抗生素微生物检定法
抗生素微生物检定法讲解学习
试验准备
试验准备
管碟法的操作底层的制备： 每碟加底层培养基20ml，
待培养基凝固后，盖上 陶瓦盖，置35~37℃培 养箱中，待用。 ▪ 菌层的制备： 加入约含1%浓度菌悬液的 培养基5ml作为菌层
管碟法的操作步骤
▪ 加钢圈 ▪ 滴加抗生素溶液
培养
▪ 温度：一般为 36~37℃
▪ 对复方制剂产品的检验，微生物检定法选 择性差，效价测定受其他成分的影响。
▪ 如：妥布霉素滴眼液，配方中含苯扎溴胺 作为防腐剂，苯扎溴胺具有抑菌作用，使 样品的抑菌圈增大，导致标准品和样品的 剂量反应曲线偏离，无法测准妥布霉素的 含量。
抗生素微生物检定法分类
▪ 1.稀释法 ▪ 2.浊度法 ▪ 3.琼脂扩散法（管碟法和打孔法） ▪ 2010版药典采用管碟法和浊度法来测定抗
测定不同浓度的抗生 素溶液在固体培养基 表面产生的抑菌圈的 大小
目的 抗生素最低抑菌浓 抗生素抑菌效力的测定 度（MIC）的测定
应用 用于新药研制及临 抗生素效力的测定方法 床药敏试验等方面
抗生素微生物检定法 包括管碟法和浊度法
▪ 管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的 固体培养基内成球面形扩散，形成含一定 浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖 而呈现出透明的抑菌圈。根据抗生素在一 定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径 （面积）呈直线关系而设计，通过检测抗 生素对微生物的抑制作用，比较标准品与 供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品 的效价。
会影响抗生素效价的测定
管碟法
▪ 利用抗生素在固体培 养基中的平面扩散作 用，依据量反应平行 原理并采用交叉实验 设计方法。在相同的 试验条件下通过比较 标准品（已知效价） 和供试品两者对所接 种试验菌产生的抑菌 圈（直径或面积）的 大小来测定供试品效 价的一种方法
抗生素微生物检定管碟法
抗生素微生物检定管碟法抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。
各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。
抗生素微生物检定法讲解学习
结果计算及判断
结果计算及判断
▪ 抑菌圈的测量以及结 果的可靠性检验及效 价测定
多功能微生物自动测量分析仪
结果可靠性分析
▪ 试品间（F1）：供试品的估计效价是 否合适。P＞0.05
▪ 回归（F2）：剂量反应关系是否成立。 P＜0.01
▪ 偏离平行（F3）：量反应直线的斜率 是否有显著差异。P＞0.05
▪ 剂间（F6）：不同浓度间的差异是否 显著。P＜0.01
▪ 碟间（F7）：同一浓度间差异是否显 著。 P＞0.05
结果计算及判断
▪ 重试判定
▪ 抑菌圈大小的要求
▪ 可靠性检验：符合可靠性检验的各项规定
▪ 可信限率：供试品效价测定结果（PT）的 可信限率除特殊规定外，不得大于5%。
▪ 实测效价与估计效价：应在90~110%之间， 否则结果仅作为初试，应予以重试。
▪ 效价测定结果不符合规定时，需换人加倍 复试。
二剂量法计算
P=log1T T2 2 T S12ST21 S S1 1I100%
结果计算及判断
检定的影响因素
▪ 标准品与供试品的同质性 ▪ 抑菌圈质量的控制 ▪ 直线斜率的控制 ▪ 直线截距的控制
抑菌圈的形状
试验中抑菌圈常有破裂、不远、甚 至无圈的现象： ▪ 在滴加抗生素溶液时药液溅出、碰到 钢管壁引起漏液，导致不圆 ▪ 双碟、钢管等残留抗生素或清洁液 ▪ 试验菌菌龄过老、检定菌被烫死等 ▪ 缓冲盐的Ph值和盐浓度影响扩散
试验准备
试验准备
管碟法的操作步骤
▪ 培养基的制备
管碟法的操作步骤
▪ 底层的制备： 每碟加底层培养基20ml，
待培养基凝固后，盖上 陶瓦盖，置35~37℃培 养箱中，待用。 ▪ 菌层的制备： 加入约含1%浓度菌悬液的 培养基5ml作为菌层
抗生素微生物检定法的增修订内容及操作要点
该方程奠定了管碟法量－反应直线公式 的基础。
将上述公式简化、移行，并将自然对数 转换为常用对数得：
lg M 1 r 2 lg C'4DTH
9.21DT
上述公式表明，抗生素总量的对数(lgM) 与所形成的抑菌圈半径的平方(r2)呈直 线关系，即通过抑菌圈的大小来测定抗 生素抗菌活性物质的量。
抗生素微生物检定法的增修订 内容及操作要点
抗生素微生物检定法
1．抗生素微生物检定法的概况 2．微生物效价测定法国内外药典的比较 3．微生物效价测定法的操作要点 4．微生物效价检定法的建立和方法学验 证
1．抗生素微生物检定法的概 况
1．1．定义 抗生素圈边缘清晰度是影响测定结果的重要因素之一， 导致抑菌圈边缘不清晰的原因如下：
➢ 在抑菌圈形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均 一，不符合动力学公式中各项之间的关系或各扩散 系统交叉所致。
（4）化学稳定性较差的抗生素，由于降解导致供 试品与标准品不同质。
（5）操作上可能引入的误差。
3.1.2.2．抑菌圈质量的控制
（1） 抑菌圈的形状：
实验中抑菌圈常有圈破裂、不圆、甚至无圈的现 象，其原因是多方面的:
➢ 在滴加抗生素溶液时药液溅出、毛细滴管碰到钢 管壁使抗生素溶液漏出，出现不圆等；
➢ 操作中若各钢管中加液时间不同，可影响抑菌 圈的大小，所以一组双碟加样时，应尽量缩短 加样间隔时间，并保持加样速度的均匀性，以 减少误差。
➢ 抑菌圈的大小还受抗生素扩散系数的影响，若 在缓冲液中加入0.3%的氯化钠或在培养基中加 一定量的盐或吐温，可增加抗生素的扩散能力， 使抑菌圈增大。
（3） 抑菌圈边缘清晰度的控制
抗生素微生物检定法.ppt
抗生素微生物检定法
抗生素微生物检定法work Information Technology Company.2020YEAR抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验（标准曲线法除外）。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
