2. 7 进样精密度试验
缩短为 13 min。经方法学考察和样品测定，结果表 明所建方法可准确测定奈韦拉平原料药的含量及有 关物质。
有关奈韦拉平的合成和制备方式国内外均有报 道，1991 年 Hargrave 等最早报道了奈韦拉平的合成 路线［7］。1995 年 Schneider 等 改 进 了 以 上 合 成 路 线［8］，主要体现在第 2 步化合物 3 与环丙胺反应时 添加了中和剂（ 碱土金属、锌氧化物或氢氧化物，如 氧化钙） ，以防止反应中生成的氯化氢与环丙胺成 盐，提高反应产率，并使用了无毒的高沸点溶剂二甘 醇二甲醚（ DMDE） ，该法由于收率高，污染少，已成 为国内外奈韦拉平工业化生产的主要方法。此后， 关于奈韦拉平的工业化制备合成工艺的改进均以此 方法为基础进行调整，主要涉及中间过程的步骤以 及反应物质和催化剂的改进等。
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1. 酸破坏； 2. 碱 破 坏； 3. 高 温 破 坏； 4. 氧 化 破 坏； 5. 光 照 破 坏； 6. 未经破坏
图 3 破坏试验色谱图（ 批号 C5021-12-045）
2. 6 线性关系考察 精密称取奈韦拉平、杂质 A，B，C 对照品适量，
校正 因子
1. 3 1. 0 1. 0 0. 9
2. 4 专属性试验 2. 4. 1 酸破坏 取供试品 20 mg，加 1 mol·L －1 盐酸 溶液 10 mL，室温放置 3 h，加 1 mol·L －1 氢氧化钠溶 液 10 mL 中和，加流动相至 50 mL，作为供试品溶液。 2. 4. 2 碱破坏 取供试品 20 mg，加 1 mol·L － 1 氢 氧化钠溶液 10 mL，室温放置 3 h，加 1 mol·L － 1 盐 酸溶液 10 mL 中和，加流动相至 50 mL，作为供试品 溶液。 2. 4. 3 高温破坏 取供试品 20 mg，加流动相 20 mL，水浴加热 3 h，加流动相至 50 mL，作为供试品 溶液。 2. 4. 4 氧化破坏 取供试品 20 mg，加流动相 20 mL，加浓过氧化氢溶液 1 mL，室温放置 3 h，加流动 相至 50 mL，作为供试品溶液。 2. 4. 5 光照破坏 取供试品 20 mg，加流动相 50 mL，置日光灯下光照 24 h，作为供试品溶液。
0. 16 ～ 0. 96 mg·mL －1 的范围内线性关系良好（ r = 0. 999，n = 6） ，平均回收率为 99. 6% ，ＲSD = 2. 0% （ n = 9） 。结论： 本方法快
速、简便、准确，专属性强。
关键词： 超高效液相色谱法； 奈韦拉平； 含量测定； 有关Байду номын сангаас质
中图分类号： Ｒ921. 2
杂质 A，B，C 均为原料合成过程中产生的主要 工艺杂质，结构式见图 1。国内外产品中均含有上 述三种已知杂质。
作者简介： 薛巧如，副主管药师； 研究方向： 生化药品的检验与质量控制。 作者简介： 梁蔚阳，主任药师； Tel： 020 － 81848209； E-mail： wl-1023@ 163. com
2 方法与结果 2. 1 色谱条件
色谱柱为 Acquity UPLC TSS T3 C18 （ 2. 1 mm × 50 mm，1. 8 μm） ； 流动相为 10 mmol·L － 1 磷酸二氢 铵溶液（ 取磷酸二氢铵 1. 15 g，加水 800 mL 使溶解， 用 1 mol·L － 1 氢氧化钠溶液调节 pH 值至 5. 0，再加 水稀释至 1 000 mL） -乙腈（ 80 ∶ 20） ； 柱温 35 ℃ ； 检 测波长 220 nm； 进样量 5 μL。 2. 2 溶液的制备 2. 2. 1 供试品溶液 精密称取供试品适量，加甲醇 溶解并制成每 1 mL 中含 0. 4 mg 的溶液，即得（ 必要 时可超声溶解） 。 2. 2. 2 对照溶液 精密量取供试品溶液 1 mL，置 100 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取 1 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀， 即得。 2. 3 系统适用性试验
Drug Standards of China 2015，Vol. 16 No. 4
