实验四 细菌的革兰氏染色与芽孢染色
实验四细菌革兰氏染色与芽孢染色
实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色一、目的要求1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验材料1.菌种：金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli）2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。
通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。
革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。
经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。
大肠杆菌是标准的革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革兰氏阳性菌。
革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。
经结晶紫初染以后，所有的细菌都被染成蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。
用蕃红复染时染上红色。
四、操作步骤1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。
2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。
4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。
大二下--微生物学实验总结
⼤⼆下--微⽣物学实验总结实验⼀、常⽤培养基配制⼀、器⽫清洗1、试管、培养⽫、三⾓瓶、烧杯等玻璃器⽫的清洗⽤瓶刷或海绵沾上洗⾐粉等洗涤剂刷洗，然后⽤⾃来⽔充分冲洗⼲净。
热的肥皂⽔去污能⼒更强，可有效地洗去器⽫上的油污,去离⼦⽔润洗，倒置晾⼲或烘⼲。
2、全⾃动实验室玻璃器⽫清洗机预清洗洗涤剂清洗⾃来⽔冲洗纯⽔冲洗 135℃⾼温⼲燥消毒3、装有固体培养基的器⽫应先将其刮去，然后洗涤。
带菌的器⽫在洗涤前先浸在2％煤酚皂溶液（来苏尔）或0.25％新洁尔灭（苯扎溴铵）消毒液内24⼩时或煮沸半⼩时，再⽤上法洗涤。
带病原菌的培养物最好先⾏⾼压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进⾏洗涤。
⼆、载玻⽚与盖玻⽚的清洗⽤过的载玻⽚与盖玻⽚如滴有⾹柏油，要先⽤皱纹纸擦去或浸在⼆甲苯内摇晃⼏次，使油垢溶解，再在肥皂⽔中煮沸5～10分钟，⽤软布或脱脂棉花擦试，⽴即⽤⾃来⽔冲洗，最后⽤蒸馏⽔润洗数次，待⼲后浸于95％酒精中保存备⽤。
使⽤时在⽕焰上烧去酒精。
三、器⽫包扎1、培养⽫的包扎培养⽫常⽤⽜⽪纸密密包紧，⼀般以5～8套培养⽫作⼀包，包好后进⾏灭菌。
2、试管和三⾓烧瓶等的包扎试管和三⾓瓶盖上铝帽或者塑料帽后⽤⽜⽪纸包扎，进⾏灭菌。
包纸的⽬的在于保存期避免灰尘侵⼊。
四、器⽫清洗和包扎⼩结微⽣物学实验室所⽤的玻璃器⽫的质量要求硬质玻璃，能承受⾼温和短暂烧灼⽽不致破损；器⽫的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器⽫的形状和包扎⽅法的要求，以能防⽌污染杂菌为准；洗涤⽅法不恰当也会影响实验结果。
因此，在实验准备的时候要严格按照要求洗涤实验器⽫。
包扎并灭菌后备⽤。
五、培养基配制⽜⾁膏蛋⽩胨培养基（培养⼀般细菌⽤）⽜⾁膏 3g 蛋⽩胨 10g NaCl 5g 琼脂 15～20g ⽔ 1000ml实验原理：在配制固体培养基时要加⼊⼀定量琼脂作凝固剂。
琼脂在常⽤浓度下96℃时溶化，在40℃时凝固，通常不被微⽣物分解利⽤。
固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和⽓温的不同⽽有所不同。
细菌革兰氏染色实验报告
一、实验目的1. 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法。
2. 学会使用油镜观察细菌的形态。
3. 了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理革兰氏染色是细菌学中一种重要的染色方法，主要用于区分细菌的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在细胞壁结构上存在显著差异，导致它们在革兰氏染色过程中表现出不同的染色特性。
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量高，交联度大，乙醇脱色处理后，细胞壁收缩，但结晶紫-碘复合物仍然被留在细胞内，使细菌呈紫色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，肽聚糖层薄且交联度差，乙醇脱色处理后，细胞壁溶解，结晶紫-碘复合物被脱出，再经碱性品红染液复染，使细菌呈红色。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、革兰氏染色液（草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、碱性品红染液）、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、酒精灯等。