（一）基本设备、用具、试验材料及标准品1. 基本设备（1）抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。
该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
（2）超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。
（3）抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2. 用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16~17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。
新购的双碟应按上述要求进行检查。
检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140~160 ℃干热灭菌2小时后备用。
（2）陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
（3）不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
（4）小钢管放置器：四孔和六孔各一台。
（5）游标卡尺：精密度0.02mm。
（6）滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。
第七章 抗生素微生物检定法
2
管碟琼脂扩散法
抗生素管碟测定法是利用抗生素在摊布特定试 验菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含一定 浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现
透明的抑菌圈。
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该法根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂 量与抑菌圈的直径或面积呈线性关系，通过比较 标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试 品的效价。
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（2）三剂量法
取双碟六个，在每个双碟内间隔的3个不锈钢管中 分别滴加高、中及低浓度的标准液，其余两个不锈 钢管中分别滴加高、中及低浓度的供试品溶液。三 个浓度的剂距比为1：0.8。35-37℃ 培养14-16h， 用游标卡尺测量抑菌圈直径。
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7、结果判定
实验计算所得效价低于估计效价的90%或高
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无菌检查法
3、随机抽取2份样品，无菌接种后，
分别在30-35℃和20-25℃培养7日。 4、结果判定： 无菌生长为符合规定。
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第七章 抗生素微生物检定法 无菌检查法
第一部分 抗生素微生物检定法 第二部分 无菌检查法
1
第一节 抗生素微生物检定法
本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用， 比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑 菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 依试验设计原理不同，分为稀释法、比浊法、 琼脂扩散法。 中国兽药典采用管碟琼脂扩散法。
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6、检定法
（1）二剂量法 取双碟四个，在每个双碟内对角线2个不锈钢管 中分别滴加高浓度及浓度的标准液，其余两个不 锈钢管中分别滴加高浓度及低浓度的供试品溶液。 高、低浓度的剂距比为2：1或4：1。35-37℃ 培 养14-16h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。滴加抗 生素溶液：滴加溶液至钢管口平满，滴加溶液间 隔时间不可过长 。
抗生素微生物检定法(实习总结)
抗生素微生物检定学习报告及总结抗生素微生物检定法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
管碟法（二剂量）测定抗生素的效价管碟法（cylinder plate method）是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管,管内放入标准品和检品的溶液，经16～18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。
抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
1 实验材料1.1 实验试剂抗生素检定培养基Ⅱ号、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、0.9%灭菌生理盐水1.2 实验菌株及样品菌株为藤黄微球菌菌悬液，样品为车间生产的酒石酸泰乐菌素干粉。
1.3 实验仪器及设备玻璃烧杯、容量瓶、直径90mm的玻璃培养皿、刻度吸管、移液管、胶头吸管、不锈钢管（内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm）、镊子、菌株培养茄瓶、三角烧瓶、温度计、多功能微生物自动测量分析仪、微波炉、恒温培养箱、电热鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、2 实验方法2.1 实验用菌株制备提前将藤黄微球菌接种于茄瓶斜面培养基，置30℃左右温箱培养2～3天后取出放4℃储存。
