第九章 基因诊断
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基因诊断精选全文
DNA多态性——在同种生物不同个体的
基因组中，常存在一些不影响基因功 能的DNA顺序变异，称为DNA多态性 （polymorphism）
DNA多态性标记
1. 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP)
2. 短串联重复序列（short tandom repea STR）
③ 延伸：将温度升至72℃，在DNA聚合酶作用下，在引 物3’端进行延伸，使原模板DNA的一条链变成 两条链。
（1）、基本工作原理
Template DNA 5
5 5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
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Cycle 2
5 5
5
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目录
5 5
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Cycle 3
5
5
DNA
㈢基因表达异常的诊断
1. mRNA的相对定量分析
斑点杂交 RT—PCR
2. mRNA的绝对定量分析
RT—PCR/竞争性PCR(50bp标准cDNA 已知浓度)
3. mRNA长度分析
Northern杂交/ RT—PCR产物电泳
㈣ 外源DNA检测
核酸分子杂交 PCR技术
许多病原体的基因结构已被阐明，设计基因特异性探 针，或合成特异的寡核苷酸引物，可直接从临床标本 中检测病原体基因组核酸(DNA或RNA)的存在，即可 早期、快速、敏感、特异地确定病原体的存在。
AT CG
探针定位
正常
CT
(纯合子)
CT (杂合子)
CG （新突变）
CA （新突变）
②诊断未知的突变
基因组中，常存在一些不影响基因功 能的DNA顺序变异，称为DNA多态性 （polymorphism）
DNA多态性标记
1. 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP)
2. 短串联重复序列（short tandom repea STR）
③ 延伸：将温度升至72℃，在DNA聚合酶作用下，在引 物3’端进行延伸，使原模板DNA的一条链变成 两条链。
（1）、基本工作原理
Template DNA 5
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Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5
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5
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5 5
目录
5 5
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Cycle 3
5
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DNA
㈢基因表达异常的诊断
1. mRNA的相对定量分析
斑点杂交 RT—PCR
2. mRNA的绝对定量分析
RT—PCR/竞争性PCR(50bp标准cDNA 已知浓度)
3. mRNA长度分析
Northern杂交/ RT—PCR产物电泳
㈣ 外源DNA检测
核酸分子杂交 PCR技术
许多病原体的基因结构已被阐明，设计基因特异性探 针，或合成特异的寡核苷酸引物，可直接从临床标本 中检测病原体基因组核酸(DNA或RNA)的存在，即可 早期、快速、敏感、特异地确定病原体的存在。
AT CG
探针定位
正常
CT
(纯合子)
CT (杂合子)
CG （新突变）
CA （新突变）
②诊断未知的突变
基因诊断原课件-精品文档
基因诊断
基因诊断的目的：
就是要通过各种手段，如杂交、扩增等，去寻找和发现这些 独特基因组、基因或基因片段的存在，从而证实某种病原体的存 在。
传统诊断与基因诊断的比较：
传统诊断的缺陷多，方法大多为：
1、表型诊断：以疾病或病原体的表型为依据。而表型的改变 在多数情况下是非特异的，出现的时间也比较晚，易错过治疗的 最佳时期。某些疾病本身不呈现显著的表型改变，用传统的检测 方法亦出现假阴性。
基因诊断
根据诊断目的或要求
分为定性诊断Biblioteka 定量诊断和半定量诊断,以及序列分析等。
二，基因诊断的策略
1， 从基因产物入手
这是一种比较早期的诊断策略。首先分析异常基因的产物 （蛋白质），并弄清是如何引起临床症状的。在纯化了该蛋白质 以后，进行氨基酸序列测定,据此合成致 疾病的分子缺陷。这种策略是由蛋白质至DNA，由表型至基因型。 迄今分离的绝大部分分子病和遗传性代谢缺陷病如白化病,苯丙酮 尿症(PKU)和镰状细胞贫血等的相关基因都是根据这一策略分离 的。
1、杂交Southern印迹用于检测DNA;Northern印 迹用于检测RNA;斑点印迹或称斑点杂交 ,既可检测 DNA也可检测RNA。
2、PCR法主要用为直接扩增DNA，但是通过逆转 录技术,可以将RNA先转变为cDNA再行扩增，称逆 转录PCR,如检测HCV，HGV，HIV等。
3、原位杂交,或原位PCR,也可分DNA或RNA原位 杂交和原位PCR或逆转录PCR。
基因诊断
根据待测标本的性质