2. 仪器：显微镜、油镜、移液器、移液吸头等。
四、实验步骤1. 涂片：取一环蒸馏水于载玻片中央，用接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与玻片上的水滴均匀混合，并涂成约1cm²的薄菌膜。
2. 固定：将涂片在空气中干燥，手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上快速通过3次，以让菌膜更加牢固地贴在玻片上，待冷却后滴加染料。
3. 初染：手持玻片一端，滴加草酸铵结晶紫染液染色2min后，倾去染液。
4. 媒染：向涂片滴加碘液，媒染1min后，倾去碘液。
5. 脱色：向涂片滴加95%乙醇，脱色30s，观察菌体颜色变化，直至出现红色。
6. 复染：向涂片滴加碱性品红染液，复染1min后，倾去染液。
7. 洗涤：用蒸馏水冲洗涂片。
8. 染色观察：用油镜观察菌体形态和染色特性。
五、实验结果与分析1. 枯草芽孢杆菌：呈革兰氏阳性菌，细胞壁厚，呈紫色。
2. 金黄色葡萄球菌：呈革兰氏阳性菌，细胞壁厚，呈紫色。
六、实验讨论革兰氏染色是一种简单、快速、有效的细菌分类方法。
革兰氏染色试验步骤
三、实验器材
1 、菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 或巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。
2 、试剂：革兰氏染液:草酸铵结晶紫染液、卢戈氏典液、 95%乙醇、番红复染液； 芽孢染液:5%孔雀绿染色液、 0.5%番红水溶 液。
染色结果：阴性细菌（G-）： 染成红色
2 、芽孢染色原理
细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着 色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色。 芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后 又难以脱色这一特点，用着色力强的染色剂孔雀绿 或石炭酸，在加热条件下，延长染色时间，使染料 不仅进入菌体也进入芽孢内，进入菌体的染料经水 洗后被脱色，而芽孢一经着色就难以被水洗脱，当 用对比度大的复染剂番红复染后，芽孢仍保留初染 剂的绿色，而菌体则被染成复染剂的红色。
内 （扦在接种线上） 培养：倒置平板，28℃培养5-7天。
镜检：拔出盖玻片，擦去背面培养物，将有菌的一 面放在载玻片上，直接镜检或将有菌的一面 朝下，放在滴有0.1%美蓝染色液载玻片中 镜检。
1 盖玻片 2 培养基
酵母菌形态观察方法（美蓝浸片法）
载玻片中央加一滴0.1%美蓝染色液。 挑取酵母菌苔少许，置美蓝染色液中混合均匀。 用镊子取盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢 将盖玻片放下，以免产生气泡影响观察。 用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况。
氏阳性菌。 典型放线菌的菌丝体分化产生各种形 态特征：
基内丝菌（较细、透明）
菌丝体 气生菌丝（较粗颜色较深）有无气生菌丝
孢子丝（直、波曲、各种螺旋或轮生）等，是分类鉴定的重要依据 孢子：分生孢子（球形，椭圆，杆状或柱状）、孢囊孢子、游动孢子
细菌形态观察实验报告
一、实验目的1. 掌握显微镜油镜的使用方法。
2. 观察细菌的基本形态结构，如细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等。
3. 了解细菌的特殊结构，如鞭毛、荚膜、芽孢等。
4. 培养对细菌形态结构的识别能力。
二、实验原理细菌是单细胞微生物，具有多种形态结构。
通过显微镜观察，可以了解细菌的基本形态和特殊结构，为细菌的分类、鉴定和致病性研究提供依据。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：细菌样本、革兰氏染色液、芽孢染色液、水浸片、盖玻片、载玻片等。
2. 仪器：光学显微镜、酒精灯、载物台、切片刀、镊子等。
四、实验步骤1. 观察细菌样本（1）将细菌样本滴在载玻片上，用盖玻片封口。
（2）在显微镜下观察细菌的基本形态结构，如细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等。
2. 革兰氏染色（1）将革兰氏染色液滴在细菌样本上，用酒精灯加热。
（2）观察染色后的细菌，判断其革兰氏分类。
3. 芽孢染色（1）将芽孢染色液滴在细菌样本上，用酒精灯加热。
（2）观察染色后的细菌，判断其芽孢存在与否。
4. 观察细菌特殊结构（1）观察细菌是否有鞭毛、荚膜等特殊结构。
（2）通过水浸片观察细菌的运动。
五、实验结果与分析1. 细菌样本的基本形态结构（1）观察到的细菌具有细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等基本结构。
（2）部分细菌具有鞭毛、荚膜等特殊结构。
2. 革兰氏染色结果（1）部分细菌呈现革兰氏阳性，细胞壁较厚，不易着色。
（2）部分细菌呈现革兰氏阴性，细胞壁较薄，易着色。
3. 芽孢染色结果（1）部分细菌存在芽孢，呈圆形或椭圆形。
（2）部分细菌无芽孢。
4. 细菌特殊结构观察结果（1）部分细菌具有鞭毛，呈螺旋状。
（2）部分细菌具有荚膜，呈透明状。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了显微镜油镜的使用方法。
