UPLC法测定奈韦拉平的含量及有关物质

用甲醇溶解并定量稀释成系列浓度的溶液。依法注 入液相色谱仪，记录色谱图，绘制标准曲线。结果表 明奈韦拉平在 0. 16 ～ 0. 96 mg·mL － 1 的范围内与峰 面 积 呈 良 好 的 线 性 关 系，回 归 方 程 为 Y = 4 721 447. 5X + 76 760. 8（ r = 0. 999） ； 杂质 A 在 0. 04 ～ 4. 0 μg·mL － 1 范围内与峰面积呈良好的线 性关 系，回 归 方 程 为 Y = 4 953. 5X + 2. 5 （ r = 1. 000） ； 杂质 B 在 0. 04 ～ 4. 0 μg·mL －1 范围内与峰 面积呈良好的线性关系，回归方程为 Y = 4 550. 1X + 6. 1（ r = 0. 999） ； 杂质 C 在 0. 04 ～ 4. 0 μg·mL －1 范围 内与峰 面 积 呈 良 好 的 线 性 关 系，回 归 方 程 为 Y = 4 550. 1X + 6. 1（ r = 1. 000） 。 2. 7 进样精密度试验
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1. 酸破坏； 2. 碱 破 坏； 3. 高 温 破 坏； 4. 氧 化 破 坏； 5. 光 照 破 坏； 6. 未经破坏
图 3 破坏试验色谱图（ 批号 C5021-12-045）
2. 6 线性关系考察 精密称取奈韦拉平、杂质 A，B，C 对照品适量，
文献标识码： A
文章编号： 1009 － 3656（ 2015） － 4 － 268 － 3
Determination of Nevirapine and Ｒelated Substances by UPLC
Xue Qiaoru，Liang Weiyang* ，Luo Zhuoya（ Guangdong Institute for Food and Drug Ccontrol，Guangzhou 510180）
校正 因子
1. 3 1. 0 1. 0 0. 9
2. 4 专属性试验 2. 4. 1 酸破坏 取供试品 20 mg，加 1 mol·L －1 盐酸 溶液 10 mL，室温放置 3 h，加 1 mol·L －1 氢氧化钠溶 液 10 mL 中和，加流动相至 50 mL，作为供试品溶液。 2. 4. 2 碱破坏 取供试品 20 mg，加 1 mol·L － 1 氢 氧化钠溶液 10 mL，室温放置 3 h，加 1 mol·L － 1 盐 酸溶液 10 mL 中和，加流动相至 50 mL，作为供试品 溶液。 2. 4. 3 高温破坏 取供试品 20 mg，加流动相 20 mL，水浴加热 3 h，加流动相至 50 mL，作为供试品 溶液。 2. 4. 4 氧化破坏 取供试品 20 mg，加流动相 20 mL，加浓过氧化氢溶液 1 mL，室温放置 3 h，加流动 相至 50 mL，作为供试品溶液。 2. 4. 5 光照破坏 取供试品 20 mg，加流动相 50 mL，置日光灯下光照 24 h，作为供试品溶液。
Drug Standards of China 2015，Vol. 16 No. 4
中国药品标准 2015 年第 16 卷第 4 期 269
图 1 奈韦拉平主要杂质结构式
1 仪器与试药 Waters ACQUITY 超高效液相色谱系统。 奈韦拉平对照品（ 中国药品生物制品检定所，
批号 100641-200401，含 量 100% ） ； 杂 质 A 对 照 品 （ USP H1K372，含 量 100% ） ； 杂 质 B 对 照 品 （ USP H0J192，含量 100% ） ； 杂质 C 对照品（ EP 2957，含量 99. 4% ） ； 奈韦拉平原料药（ 企业 A，批号 C5021-12045，C5021-12-046，C5021-12-047； 企 业 B，批 号 120858，120859，120860； 企 业 C，批 号 1011001， 1009003，1006004； 企业 D，批号 1202013，1208079， 1208080） ； 乙腈为 Honeywell N70A1H 色谱纯，磷酸 二氢铵为分析纯，水为 millipore 超纯水。
图 2 系统适用性试验色谱图
表 1 系统适用性试验结果
成分
杂质 B 奈韦拉平 杂质 A 杂质 C
保留时间 相对保留
/ min
时间
0. 796 1. 170 1. 945 3. 821
0. 68 1. 00 1. 66 3. 27
理论 板数
7 490 8 037 8 954 9 599
分离 度
/ 8. 6 11. 8 15. 9
奈韦拉平现行标准为 WS1 -（ X-064 ） -2005Z，未 对已知杂质进行控制； 国外标准《美国药典》35 版［3］ （ USP 35） 、《英国药典》2012 年版［4］（ BP 2012） 、《欧 洲药典》7. 0 版［5］（ EP 7. 0） 、《国际 药 典》4. 0 版［6］ （ IP 4. 0） 均有收载，且采用 HPLC 法对已知杂质 A， B，均进行了控制，分析时间规定约为 80 min。为 缩短测试时间，减少试剂消耗，本实验采用超高效液 相系统（ UPLC） 对现行标准进行了优化，分析时间