分析体中的(血，尿，粪，痰液,胸腹水等等),细胞和组织 基因检测。
1、体液中的待测基因可在将标本适当处理后,根据需要 采用上述各种方法检测
2、组织切片内基因检测则可采用原位杂交和原位PCR法
基因诊断
2
第一节 基因诊断的技术和方法
一 基因诊断中常用的分子生物学技术 （一） 核酸杂交 （二） PCR （三） 单链构象多态性检测 （四）限制酶酶谱分析 DNA序列测定 （五） DNA序列测定 DNA芯片技术 （六） DNA芯片技术
3
二 基因诊断的基本方法
（二）基因突变的诊断 点突变的诊断： 1 点突变的诊断： （1）诊断已知点的突变 ：PCR+ASO 引物设计： 引物设计：引物必须位于突变点两 目的片段经PCR扩增后， PCR扩增后 侧，目的片段经PCR扩增后，再用斑 点杂交或狭缝杂交 探针设计： 探针设计：正常探 针+突变探针
10
（三）基因表达异常 的诊断
针对RNA的诊断 针对RNA的诊断 RNA
11
mRNA的相对定量分析 1 mRNA的相对定量分析
（1）斑点杂交或狭缝杂交：放射性核素 斑点杂交或狭缝杂交： 标记探针， 标记探针，与点在硝酸纤维素膜或尼龙 膜上的待测样品杂交， 膜上的待测样品杂交，经放射性自显影 后进行吸光度扫描， 后进行吸光度扫描，通过正常对照与待 测标本的比较确定RNA RNA表达量 测标本的比较确定RNA表达量 RT-PCR法 提取总RNA→ （2）RT-PCR法：提取总RNA→ cDNA→ →电泳 图像扫描分析→ 电泳→ PCR →电泳→图像扫描分析→与对照比 较计量结果
4
点突变的诊断2 1 点突变的诊断2
结果判断： 结果判断： PCR扩增产物与正常探针杂交 扩增产物与正常探针杂交， (1) PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突 变 探针杂交--不存在这种突变； 探针杂交--不存在这种突变； --不存在这种突变 针杂交--突变基因为纯合子； --突变基因为纯合子 (2) 只与突变探 针杂交--突变基因为纯合子； 可杂交---突变 (3) 与正常探针和突变探针都 可杂交--突变 基因为杂合子； 基因为杂合子； 与正常探针和突变探针都不能杂交---突 (4) 与正常探针和突变探针都不能杂交--突 变基因不属于已发现的类型
第一节 基因诊断的技术和方法
一 基因诊断中常用的分子生物学技术 （一） 核酸杂交 （二） PCR （三） 单链构象多态性检测 （四）限制酶酶谱分析 DNA序列测定 （五） DNA序列测定 DNA芯片技术 （六） DNA芯片技术
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二 基因诊断的基本方法
（二）基因突变的诊断 点突变的诊断： 1 点突变的诊断： （1）诊断已知点的突变 ：PCR+ASO 引物设计： 引物设计：引物必须位于突变点两 目的片段经PCR扩增后， PCR扩增后 侧，目的片段经PCR扩增后，再用斑 点杂交或狭缝杂交 探针设计： 探针设计：正常探 针+突变探针
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（三）基因表达异常 的诊断
针对RNA的诊断 针对RNA的诊断 RNA
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mRNA的相对定量分析 1 mRNA的相对定量分析
（1）斑点杂交或狭缝杂交：放射性核素 斑点杂交或狭缝杂交： 标记探针， 标记探针，与点在硝酸纤维素膜或尼龙 膜上的待测样品杂交， 膜上的待测样品杂交，经放射性自显影 后进行吸光度扫描， 后进行吸光度扫描，通过正常对照与待 测标本的比较确定RNA RNA表达量 测标本的比较确定RNA表达量 RT-PCR法 提取总RNA→ （2）RT-PCR法：提取总RNA→ cDNA→ →电泳 图像扫描分析→ 电泳→ PCR →电泳→图像扫描分析→与对照比 较计量结果
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点突变的诊断2 1 点突变的诊断2
结果判断： 结果判断： PCR扩增产物与正常探针杂交 扩增产物与正常探针杂交， (1) PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突 变 探针杂交--不存在这种突变； 探针杂交--不存在这种突变； --不存在这种突变 针杂交--突变基因为纯合子； --突变基因为纯合子 (2) 只与突变探 针杂交--突变基因为纯合子； 可杂交---突变 (3) 与正常探针和突变探针都 可杂交--突变 基因为杂合子； 基因为杂合子； 与正常探针和突变探针都不能杂交---突 (4) 与正常探针和突变探针都不能杂交--突 变基因不属于已发现的类型
基因诊断名词解释
基因诊断名词解释基因诊断是通过对个体的基因进行检测和分析，以确定其在某些遗传病、肿瘤等方面的发病风险、病因等相关信息的方法。
基因诊断是利用分子生物学技术和遗传学原理，根据个体基因组中的变异和突变来判断某些疾病的遗传风险和病因，为医学诊断、预防、治疗提供科学依据。
1. 单基因病：由单一基因突变引起的遗传病，如囊泡性纤维化、血友病等。
单基因病的基因诊断主要通过对特定基因进行测序和变异分析，寻找突变位点来确定患病风险和病因。
2. 多基因病：由多个基因共同作用引起的遗传病，如某些遗传性肿瘤、心血管病等。
多基因病的诊断需要对多个与疾病相关的基因进行检测和分析，综合考虑各基因的变异情况来判断患病风险。