2. 观察了细菌的基本形态结构和特殊结构，了解了细菌的生物学特性。
3. 培养了对细菌形态结构的识别能力，为今后的学习和研究奠定了基础。
七、注意事项1. 使用显微镜时，注意调节光圈和焦距，确保观察清晰。
实验四革兰氏染色技术(精)
染液因素
注意试剂的有效期，是否变质，异常时不使用 结晶紫易沉淀 卢戈氏碘液易变质 酒精易挥发
细菌因素
衰老变性的细菌会出现染色性改变
视频：革兰氏染色
（2）斜面培养物涂片： 用细菌斜面（或平板）培养物涂片，需预先将 接种环沾取生理盐水 1~2 环臵于载玻片中央， 然后再按上述无菌操作法从斜面培养物上沾取 葡萄球菌或大肠杆菌菌苔少许，混于生理盐水 中，轻轻研匀，涂成直径 lcm 左右的均匀薄膜。
2．干燥
涂片最好在室温自然干燥，如需加速干燥，也可将
涂面向上，小心地放臵离火焰 20 ㎝处，远 离火焰 上方微加温略烘促使干燥（ 切勿加热过度，以 防 将标本烧枯）。
3．固定
标本干燥后，常用加热固定法。在火焰的最热部分
让玻片有菌膜的面向上，通过酒精灯火焰三次（约 2~3秒钟），固定之目的是使细菌蛋白变性，菌体 牢固黏附于玻片上，还可杀死细菌，改变菌体对染 料的通透性。
5.结果
染色片待干后，于油镜下，调强光视野观察，呈紫
色的为革兰阳性菌，呈红色的为革兰阴性菌。 葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性，以 G+表示；大 肠杆菌染成红色，为革兰阴性，以 G-表示。
菌悬液
涂片
干燥
固定 滴加无 菌水 取菌苔
涂片
四、注意事项
操作因素
脱色：关键步骤 涂片：太厚影响染色，太薄细菌分散不匀 干燥：过热使细菌菌体变形，排列失常
碘 1g；碘化钾 2g ；蒸馏水 300ml
先将碘化钾 2g 溶于 100ml 蒸馏水中，再加碘 1g，用力摇匀待溶解后加蒸馏水至 300ml 即成。供革兰染色媒染用。
芽孢染色常用方法
芽孢染色是一种常用的微生物实验室技术，用于观察和鉴定细菌的孢子形态和结构。
以下是芽孢染色的常用方法：
1. 热锡烙法（Heat-fixed smear）：将含有芽孢的菌落用细火加热，使其附着在玻璃片上固定。
2. 革兰氏染色法（Gram staining）：首先用洗涤液将玻璃片上的菌落冲洗，接着用紫晶染液染色，再用碘液做固定，用乙醇洗去多余的染色剂，最后用洗涤液冲洗，接着用红素染液染色，最后用洗涤液冲洗干净。
3. 铁血素染色法（Iron-hematoxylin staining）：将菌落固定在玻璃片上，然后用铁血素溶液浸泡一段时间，最后用去离子水冲洗干净。
4. 格拉姆染色法（Spore staining）：将菌落固定在玻璃片上，然后用绿基（Malachite Green）染液浸泡，将玻璃片放入蒸汽中加热，再用水洗去多余染液，最后用红素染液进行反染。
以上是几种常用的芽孢染色方法，具体使用哪种方法取决于实验目的和需求。
微生物学实验3 细菌革兰氏染色和芽孢染色
2022/9/12
Hale Waihona Puke 32022/9/12
4
革兰氏染色视频（单击播放）
2022/9/12
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实验三 细菌的革兰氏染色与芽孢染色
一． 实验目的
1. 学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2. 学习细菌芽孢染色的原理和方法。
二． 实验材料
1. 菌种：大肠杆菌
Escherichia coli、
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis
2. 染色液：草酸铵结晶紫染液、路哥氏碘液、 95%乙醇脱色液、番红染液、孔雀绿染液
➢ 芽孢染色：加1~2滴无菌水于小离心管中→ 用接种环挑 取2~3环菌苔于小离心管中，混匀，制成浓的菌悬液→ 加2~3滴孔雀绿小于离心管中，混匀→置于沸水浴中加 热染色15~20min→取底部菌液数环涂片→干燥→固定 →水洗脱色至流出的水无绿色为止→用蕃红染液染色 2~3min →水洗→干燥
➢ 镜检：
3. 其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、 无菌水、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等
2022/9/12
1
三． 实验原理：革兰氏染色的原理？芽孢染色原理？
四． 实验步骤
➢ 革兰氏染色：涂片→干燥→固定→结晶紫染液初染 1min →水洗→碘-碘化钾溶液媒染1min →水洗→ 95% 乙醇溶液脱色至流下的乙醇溶液无明显的紫色→立即 水洗→藩红染液复染1～2min →水洗→干燥
➢ 油镜维护：
2022/9/12
2
五. 实验内容
1. 对所给的两种菌进行混合涂片进行革兰氏染色和油镜 观察（上交一张自己满意的染色片）；
2. 对已进行芽孢染色的枯草芽孢杆菌进行涂片、脱色和 复染，并镜检。
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实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色
一、目的要求
1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验材料
1.菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli）
2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液