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图 1 奈韦拉平主要杂质结构式
1 仪器与试药 Waters ACQUITY 超高效液相色谱系统。 奈韦拉平对照品（ 中国药品生物制品检定所，
批号 100641-200401，含 量 100% ） ； 杂 质 A 对 照 品 （ USP H1K372，含 量 100% ） ； 杂 质 B 对 照 品 （ USP H0J192，含量 100% ） ； 杂质 C 对照品（ EP 2957，含量 99. 4% ） ； 奈韦拉平原料药（ 企业 A，批号 C5021-12045，C5021-12-046，C5021-12-047； 企 业 B，批 号 120858，120859，120860； 企 业 C，批 号 1011001， 1009003，1006004； 企业 D，批号 1202013，1208079， 1208080） ； 乙腈为 Honeywell N70A1H 色谱纯，磷酸 二氢铵为分析纯，水为 millipore 超纯水。
奈韦拉平现行标准为 WS1 -（ X-064 ） -2005Z，未 对已知杂质进行控制； 国外标准《美国药典》35 版［3］ （ USP 35） 、《英国药典》2012 年版［4］（ BP 2012） 、《欧 洲药典》7. 0 版［5］（ EP 7. 0） 、《国际 药 典》4. 0 版［6］ （ IP 4. 0） 均有收载，且采用 HPLC 法对已知杂质 A， B，C 均进行了控制，分析时间规定约为 80 min。为 缩短测试时间，减少试剂消耗，本实验采用超高效液 相系统（ UPLC） 对现行标准进行了优化，分析时间
破坏性试验的结果表明奈韦拉平具有较好的稳 定性，见图 3。上述供试品溶液测定结果与未经破 坏的供试品溶液的主峰面积基本相当，表明在该条 件下，奈韦拉平相对稳定，且该条件下奈韦拉平与相 邻峰均有较好的分离，满足测定要求。 2. 5 检测限与定量限
在上述色谱条件下，取“2. 3”项下系统适用性 试验溶液逐步稀释，按信噪比 S / N≈3 测定检出限， 按信噪比 S / N≈10 测定定量限。结果杂质 B，奈韦 拉平、杂质 A 的检出限为 0. 01 μg·mL － 1 ，定量限为 0. 03 μg·mL － 1 ； 杂质 C 的检出限和定量限分别为 0. 012 μg·mL － 1 和 0. 036 μg·mL － 1 。
奈韦拉平（ nevirapine） 是一种新型人体免疫缺 陷病毒（ HIV-1） 的非核甘类逆转录酶抑制剂，奈韦 拉平与 HIV-1 的逆转录酶直接连接并且通过使此酶 的催化端破裂来阻断 ＲNA 依赖和 DNA 依赖的 DNA 聚合酶活性，从而抑制逆转录酶活性，减少病毒复制， 降低病毒对机体功能的破坏。该药品由德国 Boehringer Ingelheim 公 司 研 发，于 1994 年 获 得 美 国 专 利［1］，1996 年 9 月美国 FDA 批准 上 市，商 品 名 Viramune，主要 用 于 艾 滋 病 的 预 防 和 治 疗［2］。 该 药 品 2001 年进入我国，目前国内也有药品生产企业生产。
图 2 系统适用性试验色谱图
表 1 系统适用性试验结果
成分
杂质 B 奈韦拉平 杂质 A 杂质 C
保留时间 相对保留
/ min
时间
0. 796 1. 170 1. 945 3. 821
0. 68 1. 00 1. 66 3. 27
理论 板数
7 490 8 037 8 954 9 599
分离 度
/ 8. 6 11. 8 15. 9
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·方法学研究·
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UPLC 法测定奈韦拉平的含量及有关物质
薛巧如，梁蔚阳* ，罗卓雅（ 广东省食品药品检验所，广州 510180）
摘要 目的： 改进奈韦拉平的含量和有关物质测定方法。方法： 采用 Acquity UPLC TSS T3 C18 （ 2. 1 mm × 50 mm，1. 8 μm） ，流 动相为 10 mmol·L － 1 磷酸二氢铵溶液（ pH 5. 0） -乙腈（ 80∶ 20） ，流量为 0. 7 mL·min － 1 ，检测波长为 220 nm。结果： 奈韦拉平在