DNA探针
DNA分子荧光探针的种类及特点概述
３ 食 品防腐剂 的发展趋 势 目前世界各 国都在致力 于研究更加 高效安 全 的天
然食 品防腐剂 ，使其进一步在 市场上推广 ，而天 然防腐 剂势必会逐渐 代替 化学 防腐剂 。例 如 ，常用 于 肉类 保 鲜的化学防腐剂硝酸盐在还原菌 的作用 下所产 生 的亚 硝酸盐与 肉类蛋 白质来源 的胺类发生反 应可生成 亚硝 胺 ，后者在体 内的代谢产物具有致癌性 ，而天然 防腐 剂 曲酸则可 以有效抑 制亚硝 酸盐转 化为 亚硝胺 ，从 而 抑制致癌物 的产生 。研究 表 明 ，天然 防腐剂 不 仅对 人 体无害 ，而且还有一定 的营养价值 。因此 ，天然 防腐 剂 已经受到普 遍关 注 ，并被 广泛应 用 。但 针对 天然 防 腐 剂 的应 用研究 仍然 有着诸 多亟需克 服 的问题 ，如 从 动植物 中分离纯化较 困难 以及产 品成本 高等 。各种 防 腐 剂都有 一定 的作用 范围 ，没有 一种 防腐剂 能够抑 制 一 切腐败 性微 生物 ，考 虑到各种 防腐 剂 自身特 性 的差 异和应 用上 的局 限，天然食 品防腐剂 未来研 究 和发展 的方 向是将几 种不 同来 源 、不 同 品种 的天然 防腐剂 与 化学防腐剂配合使用 ，减少化学 防腐剂 的使用量 ，并结 合有效 的灭菌 方法 达到杀 菌抑 菌效果 ，从 而协 同多 种防腐剂 的优势 ，获得更好 的防腐 和安 全效果 ，进一步 保障饮食 的卫生 、健康 和安全。
荧光探 针与 ＤＮＡ分子之间主要有 三种作用方式 ： 静 电作用 、嵌 插作用 和 沟槽作 用 。 目前 用于 研究 和测 定 ＤＮＡ分子的荧 光探针有很多种 ，主要包括有 机荧光 染料类 、金属离 子类 、金 属离 子配 合物 类 、纳米 粒 子类
和量 子点类等 ＤＮＡ分子荧 光探针 。 １ 源自有机荧光染料类荧光探针及 其特点
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
DNA 探针技术
DNA 探针技术一、DNA 探针技术的主要内容两条不同来源的核酸单链如果在一定区段具有互补的碱基序列,或者说具有一定的同源性,就可以特异地结合,形成双链杂种分子,这种合称为核酸分子杂交。
如果用已知核酸(通常是DNA)片段作为探针,通过与未知核酸(DNA或RNA)样品进行杂交试验,根据两者杂交状况的分析,就可以确定它们同源性程度,检测特定核苷酸序列在样品中的存在及含量。
这便是D N A 探针分析的基本原理。
按照单链核酸样品所处的状态,核酸分子杂交一般区分为液相杂交、固相杂交和原位杂交三类,目前应用较遍的是后两类。
固相杂交中,对DN A待测样品用限制性内切酶水解,得到的各片段按子量大小经凝胶电泳分离,变性(解旋)成单链后通过毛细管现象从凝胶吸印到硝酸纤维薄膜上,固定后即可与DNA探针迸行杂交试验。
此法因其发明者命名为s o u t h e r n印溃杂交。
按照相似的原理与操作步骤分析R NA样品,则称No r-the r n印渍杂交(No rthe r n是对应So u the r n所起的趣名,不是指发明者的姓氏)。
固相杂交另法,是把核酸样品变性后,用点状加样法固定在硝酸纤维薄膜上,再DNA探针杂交,这称为斑点杂交。
原位杂交指不改变待测核酸在细胞内原始位置,DNA探针与固定在组织、细胞或染色体的核酸样品进行杂交的方法。
菌落或噬菌斑杂交,是把生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按其原来位置不变地转移到薄膜上,并在原位发生溶菌、D NA变性和杂交过程,所以属于原位杂交类型。
针对不同分析对象选择不同杂交方式,可以满足核酸分析不同要求,拓宽了D NA探针的应用范围。
二、DNA 探针技术的主要应用1.用于墓因工程和分子生物学研究作为生物技术核心的基因工程(重组DNA技术)是7 0年代兴起的、按人们意愿定向改造生物遗传性状的高技术。
其主要步骤是取得目的DNA,与载体DN A体外重组,将重组DNA分子导人宿主细胞,筛选能够表达重组DNA的细胞加以传代扩增。
DNA分子杂交技术
DNA分子杂交技术在高中生物教材中，多次提到DNA分子杂交技术，但对于DNA分子杂交技术所用到的工具、依据的原理及应用领域等都只是一带而过，让许多教师和学生深感疑惑，从而导致对此知识理解不深，造成教学和学习上的困难。
在此，笔者对其在高中生物教材中出现过的一些内容进行补充介绍，以期加深理解，达到解疑释惑的目的。
1、什么叫DNA分子杂交技术？DNA分子杂交技术又称DNA探针技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。
2、DNA分子杂交技术的原理DNA分子杂交的原理是,具有互补碱基序列的DNA分子,可以通过碱基对之间形成氢键等,形成稳定的双链区。
在进行DNA分子杂交前,先要将两种生物的DNA分子从细胞中提取出来,再通过加热或提高pH的方法,将双链DNA分子分离成为单链,这个过程称为变性。
然后,将两种生物的DNA单链放在一起杂交,其中一种生物的DNA单链事先用同位素进行标记。
如果两种生物DNA分子之间存在互补的部分,就能形成双链区。