奈韦拉平（ nevirapine） 是一种新型人体免疫缺 陷病毒（ HIV-1） 的非核甘类逆转录酶抑制剂，奈韦 拉平与 HIV-1 的逆转录酶直接连接并且通过使此酶 的催化端破裂来阻断 ＲNA 依赖和 DNA 依赖的 DNA 聚合酶活性，从而抑制逆转录酶活性，减少病毒复制， 降低病毒对机体功能的破坏。该药品由德国 Boehringer Ingelheim 公 司 研 发，于 1994 年 获 得 美 国 专 利［1］，1996 年 9 月美国 FDA 批准 上 市，商 品 名 Viramune，主要 用 于 艾 滋 病 的 预 防 和 治 疗［2］。 该 药 品 2001 年进入我国，目前国内也有药品生产企业生产。
2 方法与结果 2. 1 色谱条件
色谱柱为 Acquity UPLC TSS T3 C18 （ 2. 1 mm × 50 mm，1. 8 μm） ； 流动相为 10 mmol·L － 1 磷酸二氢 铵溶液（ 取磷酸二氢铵 1. 15 g，加水 800 mL 使溶解， 用 1 mol·L － 1 氢氧化钠溶液调节 pH 值至 5. 0，再加 水稀释至 1 000 mL） -乙腈（ 80 ∶ 20） ； 柱温 35 ℃ ； 检 测波长 220 nm； 进样量 5 μL。 2. 2 溶液的制备 2. 2. 1 供试品溶液 精密称取供试品适量，加甲醇 溶解并制成每 1 mL 中含 0. 4 mg 的溶液，即得（ 必要 时可超声溶解） 。 2. 2. 2 对照溶液 精密量取供试品溶液 1 mL，置 100 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取 1 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀， 即得。 2. 3 系统适用性试验
破坏性试验的结果表明奈韦拉平具有较好的稳 定性，见图 3。上述供试品溶液测定结果与未经破 坏的供试品溶液的主峰面积基本相当，表明在该条 件下，奈韦拉平相对稳定，且该条件下奈韦拉平与相 邻峰均有较好的分离，满足测定要求。 2. 5 检测限与定量限
在上述色谱条件下，取“2. 3”项下系统适用性 试验溶液逐步稀释，按信噪比 S / N≈3 测定检出限， 按信噪比 S / N≈10 测定定量限。结果杂质 B，奈韦 拉平、杂质 A 的检出限为 0. 01 μg·mL － 1 ，定量限为 0. 03 μg·mL － 1 ； 杂质 C 的检出限和定量限分别为 0. 012 μg·mL － 1 和 0. 036 μg·mL － 1 。
缩短为 13 min。经方法学考察和样品测定，结果表 明所建方法可准确测定奈韦拉平原料药的含量及有 关物质。
有关奈韦拉平的合成和制备方式国内外均有报 道，1991 年 Hargrave 等最早报道了奈韦拉平的合成 路线［7］。1995 年 Schneider 等 改 进 了 以 上 合 成 路 线［8］，主要体现在第 2 步化合物 3 与环丙胺反应时 添加了中和剂（ 碱土金属、锌氧化物或氢氧化物，如 氧化钙） ，以防止反应中生成的氯化氢与环丙胺成 盐，提高反应产率，并使用了无毒的高沸点溶剂二甘 醇二甲醚（ DMDE） ，该法由于收率高，污染少，已成 为国内外奈韦拉平工业化生产的主要方法。此后， 关于奈韦拉平的工业化制备合成工艺的改进均以此 方法为基础进行调整，主要涉及中间过程的步骤以 及反应物质和催化剂的改进等。
中国药品标准 2015 年第 16 卷第 4 期 268
·方法学研究·
Drug Standards of China 2015，Vol. 16 No. 4
UPLC 法测定奈韦拉平的含量及有关物质
薛巧如，梁蔚阳* ，罗卓雅（ 广东省食品药品检验所，广州 510180）
摘要 目的： 改进奈韦拉平的含量和有关物质测定方法。方法： 采用 Acquity UPLC TSS T3 C18 （ 2. 1 mm × 50 mm，1. 8 μm） ，流 动相为 10 mmol·L － 1 磷酸二氢铵溶液（ pH 5. 0） -乙腈（ 80∶ 20） ，流量为 0. 7 mL·min － 1 ，检测波长为 220 nm。结果： 奈韦拉平在
杂质 A，B，C 均为原料合成过程中产生的主要 工艺杂质，结构式见图 1。国内外产品中均含有上 述三种已知杂质。
作者简介： 薛巧如，副主管药师； 研究方向： 生化药品的检验与质量控制。 作者简介： 梁蔚阳，主任药师； Tel： 020 － 81848209； E-mail： wl-1023@ 163. com
0. 16 ～ 0. 96 mg·mL －1 的范围内线性关系良好（ r = 0. 999，n = 6） ，平均回收率为 99. 6% ，ＲSD = 2. 0% （ n = 9） 。结论： 本方法快
速、简便、准确，专属性强。