3. 遗传突变：指基因组中发生的与正常序列相比有明显差异的变异，包括基因缺失、插入、缺失、替换等。
遗传突变是基因诊断的重要依据，通过分析基因组中的突变情况可以判断某些疾病的遗传风险和病因。
4. 突变检测：对个体基因组中的突变进行检测和分析的方法，包括测序、杂交等多种技术手段。
突变检测是基因诊断的核心内容，通过检测个体基因组中的突变，可以确定某些疾病的遗传风险和病因。
5. 家系分析：通过对家族成员的基因检测和分析，了解某些疾病在家族中的遗传规律和风险。
家系分析是基因诊断的重要方法之一，通过分析家族中的基因变异情况，可以预测家族成员的患病风险和病因。
6. 预测分析：依据已知的遗传变异和突变信息，利用统计学方法预测个体在某些疾病方面的遗传风险和患病可能性。
预测分析是基因诊断的一种重要手段，可以根据个体基因组中的变异情况，预测其在某些疾病方面的遗传风险。
基因诊断在预防、诊断和治疗疾病方面具有重要意义。
通过对个体基因组的分析，可以准确判断个体在某些疾病方面的遗传风险和患病可能性，为个体提供个体化的医学干预措施，从而有效预防和治疗疾病，提高生活质量和健康水平。
第九章 微生物 第十章 基因诊断PPT课件
（四）分子生物学检测
1、优点：敏感性高，直接测定病原体的遗 传物质
2、方法：PCR、核酸探针杂交技术
第二节.标本采集与运送：
总原则 ：
应用抗生素之前采集，采集病变部位比 如粪便要采集脓血部位，防止污染，避 免正常菌群对致病菌的污染，有些细菌 不耐冷，厌氧菌及时送检，标本应盛于 无菌、干燥、 有盖的容器内 ，透明盒身， 要可以看到标本性状。
（2）成年男性：先以肥皂水清洗尿道口，再 用清水冲洗，就可采集中段尿。
（3）婴幼儿：消毒外阴部或外生殖器，无 菌尿杯对准尿道口留取。
2、留置导尿的尿液应用注射器从尿袋近尿 道端吸取5ml，切不可直接从尿袋底部出口 留取。
3、厌氧培养时采用耻骨上膀胱穿刺术取尿 液。
4、抗酸杆菌染色检查，为提高检出率，可 留取24小时尿液,然后取部分沉淀送检.
2、标本应新鲜,采取粘液,脓血部位或絮状物12ml；成形粪便采取蚕豆大小。
3、婴幼儿或无大便者可用直肠拭子采取:无菌棉签 用生理盐水湿润后插入肛门4-5cm处转动取出于无 菌试管中送检。
（六）创伤口分泌液,脓液标本采集
1、自创面,感染面采集标本时,应先用无菌生理盐 水清洗表面,在以无菌棉签采取深部分泌物,(坏死 组织与正常组织相接部位)。
2、气管切开的患者，应在更换新气管套管 后自管内取标本。
3、肺结核患者结核分枝杆菌检查应采集较 多的痰液，若痰量少，应采集24小时痰液 以提高阳性率。
4、支气管分泌物,肺泡灌洗液由专业医师 采集
5、肺脓肿患者厌氧培养时，可直接在环甲 膜下穿刺抽取分泌物，排去空气后，插入 无菌的橡皮塞送检。也可用专用厌氧培养 运送管
2、脓肿可用注射器吸取脓液,如量少,也可用无菌 棉签采集。
3、厌氧培养应用针管抽取深部脓液，排出空气， 针尖插入无菌橡皮塞中送检。
基因诊断
三、基因诊断的常用技术
（五）单链构象多态性分析
1.单链构象多态性（SSCP）分析 是一种分析突变基因的方法。 2.临床意义 SCP多与PCR技术联用（PCR-SSCP）检测基因突变，提高了基因突变检 测的灵敏性，现已广泛用于遗传病及肿瘤基因的分析。
三、基因诊断的常用技术
（六） 限制性片段长度多态性分析
临床的一些疾病的致病基因尚不清楚，很难用基因突变的检测诊断，对 基因连锁分析
这些遗传疾病采用基因连锁分析
如mRNA拷贝定量检测及mRNA长度分析等。mRNA检测在基因表达 基因表达分析
水平上为基因功能是否正常提供了直接依据
病原体诊断 外来入侵病原微生物遗传物质的检测
二、基因诊断在诊断学中的地位
传统的疾病诊断方法：主要是以疾病的表观改变为依据，不能及时作出明确的诊断。 基因诊断：病因的诊断，既特异又灵敏。 （1）可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态； （2）可以对表观异常不明显或不特异的携带者及某种疾病的易感者做出诊断和预测； （3）对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。
基因诊断
一、基因诊断的含义
基因诊断是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断。它是以遗传物质 （如DNA或RNA）为检查对象，利用分子生物学技术，通过检查遗传物质结构或 表达量变化与否来诊断疾病的方法。
一、基因诊断的含义
基因诊断的主要内容
内容
评价
基因突变检测
如点突变、基因片段的缺失或插入、基因重排等不同类型基因突变的检 测
三、基因诊断的常用技术
（一）核酸分子杂交技术
1.核酸分子杂交：两条互补单链核酸（DNA或RNA）在一定条件下按碱基互补原则退火 形成双链的过程。 2.分子杂交方法的共同点 （1）应用了核酸序列的复性原理。 （2）采用了标记探针：同位素或非同位素标记的短片段特异DNA或RNA。
基因诊断的概念临床意义
迁移率，即可判断是否发生基因突变。在SSCP法检测到突变位点存在
的基础上，即可通过DNA序列测定得知确切的突变。 DNA芯片技术用于大规模未知突变的筛查，则更显示出该技术的优
越性。筛查n个碱基长度序列的每个碱基的变异，需要4×n个探针。如
在1.28cm2的支持物上原位合成16000个寡核苷酸探针，通过一次杂交 即可快速确定4kb序列内所有的点突变及其部位。
引物1 引物3 致病基因
5′
引物4 引物2
3′
引物1和2：可确定有无缺失及缺失片段的相对大小。引物3 和4：确定缺失部位。引物3和4的设计要通过研究来加以确 定。对于一些较长的基因，设计两端引物(1和2)进行扩增是 不合适的，PCR扩增2kb以上的片段比较困难。在这种情况