用时取出茄瓶于无菌环境下无菌操作，向茄瓶内加入5ml 0.9%灭菌生理盐水，轻轻摇动茄瓶，将斜面细菌洗下制备成一定浓度的菌悬液（浓度大小以最终产生的抑菌圈大小在16～18mm之间而定）。
2.2 抗生素检定培养基的配制准确称取抗生素检定培养基Ⅱ号26.5g倒入三角烧瓶中，加入1000ml纯化水，混匀后塞上塞子，以牛皮纸包扎后于115℃高压蒸汽灭菌30分钟备用。
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抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验（标准曲线法除外）。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
（一）基本设备、用具、试验材料及标准品1. 基本设备（1）抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。
该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
（2）超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。
（3）抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2. 用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16~17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。
新购的双碟应按上述要求进行检查。
检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140~160 ℃干热灭菌2小时后备用。
（2）陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
（3）不锈钢小管：外径±，内径±，高±，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
（4）小钢管放置器：四孔和六孔各一台。
（5）游标卡尺：精密度。
（6）滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。
3. 试验材料（1）培养基及其制备方法以下培养基、缓冲液制备时，均以115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅰ胨 5g 磷酸氢二钾 3g 水 1000ml牛肉浸出粉 3g 琼脂 15~20g除琼脂外，混合上述成分，调节PH使比最终的PH值略高~，加入琼脂，加热溶化后滤过（用纸浆减压滤过或纱布棉花滤过），调节PH值使灭菌后为~或~，分装，灭菌。
培养基Ⅱ胨6g 酵母浸出粉6g 琼脂 15~20g牛肉浸出粉葡萄糖 1g 水 1000ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节PH使比最终的PH值略高~，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为~或~，分装，灭菌。
培养基Ⅲ胨 5g 氯化钠葡萄糖 1g牛肉浸出粉磷酸氢二钾水 1000ml酵母浸出粉 3g 磷酸二氢钾除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH 值使灭菌后为~，分装，灭菌。
培养基Ⅳ胨 3g 酵母浸出粉 3g 水 1000ml葡萄糖 1g 琼脂15~20g除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节PH使其比最终的PH值略高~，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为~，分装，灭菌，趁热斜放使凝固成斜面。
培养基Ⅴ胨 6g 酵母浸出粉 2g 琼脂 15~20g牛肉浸出粉 2g 葡萄糖 3g 水 1000 ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节PH使其比最终的PH值略高~，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为~，分装，灭菌。
培养基Ⅵ蛋白胨牛肉浸出粉葡萄糖酵母膏氯化钠水 1000ml除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节ＰＨ值使灭菌后为，分装，灭菌。
营养琼脂培养基胨 10g 琼脂 15~20g 氯化钠 5g 肉浸液 1000ml(牛肉浸出粉3g,加水1000ml，配成溶液代替)除琼脂外，混合上述成分，调节PH使比最终的PH值略高～，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节PH值使灭菌后为～，分装，灭菌，趁热斜放使凝固成斜面。
改良马丁琼脂培养基胨葡萄糖水 1000ml硫酸镁酵母浸出粉磷酸氢二钾琼脂 15～20g除葡萄糖和琼脂外，混合上述成分，微温溶解，调节PH值约为，加入琼脂，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为±，分装，灭菌，趁热斜放使凝固成斜面。
培养基可以采用相同成分的干燥培养基代替，临用时，照使用说明配制和灭菌，备用。
注意事项：①制备培养基的原材料，特别是胨、牛肉浸膏和琼脂等对抑菌圈的大小与边缘的清晰度有影响，故应预先进行试验，挑选使用。
②不得在操作抗生素的实验室内配制培养基。
配制培养基所用的器皿应与接触抗生素的器皿严格分开，以免污染抗生素。
③培养基中的琼脂用量要随气候冷暖不同而增减。
一般夏季用琼脂的量比冬季多，其用量多少以培养基的硬度适宜为度。
④培养基在加热煮沸后所蒸发的水分必须用蒸馏水补足。
⑤培养基灭菌后，应放于37℃培养箱中培养24～48小时,证明无菌后方可使用。
使用期限约为1个月，不宜保存过久，以免营养价值降低。
⑥制成的培养基倒入双碟内凝固后应透明，不得有沉淀。
（2）缓冲液磷酸盐缓冲液（）：取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml,滤过，分装，灭菌。
