基因探针

磷酸基，因而极易用T4噬菌体多核苷酸激酶进行磷酸化反应，从而将
γ-32p从[γ-32p]ATP转移至其5’端。 ②大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段：用大肠杆菌DNA聚合酶I
Klenow片段合成与合成寡核苷酸互补的 DNA链，可得到高比活度的探
针。用一短引物与寡核苷酸模板结合，后者的序列互补于所用的放射 性标记探针。该引物随后在大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段的作用
RNA印迹技术（Northern blotting）
1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子 从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的 活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这 种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似,所以叫做 诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上， 然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行 反应,这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。
核酸杂交常用几种膜的性 能比较
硝酸纤维膜(NC膜)
硝酸纤维膜有两种;
0.22µ m孔经 0.45µ m孔经
4. 基因探针的标记物
1）同位素：H3、 S35、 P32 最常用（缺点：不能保存） 2）非同位素： ①地高辛：植物中提取。商品化地高辛标记dCTP，即 合成链时，用地高辛标记dCTP。dCTP-地高辛与酶标 抗地高辛抗体反应，加底物显色。 ②生物素-亲和素：用酶标亲和素测dCTP-生物素
将靶序列克隆于适当的M13噬菌体或噬菌 粒载体中，分离出带有靶序列的单链DNA
用切点位于靶序列远端的 限制酶来消化 DNA
通用引物
利用通用引物合成与靶序列 互补的放射性标记DNA 大肠杆菌DNA聚合 酶I Klenow片段
3种未标记dNTP 1 种32p标记dNTP
未标记的 模板DNA 放射性标 记的DNA 来自标记 DNA 3’端 的片段
体外转录合成RNA探针
(从左到右)
DNA的5’或3’末端标记
不同的末端标记用不同的酶：
1）大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段：3’末端标记 2）T4噬菌体多核苷酸激酶：标记DNA 5’端 3）T4噬菌体DNA聚合酶：标记DNA3’端
寡核苷酸标记
①T4噬菌体多核苷酸激酶：合成的寡核苷酸在合成时其5’端缺少一个
切口平移的反应体系
探针DNA 0.5ug
10×切口平移缓冲液
10×dNTP（无dCTP） DNase I (10ng/mL)
2.5uL
每种20nmol 2.5uL
DNA聚合酶I
[α-32P]Βιβλιοθήκη dCTP 加dH2O2.5单位
16pmol 至25uL
14~16℃ 1~2h
加1uL0.5mol/L EDTA(pH8.0)终止反应
3）仅用无RNA酶的DNA酶I处理就可从RNA探针中除去模板DNA。而不必用 凝胶电泳进行纯化。
4）由于RNA杂交体的稳定性本身就比较高，所以RNA杂交反应中产生的信号 一般要比相同比活度的DNA探针强。
5）RNA探针的使用改进了分析哺乳动物基因转录物的方法。可用RNA酶A来 消化RNA∶RNA杂交体，而不必用难以控制的S1核酸酶来消化DNA∶RNA杂 合分子。

检测DNA的技术称为.Southern blot杂交. 检测RNA的技术称为. Northern blot杂交. 检测蛋白质的技术称为.Western blot杂交. 还有dot blot,原位杂交技术等.
杂交类型
固相杂交 液相杂交
核酸分子杂交
(固相杂交)
Northern 杂交 Southern 杂交 芯片
随机引物法
DNA聚合酶利用寡核苷酸作引物，沿单链模板合成 DNA。如果寡核苷酸的序列不均一，它们就会在模板的
许多位臵上和模板杂交，因此模板上的每个核苷酸(可能
要除去最靠近5’端的一些核苷酸)被拷贝进产物中去的频 率相同。使用[α-32P] dNTP 作为前体，用此法可合成比 活度非常高的标记DNA探针。
探针基因的分离制备
检测样品核酸制备
同位素或非同位素标记
杂交膜制备或转印
标记基因探针的纯化
预 杂
交
杂 交
洗 膜 图3-3 核酸探针杂交试验全过程示意图
（a）
基因组DNA
DNA限制片段
Southern 凝
胶转移杂交技 术
（b）
（c）
（d）
硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂交的基 因DNA片段
X光底片
（e）
通过凝胶电泳把标记探针与未 标记的的模板分开
放射性 标记的 标准参 照物
利用单链DNA载体合成探针(从左到右)
RNA探针
在来自鼠伤寒杆菌SP6噬菌体或来自大肠杆菌T7及T3噬菌体的强启动子 下游装臵多克隆位点，组建成质粒载体，可合成高比活度的单链RNA探针。 RNA探针具有许多优越性： 1）放射性标记RNA的合成效率高。因为用于合成RNA的模板可被转录多次， 所以产生的RNA数倍于模板。 2）rNTP的浓度相对交低时(1-20umol/L)，噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶 也能在体外发挥作用，所以合成高比活度全长探针的成本相对较低。