下可采用多重PCR的方法。
限制酶切割基因组时，所产生的限制性片段的数目和每个片段 的 长 度 就 不 同 ， 这 就 是 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (RFLP restriction fragment length polymorphism) 。 能 导 致 限 制 性片段发生改变的酶切位点又称为多态性位点。
限制酶酶切位点改变造成的RFLP可分为两种情况：①在 限制酶识别位点发生单个碱基置换，导致这一多态性位 点的丢失或获得，称为点多态性。这种多态性只有两个 等位片段，即多态性位点有或无。②由于限制酶识别位
其方法有两种：一种是根据已知的变异选用特定的限制
酶水解DNA，然后用特异探针进行Southern印迹杂交，
若存在疾病基因则显示与正常人不同舶杂交条带，据此 诊断疾病。另一方法是用PCR法将基因片段扩增后，再 用特定限制酶水解扩增产物，分析酶解后产物分子的大 小，判断是否有疾病基因。
如Lener遗传性视神经病，是由线粒体，DNA(mtDNA)发生突 变而引起的。大多数Lener病患者第11778位的G→A，这种转 换使Sfa N I酶切位点丧失。在该位点两端设计一对引物， PCR产物为340bp。正常个体的PCR产物经Sfa N I酶切后电泳，
基因诊断
诊断方法的选用
应用连锁分析诊断时应注意如下几个问题：①基因与DNA标记之间可能发生重组。因此连锁分析的准确性取 决于DNA与致病基因连锁的紧密程度，连锁愈紧密，可靠性愈高，故应采用尽量靠近致病基因，即连锁紧密的标 记，或采用多个遗传标记以尽可能排除重组。由于可能存在重组，连锁分析不能完全确定致病基因是否存在，而 是指出存在可能性或概率的大小。如果标记距基因有5cM，即重组率为5%，则作出诊断时尚有5%误差的可能，即 只有95%的把握作出肯定或否定的结论。②选用的遗传标记在人群中的杂合度。如果标记的杂合度在人群中很低， 即多数个体为纯合子，则这种标记用处不大。因为如家系中关键成员不能提供致病基因在哪一条染色体上的信息， 常使连锁分析无法进行，因此需选用人群中杂合度高的标记。③在连锁分析时，有时只分析一个多态位点还不能 把某一家系中带有致病基因的染色体与正常染色体区分开来。这通常是由于关键成员如待诊者的父母是纯合子， 不能提供必要的信息，这时可同时分析更多的多态位点，即作单倍型（haplotype）分析。单倍型是指一条染色 体上两个或两个以上多态位点的状态的组合。两条染色体多个位点上都纯合的概率毕竟是很小的，因此单倍型有 助于区分两条常染色体，并追踪致病基因的分离情况。
一、基因探针基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因， 也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。
基因诊断1．探针的来源 DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针 （genomic probe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNa探针（cDNa probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基 因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。2．探针的制备进行分子突变需要大量的探针拷贝，后者一般是通过 分子克隆（molecular cloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。
基因诊断ppt课件
合成原料：dNTP
(Polymerase Chain
反应过程：
（20-35个循环）
引物：一对
变性：95℃ 10-45s
高温DNA聚合酶： Taq
酶
退火：55-643;
H2O
精品课件
延伸: 72 ℃ 30-60s 23
3’ 5 ‘
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
• 外源基因的入侵
（感染性疾病）
精品课件
5
基因诊断的定义与特点
• 定义：
利用分子生物学技术，从DNA/RNA水 平检测基因的存在、分析基因的结构变异 和表达状态，从而对疾病作出诊断。
精品课件
6
• 特点：
1.直接检测导致疾病发生的基因改变，特异性强
2.应用PCR等信号放大技术，灵敏度高，需样品量少
硝酸纤维素膜（NC膜） 尼龙膜 PVDF膜等
(1) DNA印渍技术：
Southern Blotting
(2) RNA印渍技术：
Northern Blotting
(3) 蛋白质印渍技术：
Western Blotting
精品课件
13
探针的制备 样品的制备 电泳分离
预杂交 杂交
封闭样品中非特异性的结合位点 鲑精DNA、脱脂奶粉
转膜 杂交 结果检测
➢种类：DNA, RNA, 寡核苷酸 ➢标记物：
放射性核素，生物素，地高辛，荧 光素 ➢制备方法:
(1)化学法 (2) 酶促法： 精品课件末端标记；切口平移法；随10机引 物法
探针的制备
样品的制备
电泳分离 转膜 杂交
组织中提取：
基因组DNA/限杂交（in situ
(Polymerase Chain
反应过程：
（20-35个循环）
引物：一对
变性：95℃ 10-45s
高温DNA聚合酶： Taq
酶
退火：55-643;