由于同位素被检出的灵敏度高,即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区,也能够被检出。
3、DNA分子杂交技术的工具 ------ ＤＮＡ探针DNA探针是利用放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记的特定DNA片断，该片断可大至寄生虫基因组DNA，小至20个碱基。
DNA探针具有特异性；由于用放射性同位素（如32P）或生物素标记探针，使杂交试验同时具有高度的敏感性。
4、DNA分子杂交技术的应用(1) 不同种生物之间亲缘关系的判断不同种生物之间亲缘关系的判断，常采用比较不同生物DNA分子差异来进行,常用DNA分子杂交法。
将两种生物的DNA分子单链放在一起,如果这两个单链具有互补的碱基序列,就会形成杂合双链区。
互补的碱基序列越多，形成的杂合双链区就越多，说明两种生物间的亲缘关系就越近(如图)。
或者是把两个物种的DNA单链融合在一起，然后对这条新的DNA加热。
northern和southern探针合成步骤
合成DNA探针步骤：（具体参考Roche DIG DNA Labeling and Detection Kit）1. PCR、凝胶电泳分离目标片段，克隆后测序或者直接把胶回收产物取一部分送测以检验序列是否准确。
（注：假如以前已经测定过该片段，不必反复送测）2. 20μl体系10 ng至3 μg DNA，加双蒸水至15μl，盖紧用蜡封好。
沸水浴10分钟以使DNA变性，迅速置于冰中。
Note: Complete denaturation is essential for efficient labeling. 3 加入以下试剂：Hexanucleotide Mix, 10 × (vial 5) 2 μl dNTP Labeling Mix (vial 6) 2 μl Klenow enzyme labeling grade (vial 7) 1 μl 混匀，短暂离心。
37° C孵育 1 h 到20 h (overnight)，一般为16-18小时 4加入 2 μl 0.2 M EDTA (pH 8.0) 或于65° C 加热10 min 以终止反应。
Note: The length of the DIG-labeled fragments range from 200 to 1000 bp.合成RNA探针步骤：（具体参考Roche DIG RNA Labeling Mix, 10 × conc.）过程应保证无RNA酶的环境。
1. PCR、凝胶电泳分离目标片段，克隆后测序，需向公司说明测序结果要带上SP6、T7的序列，RNA探针是单链的，选择使用哪个启动子至关重要。
假如northern blot的对象是单链RNA，合成的RNA探针序列就必须与它互补。
呼肠孤病毒基因组为双链RNA，因此不需要考虑这个问题。
2. 提纯质粒，酶切以进行线性化3. 转录：在冰上加入以下试剂：（20μl体系）1 μg 线性化的质粒DNA x μl DIG RNA labeling mix, 10 ×2 μl Transcription buffer, 10 × 2 μl 加无RNA酶的水至总体积为 18 μl RNA polymerase (SP6, T7 or T3) 20 U/μl 2 μl 混匀，短暂离心。
pcr荧光探针法原理
pcr荧光探针法原理PCR荧光探针法原理。
PCR荧光探针法是一种用于检测DNA的方法，它利用PCR技术和荧光探针结合的原理，可以快速、准确地检测特定DNA序列的存在与否。
在这种方法中，荧光探针起着至关重要的作用，下面我们来详细介绍一下PCR荧光探针法的原理。
首先，我们需要了解PCR技术的基本原理。
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链反应，是一种体外扩增DNA的技术，通过PCR可以在短时间内扩增出目标DNA序列。
PCR的基本原理是通过不断地重复DNA的变性、退火和延伸三个步骤，从而实现DNA 的扩增。
在PCR荧光探针法中，荧光探针是一种含有荧光物质的DNA探针，它由三部分组成，引物结合区、荧光素结合区和猝灭结合区。
当荧光探针与目标DNA序列结合时，荧光素结合区和猝灭结合区之间的距离会发生改变，从而导致荧光信号的释放或猝灭。
这种特性使得荧光探针可以在PCR反应中实现对DNA扩增过程的实时监测。
在PCR荧光探针法中，通常会使用两种类型的荧光探针，TaqMan探针和Molecular Beacon探针。
TaqMan探针是一种线性探针，它含有荧光素和猝灭剂，当Taq聚合酶在PCR反应中延伸探针时，会将荧光素和猝灭剂从探针上释放出来，从而产生荧光信号。
而Molecular Beacon探针则是一种环状探针，它在未结合DNA时形成一个环状结构，导致荧光信号被猝灭，当与目标DNA结合时，会发生结构改变，使荧光信号被释放出来。
通过PCR荧光探针法，可以实现对特定DNA序列的快速、准确检测。
这种方法不仅可以用于基础科研领域，还在临床诊断、疾病检测、环境监测等领域有着广泛的应用。
同时，随着荧光探针技术的不断发展，越来越多的新型荧光探针被开发出来，为PCR荧光探针法的应用提供了更多的可能性。