3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理
革染氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。
通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。
革染氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。
经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革染氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革染氏阴性菌。
大肠杆菌是标准的革染氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革染氏阳性菌。
革染氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。
经结晶紫初染以后，所用的细菌都被染成蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革染氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革染氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。
用蕃红复染时染上红色。
四、操作步骤
1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。
2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。
4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载
玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。
酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。
脱色是革兰氏染色中最关键的一步。
6.复染：滴加番红液，染色2min，水洗。
7.用滤纸吸干，油镜镜检。
五、注意事项
为了保证革染氏染色结果的正确性，制片过程中要注意：要选用活跃生长的幼培养物作革染氏染色，涂片不宜过厚，火焰固定不已过热，脱色时间的控制。
另外，可选用标准的革染氏阳性菌和革染氏阴性菌和未知菌一起混合涂片和染色。
六、实验内容
1.分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行革兰氏染色
2.对上述两种菌进行混合涂片，再进行革兰氏染色。
七、实验报告
1.图示所观察到的菌体细胞的形态与革兰氏染色结果；
2.为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能超过24小时？
3.在下表中依次填入革兰氏染色所用染料的名称，并填上革兰氏阳性和革兰氏阴性菌在每
步染色后菌体所呈的颜色。
在不影响革兰氏反应的前提下，哪一步可被省略？
4.当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样才能确保你的操作正确、结果可靠？
附录：细菌的芽孢染色
一、目的要求
学习芽孢染色的原理和方法
二、实验材料
1.菌种：枯草芽孢杆菌，肉汁斜面培养24h；
2.染料：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液
3.其他：显微镜、载玻片、接种环、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理
芽孢又叫内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。
细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、位置，芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的依据。
由于芽孢壁厚、透性差、不易着色。
当用结晶紫单染色时，菌体呈紫色，芽孢是无色透明。
芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。
芽孢壁厚，透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。
若再用番红复染，则菌体呈红色而芽孢呈绿色。
四、操作步骤
1.制备菌悬液加1~2滴水于小试管中，用接种环挑取2~3环菌苔于试管中，搅拌均匀，
制成浓的菌悬液。
2.染色加2~3滴孔雀绿于小试管中，并使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴的
烧杯中，加热染色15~20min。
3.涂片固定用接种环取试管底部菌液数环于干净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过
火焰3次温热固定。
4.脱色水洗，直至流出的水无绿色为止。
5.复染用蕃红染液染色2~3min，倾去染液并用滤纸吸干残液。
6.镜检干燥后用油镜观察，芽孢呈绿色，芽孢囊和营养细胞为红色。
注意：所用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成芽孢为宜；取菌不宜太少。