H2O
精品课件
延伸: 72 ℃ 30-60s 23
3’ 5 ‘
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
• 外源基因的入侵
（感染性疾病）
精品课件
5
基因诊断的定义与特点
• 定义：
利用分子生物学技术，从DNA/RNA水 平检测基因的存在、分析基因的结构变异 和表达状态，从而对疾病作出诊断。
精品课件
6
• 特点：
1.直接检测导致疾病发生的基因改变，特异性强
2.应用PCR等信号放大技术，灵敏度高，需样品量少
硝酸纤维素膜（NC膜） 尼龙膜 PVDF膜等
(1) DNA印渍技术：
Southern Blotting
(2) RNA印渍技术：
Northern Blotting
(3) 蛋白质印渍技术：
Western Blotting
精品课件
13
探针的制备 样品的制备 电泳分离
预杂交 杂交
封闭样品中非特异性的结合位点 鲑精DNA、脱脂奶粉
转膜 杂交 结果检测
➢种类：DNA, RNA, 寡核苷酸 ➢标记物：
放射性核素，生物素，地高辛，荧 光素 ➢制备方法:
(1)化学法 (2) 酶促法： 精品课件末端标记；切口平移法；随10机引 物法
探针的制备
样品的制备
电泳分离 转膜 杂交
组织中提取：
基因组DNA/限杂交（in situ
基因诊断
（3）连锁分析(linkage analysis)
利用与致病基因相邻的某些基因或序 列，作为遗传标志，通过鉴定遗传标志的 存在而判断个体是否带有致病基因。
用于检测致病基因结构不清楚或基因突变 复杂的遗传性疾病。 属于间接诊断(不直接检测致病基因)
RFLP连锁分析原理
若致病基因与同一条染色体上的某一RFLP 存在连锁关系，则可从RFLP家谱分析中间 接推知致病基因的存在。
六、法医学个体鉴定
常用DNA指纹技术。 用于。
(女)
若基因突变(包括其他外显 子突变)，连锁18号外显子 中的Bcl I 酶切位点丧失
母亲及女性胎儿为 病变基因携带者
应用条件
1）能导致某一RFLP的遗传标志在人群中的出 现频率大于1%； 2）要有足够多的家系成员样本，以能确定遗传 标志与致病基因的连锁关系； 3）遗传标志与致病基因之间的距离越小越好， 以提高诊断的准确性。
DNA：主要，分析序列 RNA：定量分析mRNA
第二节
基因诊断的特点
1 针对性强，特异性高
基因异常
疾病
病因诊断
检测致病基因
2 灵敏度高
分子杂交：放射性同位素、酶、化学发光 试剂标记探针 PCR ：循环扩增至百万倍再分析致病基因
3 易获得稳定的结果
核酸特别是DNA比蛋白质稳定，样品要 求不高
基因诊断
Gene diagnosis
李 雅 楠
疾病产生原因：基因变异+环境因子
（1）内源基因变异
基因结构突变
基因表达异常
（2）外源基因入侵
第一节
基因诊断的概念
基因诊断(gene diagnosis) ：
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采集制备血液RNA→RT-PCR→产物测序→推 测氨基酸序列→进行诊断
二、β－地中海贫血 (β－Thalassaemia,简写βthal或βT)
β珠蛋白基因突变导致该多肽链的合成大为减少
（β＋）或完全缺失（β0） β珠蛋白合成速率降低，导致β链和α链合成的不 平衡→多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上→改变 了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。 高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人； 中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发 病率最高。 缺乏有效治疗措施。
高特异性 高灵敏度
获得稳定的结果
早期快速 适用性强，应用范围广
第二节 遗传病的基因诊断
一、概述
人类的遗传病达数千种 地中海贫血在意大利等国家发病率达10％ 镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14％ 我国常见的遗传性疾病有地中海贫血、异 常血红蛋白病和血友病。 有效治疗难；通过基因诊断进行携带者筛 查，产前早期诊断，降tu hybridization）
可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾 病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序
列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的
具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可 检出基因和基因产物的亚细胞定位。
（二）利用PCR及结合其他技术进行 基因诊断
（二）PKU的DNA诊断
①PCR/ASO探针法和PCR-RFLP连锁分 析法。 ②PCR/SSCP ③直接测序法—若待诊断的PKU家系的基 因突变类型尚属“未知”或无RFLP信 息。
利用PCR/ASO探针法诊断苯丙 酮尿症
先合成ASO 如： 正常探针： TCCATTAACAGTAAGAATTT 突变探针： TCCATTAACAATAAGAATTT
二、镰状细胞贫血
血红蛋白病（异常血红蛋白病） 红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫 血。 患者多在成年以前死亡