总之，PCR荧光探针法作为一种高效、灵敏的DNA检测方法，为科研和应用领域提供了重要的技术支持。
探针捕获法二代测序原理
探针捕获法二代测序原理
探针捕获法二代测序是一种高通量测序技术，它能够对基因组中感兴趣的区域进行高效、准确的测序。
该技术的原理是利用特异性的DNA或RNA探针来捕获目标DNA片段，然后进行测序分析。
首先，针对感兴趣的DNA区域设计合适的探针。
这些探针通常是短的DNA或RNA序列，能够与目标DNA区域特异性结合。
探针的设计需要考虑到目标区域的特异性和覆盖度，以确保捕获到所有感兴趣的DNA片段。
接下来，将这些探针与待测DNA样品混合。
在混合物中，探针会与目标DNA区域结合形成探针-DNA复合物。
非特异性的DNA片段会被洗掉，而探针-DNA复合物则会被保留下来。
然后，对这些探针-DNA复合物进行扩增和测序。
通过PCR或其他扩增技术，可以增加目标DNA片段的数量，为后续测序提供足够的材料。
随后，利用二代测序技术对这些目标DNA片段进行高通量测序，得到其序列信息。
最后，利用生物信息学分析工具对测序得到的数据进行处理和
解读。
通过比对参考基因组，可以确定目标DNA片段的序列，进而了解其遗传变异、基因表达等信息。
探针捕获法二代测序技术具有高效、准确、灵敏的特点，广泛应用于基因组学、疾病研究、药物开发等领域。
它为研究人员提供了一种快速、全面地了解基因组信息的手段，有助于深入理解生命的奥秘。
基因探针是DNA还是RNA,是单链还是双链？
基因探针是DNA还是RNA，是单链还是双链？基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。
DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。
现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。
双链的DNA探针在应用前必须变为单链，一般采用加热的方法使双链DNA探针变性，原为单链的寡聚核苷酸和无需变性处理即可使用。
RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。
早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。
这类RNA 探针主要用于研究目的，而不是用于检测。
例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地筛选到多株HIV基因组DNA克隆。
又如进行中的转录分析（nuclear run on transcrip－tion assay）时，在体外将细胞核分离出来，然后在α-32P-ATP的存在下进行转录，所合成mR－NA均掺入同位素而得到标记，此混合mRNA与固定于硝酸纤维素滤膜上的某一特定的基因的DNA进行杂交，便可反映出该基因的转录状态，这是一种反向探针实验技术。
具有放射性或非放射性标记的寡核苷酸，用于从大量核酸样品中找出互补的目标序列，然后用放射自显影或其他显色法(如连接的酶作用于可显色底物)显示目标序列所在位置。
是经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的DNA或RNA片段，目前主要以同位素、地高辛或辣根过氧化酶等标记核酸探针。
1．探针的来源： RNA探针可由转录得来，DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNa 探针（cDNa probe）。
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DNA亲子鉴定
DNA是从几滴血, 腮细胞或培养的组织纤内提取 而来。用畴素将DNA样本切成小段, 放进喱胶内, 用电泳槽推动DNA小块使之分离——最细的在最 远, 最大的最近。之后, 分离开的基因放在尼龙 薄膜上, 使用特别的DNA探针去寻找基因, 相同 的基因会凝聚于一, 然后,利用特别的染料,在X光 的环境下, 便显示由DNA探针凝聚于一的黑色条 码。小孩这种肉眼可见的条码很特别，一半与母 亲的吻合,一半与父亲的吻合。这过程重覆几次, 每一种探针用于寻找DNA的不同部位并影成独特 的条码, 用几组不同的探针, 可得到超过99.9% 的父系或然率或分辨率
注意
1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高 于模板时，反应产物比较短，但产物的累 积较多；反之，则可获得较长片段的探针.
2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA， 则标记效率不足50%。
单链DNA探针的合成方法
• 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片 段合成单链探针;
• 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA 探针
• 切口平移法 • 随机引物合成法
切口平移法