原位杂交
原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首 先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵 母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核 仁中。
原位杂交技术的基本方法：


(一),杂交前探针种类选择。 (二),杂交前探针标记方法选择。 (三),探针的纯化。 (四),杂交前准备,包括固定、取材、玻片和组织的 处理，增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等。 (五),组织的前处理。 (六),预杂交。 (七),原位杂交。 (八),杂交后处理(漂洗)。 (九),杂交后显色。
单链DNA探针
单链探针仅由特定核酸序列的互补双链之一组成，与传统的双 链探针相比有很大的优越性。由于不存在互补链，因此可以消除由 探针的两条链重退火形成无效杂交体的可能性。当用来自某一种生 物中的探针去检测另一种远缘生物中可与之交叉杂交的序列时，单 链探针尤为有用。
由DNA模板体外制备单链探针有两种方法： 1）合成可与克隆于嗜菌粒或M13噬菌体载体上的序列互补的放射性 标记DNA（图3-1） 2）将克隆于特定载体上的靶序列转录成放射性标记的RNA，在此 载体上带有可被噬菌体依赖于DNA的RNA聚合枚识别的启动子。
多克隆位点
T7启动子 SP6启动子
T7启动子
SP6启动子
SP6噬菌体依赖于DNA 的RNA聚合酶 3种未标记rNTP 将靶序列克隆于带有噬菌体启动子的质 粒中，这些启动子可被噬菌体编码的依 赖于 DNA的RNA聚合酶所识别 1种32p标记rNTP
用DNA酶I消化以去除模板DNA
32p标记的RNA
用切点位于靶序列远端的限制酶消化 重组质粒产生平端或3’凹端
洗涤液 2XSSC, 0.5%SDS 5min. 2XSSC, 0.1 % X SDS 15 min.(室温).
0.1XSSC, 0.1 % X SDS 37 °C 30min至1h.
0.1XSSC, 0.1 % X SDS 65 °C洗涤30min至
1h.( 水浴) 显影(放射性,非放射性)
菌落杂交
检测重组体克隆的菌落杂交技术
原位杂交
(in situ hybridization ISH)
原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基 顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细 胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行 特异性结合而形成杂交体，然后再应用与 标记物相应的检测系统，通过组织化学或 免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形 成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显 微镜下进行细胞内定位。
斑点印迹杂交和狭线印迹杂交

斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹 杂交（slot blotting ）是在Southern印迹杂交 的基础上发展的量种类式的快速检测特定核酸 （DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在 实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置， 使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜 上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技 术更适应与核酸样品的定量检测。
随机引物的获得：
1）用DNA酶I消化小牛胸腺DNA或鲑精DNA 产生大量 6—12 核苷酸的单链DNA。
2）从一些厂家购买用小牛胸腺DNA制备的随机引物。
如Pharmacia、Boehringer、Mannheim等。 3）在自动DNA合成仪上合成一个八聚体集群，这一分 子集群在八聚体的每一个位臵上都含有所有4种碱基。
③原位杂交：0.5-5.0ug/mL
2） 随机多聚体
①硫酸葡聚糖：5-10%
②PEG6000-8000
③聚丙稀酸（钠盐）：2-4%
转印
虹吸印迹法


电转移法
DNA片段大小影响转移速度.
预杂交
用DNA酶I消化并变性的小牛胸腺DNA或鲑精DNA封 闭膜.
杂交液
5XSSC 20mmol/L鳞酸缓冲液 (pH7.0) 5XDenholdt氏液 10% 硫酸葡聚糖 100µg/ml变性小牛胸腺DNA或鲑精DNA . 50% 甲酰胺
③荧光：送生物公司标记
5. 探针标记方法
1）DNA的切口平移 2）随机引物法 3）单链DNA探针 4）RNA探针
5）DNA的5’或3’末端标记
6）寡核苷酸标记 7）PCR标记
DNA的切口平移法
双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA
聚合酶I可把核苷酸残基加到切口处的3’羟基端。且由
于此酶具有5’ 3’外切酶活性，它还可以从切口的5’端 除去核苷酸。5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同 时进行，导致切口沿着DNA链移动(切口平移)。