（一）镰状红细胞贫血分子机制
MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)
5´ 1.15kb 3´
×
5´ 1.35kb
5 6 7 正常基因 --Pro Glu Glu— --CCT GAG GAG-3´
1. 2. 3. 4. PCR—ASO PCR—测序 PCR—RFLP PCR－SSCP
第四节 感染性疾病的 基因诊断
一、感染性疾病基因 诊断的策略
1. 针对病原体特异的核酸序列设计探针进
行杂交 2. 应用PCR技术扩增病原体基因保守序列 3. 核酸杂交技术与PCR技术联合应用
特点
简便、特异、快捷 能检测出潜在的病原体 可对病原体进行分类、分型鉴定
（1）基因组探针法 用XP21区分离得到的不同探针如（P20）来进行相应内 切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。 （2）cDNA探针法 抗肌萎缩蛋白基因系列cDNA探针分析患者基因缺失、 外显子拼接改变和基因内部分重复。 （3）多重PCR法 如有人设计多对引物进行多重PCR扩增该基因的9个易 发缺失“热点区”DNA片段，可检出80%有基因缺失的 DMD患者。 （4）多态性分析法 基因内及其旁侧探针进行RFLP连锁分析。 （5）RT—PCR扩增该基因外显子（全长2.4MB、外显子起 来全长c14kb、用多对引物）可检出：外显子拼接异常。 联用测序：可定位基因缺失的起始和终止。
直接采用PCR进行基因诊断 采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCRRFLPs）进行基因诊断 采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO） 斑点杂交进行基因诊断 * 通过PCR产物的反相点杂交(RBD)进行基因诊断 采用PCR产物的单链构象多态性(SSCP)分析进行基 因诊断 采用PCR技术对靶核酸进行定量分析
核酸杂交方法分类
按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交
两种类型。
固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固 体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。 液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液 中。
固相杂交分类
Southern 印记杂交 Northern 印记杂交 斑点杂交 原位杂交
Southern blot
PCR/核酸杂交诊断艾滋病
目的基因 引物序列
扩增片段
env
5’ACAATTATTGTCTGGTATAG3’ 135 bp 5’AGGTATCTTTCCACAGCCAG3’ HIV-1
1.35kb
﹣
1.15kb
0.2kb
正常人 突变携带着 患者
+
镰状细胞贫血的基因诊断方法
PCR/限制性内切酶 设计引物→PCR扩增→产物进行限制性内切酶酶 切→电泳→EB染色→直接观察 例： 引物1：5’-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3’ 引物2：5’-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3’ 扩增产物294bp
五、苯丙酮尿症（PKU）
1、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。 2、主要特征： （1）苯丙氨酸
苯丙氨酸 羟化酶↓ （肝）
酪氨酸→多巴→儿茶酚胺
苯丙酮酸 酪胺 黑色素 （2）患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗，否则发生 不可逆大脑损害和严重智力发育障碍。
（一 ） PKU分子基础
（1）迄今约3/4的导致中国人PKU的突变基因已 被查清 ，它们分属11种PAH基因点突变。体外 研究表明，这些突变导致PAH活力↓或丧失。 （2）PAH第11外显子的第399密码GTA（val） →GTT（val）中性突变：①不改变任何限制酶 识别位点，故又称“序列多态性”。②这一 “序列多态性”在PKU患者和正常人中存在着 连锁不平衡性， 故可作为一种“遗传标记”应 用于产前诊断。
利用PCR/ASO探针法诊断苯丙 酮尿症
▽ ◎ ▽
正常探针 突变探针
△
▲
○
◎
●
△健康男性 ○健康女性
▽男性携带者 ◎女性携带者
▲男性患者 ●女性患者
第三节 肿瘤的基因诊断
肿瘤基因诊断的策略
1 通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤 慢粒：（染色体易位）费城染色体 PCR检测融合基因 检测肿瘤相关基因
（一）DMD分子基础：
抗肌萎缩蛋白基因长约2900kb，含79个外显 子。抗肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非 基因缺失型。 （1）DNA片段缺失（60%的病例→导致阅读框移 码→移码实变→致DMD，整码缺失→BMD）。缺 失的2个热点区①该基因5’端处②45~55外显子范 围内。 （2）非基因缺失型部分重复（病例的5%）
即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链