当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基 末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性, 能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸 的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿 着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性 的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。 最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。
2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比 活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探 针比活性高，但长度比较短。
随机引物合成法
随机引物合成双链探针是使寡核 苷酸引物与DNA模板结合,在 Klenow酶的作用下,合成DNA探 针。合成产物的大小、产量、比活 性依赖于反应中模板、引物、 dNTP和酶的量。通常,产物平均长 度为400-600个核苷酸。
末端标记DNA探针
(1)按下列成分加入试剂并混匀： 已酶切的DNA 1mg
(25ml) 10×末端标记缓冲液 5ml 2mmol/L 3种 dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 适量 加水至 50ml (3)加入1单位的Klenow片段,室温下反应30分钟。 (4)加入1ml 2mmol/L 第四种核苷酸溶液, 室温保温15 分钟。 (5)70℃加热5分钟,终止反应。 (6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用 Sephdadex G-50柱层析分离标记的DNA。
Thank you
DNA探针
—王艳慧
什么是DNA探针
DNA探针是利用同位素、生 物素等标记的特定DNA片断, 该片断可大至寄生虫基因组 DNA，小至20个碱基。
原理
当DNA探针与待测的非标记单链 DNA（或RNA）按碱基顺序互补 结合时，以氢健将2条单链连接而 形成标记DNA-DNA（或标记 DNA-RNA）的双链杂交分子。将 未配对结合的核苷酸溶解后用检测 系统（放射自显影或酶检测等）检 测杂交反应结果。
优点
• 这类探针多克隆在质粒载体中，可以 无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。
• DNA探针不易降解（相对RNA而言）， 一般能有效抑制DNA酶活性。
• DNA探针的标记方法较成熟，有多种 方法可供选择，如缺口平移法、随机 引物法、PCR标记法等，能用于同位 素和非同位素标记。
双链DNA探针的合成方法
注意事项
1、利用本方法可对DNA分子量标准进行 标记，利用它可定位因片段太小而无法在 凝胶中观察的DNA片段。 2、对DNA的纯度不很严格，少量制备的质 粒也可进行末端标记合成探针。 3、末端标记还有其他的一些方法，如利用 T4多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突出的 DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用该 酶进行交换反应标记5'末端。
切口平移反应受几种因素的影响
(a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的 比活性和模板中核苷酸被置换的程度。
(b)DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的 质量会影响产物片段的大小。
(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶 的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。
注意
1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于 探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。
利用随机引物进行反应的优点是：
(1)Klenow片段没有5‘→3’外切酶活性,反应 稳定,可以获得大量的有效探针。
(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备 的质粒DNA模板也可进行反应。
(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。
(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直 接进行。