磷酸盐缓冲液（）：曲磷酸氢二钠与磷酸二氢钾,加水使成1000ml，滤过，分装，灭菌。
磷酸盐缓冲液（）：取磷酸氢二钾与磷酸二氢钾，加水使成1000ml，滤过，分装，灭菌。
[附注]配制缓冲液所用化学试剂的规格应为分析纯试剂。
（3）试验用菌种：试验用菌种对被测定的抗生素应具有高度的敏感性，在一般培养基上能生长繁殖，易于保存，不应变异或变异性小，无致病性，具有敏锐的生化培养特性，能适合多种抗生素的检定，最好是芽胞菌，因芽胞菌制备成悬液易于保存，不易变异，使用时间长。
①试验用菌种的保存：卫生部药品生物制品检定所提供的菌种为冷冻干燥菌种，可保存在5℃的冰箱内。
以无菌操作启开冻干菌种，接种在普通琼脂斜面上，置37℃培养箱中培养20～22小时。
取出放至室温后，放入5℃冰箱中保存，即为试验用菌种。
试验用菌种每月传代一次，每季度平板分离一次。
②菌种的接种方法：从冰箱中取出菌种1支，放至室温。
另取新鲜制备的普通琼脂斜面1支（如琼脂斜面已干燥无凝结水者，则不可使用），注明菌名、接种日期，与菌种斜面一同放于预先用1‰新洁尔灭溶液擦拭过，并用紫外线灯照射30分钟后的工作台上（或超净工作台内）。
操作人员用新洁尔灭溶液洗手，然后按无菌操作要求开始接种。
先将菌种斜面和待接种的培养基斜面试管口上的棉花塞通过酒精灯火焰稍稍扭动一下，以免接种时不易拔出棉塞。
用左手握住菌种斜面和待接种的培养基斜面，将试管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，在火焰上将接种环烧红约30秒钟，然后将全部金属棒通过火焰往返3次，用右手无名指及小指同时将菌种斜面和待接种的培养基斜面试管口的棉塞拔出，并将两支试管口在火焰上通过一下，立即将接种环伸入菌种斜面管内，先在近管壁的琼脂培养基表面上靠一下，使稍冷却，再移至菌苔上刮取少量菌苔，迅速将接种棒取出，并立即伸入到待接种的培养基斜面管内，由下至上在培养基斜面上轻轻曲折移动1次，取出接种棒，立即在火焰旁将原来的棉塞塞上，然后将接种棒上的残余细菌在火焰上烧灼，烧灼时应先将接种环离沾菌处的远端烧灼，使其传热至沾菌处，待菌苔已枯焦、炭化后，才能直接烧灼，切不可直接猛火烧灼沾菌处，以防细菌溅出。
接种完毕后，将细菌管置37℃培养箱内培养22～24小时（霉菌管一般置26～27℃培养箱内培养7天）。
取出放冷至室温后，放入5℃冰箱中保存。
③试验用菌液的制备和保存枯草芽孢杆菌悬液取枯草芽胞杆菌[CMCC(B)63501或CVCC717]的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。
用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
（取枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]试验用菌种斜面1支，按无菌操作要求加入灭菌水2ml，将菌苔洗下，摇匀，取出1ml接种于盛有30ml普通琼脂培养基的100ml三角瓶中，旋转三角瓶使全部琼脂培养基表面被菌液浸润，多余的菌液用吸管吸出弃入5%石炭酸消毒液中。
将已接种的三角瓶置35～37℃的培养箱中培养7～10天，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml洗下芽孢，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得。
置5℃冰箱中保存，可使用6个月。
）短小芽孢杆菌悬液取短小芽孢杆菌[CMCC(B)63202或CVCC709]的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌悬液取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003或CVCC1882]的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水或%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
（取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]试验用菌种斜面1支，用接种棒取培养物接种至10ml培养基Ⅲ中，接种时在靠近培养基液面的试管壁上摩擦，使菌苔均匀混悬于液体培养基中，在35～37℃培养箱中培养16～18小时，取出，应成均匀的悬液，无菌膜及凝集沉淀，此菌液仅供当日使用。
）藤黄微球菌（藤黄八叠球菌）悬液取藤黄微球菌[CMCC(B)28001或CVCC1600]德营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
（取藤黄八叠球菌[CMCC(B)28001]试验菌种斜面1支，加入2ml培养基Ⅲ，将菌苔洗下，摇匀，取出1ml接种于盛有30ml普通琼脂培养基的100ml三角瓶中，旋转三角瓶使全部琼脂培养基表面被菌液浸润，多余的菌液用吸管吸出弃入5%石炭酸消毒液中，将已接种的三角瓶置26～27℃培养箱中培养24小时，用5ml培养基Ⅲ将菌苔洗下制成均匀的悬液。
此悬液在5℃冰箱中保存可使用1个月。
）大肠杆菌悬液取大肠杆菌[CMCC(B)44103或CVCC2801]的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
双碟的制备：取直径约90mm、高16～17mm的平底双碟，用灭菌大口吸管分别注入加热融化的培养基20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。
另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入规定的试验菌悬液适量（能得到清晰的抑菌圈为度。
二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm），充分摇匀，用灭菌大口吸管在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。
放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径±，高±，外径±）4个（二剂量法）或6个（三剂量法），用陶瓦圆盖覆盖备用。