解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形
成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核
苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在
与其互补的同源核苷酸序列。
probe
probe
核酸杂交的关键要素
probe DNA target DNA signal detection
癌基因（ras）、抑癌基因（ p53）、肿瘤转移基因
2 3
检测肿瘤相关病毒基因 HBV HCV－肝癌 EB－鼻咽癌
4
检测肿瘤标志物基因或mRNA
肝癌—甲胎蛋白（AFP） 结肠癌—癌胚抗原（CEA）
引物A
1. 肿瘤标记物基因的检测
bcr-mRNA
染色体 22 着丝粒 染色体 9 c- abl gene bcr gene
目的基因 引物序列 扩增片段
C
5’ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT3’ 425 bp 5’AGTGCGAATCCACACTC3’
*HIV病毒基因组结构
长末端 重复序列
正常的病毒基因
调节蛋白基因
LTR
gag
pol
env
tat，rev LTR
调节和 产生病毒 启动转录 核心蛋白
产生逆转录 产生病毒 附加基因 酶和整合酶 外膜蛋白
（一） β地贫病的分子基础
β珠蛋白基因全长2053bp，含2个内含子 （IVS－I和IVS-II），3个外显子。 目前发现突变有百余种，中国人群发现约 20种； 一般对特定种族来说，90%的β地贫基因仅 由4～6种突变组成。
（二） β地中海贫血的基因诊断
PCR/ASO斑点杂交法 合成2对PCR引物（扩增区段700bp和 580bp，分别包含14种和1种可能突变）→ 合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（4～6对， 分别标记） →制备DNA样品 →PCR扩增 →斑点印迹杂交 RFLP分析法
5 6 7 --Pro Ala Glu— --CCT GTG GAG--
突变基因
（二）镰状细胞贫血的基因诊断方 法
限制性内切酶/Southern blot
采集制备血液DNA→内切酶MstⅡ消化→电 泳→转膜→32P标记的β 珠蛋白cDNA杂交→ 放射自显影
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
1. PCR—SSCP 2. PCR—测序 3. PCR—RFLP
㈢ 其它基因的 检测
PCR结合其它技术 基因芯片
4、肿瘤标志物检测或mRNA诊断
肿瘤标志物 是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和 发展相关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、 同工酶等。 基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）
检测方法：
第九章
基因诊断
第一节 基因诊断的概念 及常用技术
一、基本概念
基因诊断—利用分子生物学技术， 从DNA/RNA水平检测基因的存在, 分析基因的结构变异和表达状态， 从而对疾病作出诊断。
二、基因诊断常用方法
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ 核酸分子杂交 PCR DNA序列测定 DNA芯片技术
(一)
核酸杂交
基本原理-------核酸变性和复性理论
是最经典的基因分析方法，不但能检出特异 的DNA片段，而且能进行定量和测定分子 量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变 分析等。
Northern杂交
用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA 或mRNA进行定性和定量分析。
二、β－地中海贫血 (β－Thalassaemia,简写βthal或βT)
β珠蛋白基因突变导致该多肽链的合成大为减少
（β＋）或完全缺失（β0） β珠蛋白合成速率降低，导致β链和α链合成的不 平衡→多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上→改变 了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。 高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人； 中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发 病率最高。 缺乏有效治疗措施。
高特异性 高灵敏度
获得稳定的结果
早期快速 适用性强，应用范围广
第二节 遗传病的基因诊断
一、概述
人类的遗传病达数千种 地中海贫血在意大利等国家发病率达10％ 镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14％ 我国常见的遗传性疾病有地中海贫血、异 常血红蛋白病和血友病。 有效治疗难；通过基因诊断进行携带者筛 查，产前早期诊断，降tu hybridization）
可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾 病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序
列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的
具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可 检出基因和基因产物的亚细胞定位。
（二）利用PCR及结合其他技术进行 基因诊断
（二）PKU的DNA诊断
①PCR/ASO探针法和PCR-RFLP连锁分 析法。 ②PCR/SSCP ③直接测序法—若待诊断的PKU家系的基 因突变类型尚属“未知”或无RFLP信 息。
利用PCR/ASO探针法诊断苯丙 酮尿症
先合成ASO 如： 正常探针： TCCATTAACAGTAAGAATTT 突变探针： TCCATTAACAATAAGAATTT
二、镰状细胞贫血
血红蛋白病（异常血红蛋白病） 红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫 血。 患者多在成年以前死亡
（一）镰状红细胞贫血分子机制
MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)
5´ 1.15kb 3´
×
5´ 1.35kb
5 6 7 正常基因 --Pro Glu Glu— --CCT GAG GAG-3´
1. 2. 3. 4. PCR—ASO PCR—测序 PCR—RFLP PCR－SSCP
第四节 感染性疾病的 基因诊断
一、感染性疾病基因 诊断的策略
1. 针对病原体特异的核酸序列设计探针进
行杂交 2. 应用PCR技术扩增病原体基因保守序列 3. 核酸杂交技术与PCR技术联合应用
特点
简便、特异、快捷 能检测出潜在的病原体 可对病原体进行分类、分型鉴定
（1）基因组探针法 用XP21区分离得到的不同探针如（P20）来进行相应内 切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。 （2）cDNA探针法 抗肌萎缩蛋白基因系列cDNA探针分析患者基因缺失、 外显子拼接改变和基因内部分重复。 （3）多重PCR法 如有人设计多对引物进行多重PCR扩增该基因的9个易 发缺失“热点区”DNA片段，可检出80%有基因缺失的 DMD患者。 （4）多态性分析法 基因内及其旁侧探针进行RFLP连锁分析。 （5）RT—PCR扩增该基因外显子（全长2.4MB、外显子起 来全长c14kb、用多对引物）可检出：外显子拼接异常。 联用测序：可定位基因缺失的起始和终止。
直接采用PCR进行基因诊断 采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCRRFLPs）进行基因诊断 采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO） 斑点杂交进行基因诊断 * 通过PCR产物的反相点杂交(RBD)进行基因诊断 采用PCR产物的单链构象多态性(SSCP)分析进行基 因诊断 采用PCR技术对靶核酸进行定量分析
核酸杂交方法分类
按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交
两种类型。
固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固 体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。 液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液 中。
固相杂交分类
Southern 印记杂交 Northern 印记杂交 斑点杂交 原位杂交
Southern blot
PCR/核酸杂交诊断艾滋病
目的基因 引物序列
扩增片段
env
5’ACAATTATTGTCTGGTATAG3’ 135 bp 5’AGGTATCTTTCCACAGCCAG3’ HIV-1
1.35kb
﹣
1.15kb
0.2kb
正常人 突变携带着 患者
+
镰状细胞贫血的基因诊断方法
PCR/限制性内切酶 设计引物→PCR扩增→产物进行限制性内切酶酶 切→电泳→EB染色→直接观察 例： 引物1：5’-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3’ 引物2：5’-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3’ 扩增产物294bp
五、苯丙酮尿症（PKU）
1、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。 2、主要特征： （1）苯丙氨酸
苯丙氨酸 羟化酶↓ （肝）
酪氨酸→多巴→儿茶酚胺
苯丙酮酸 酪胺 黑色素 （2）患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗，否则发生 不可逆大脑损害和严重智力发育障碍。
（一 ） PKU分子基础
（1）迄今约3/4的导致中国人PKU的突变基因已 被查清 ，它们分属11种PAH基因点突变。体外 研究表明，这些突变导致PAH活力↓或丧失。 （2）PAH第11外显子的第399密码GTA（val） →GTT（val）中性突变：①不改变任何限制酶 识别位点，故又称“序列多态性”。②这一 “序列多态性”在PKU患者和正常人中存在着 连锁不平衡性， 故可作为一种“遗传标记”应 用于产前诊断。
利用PCR/ASO探针法诊断苯丙 酮尿症
▽ ◎ ▽
正常探针 突变探针
△
▲
○
◎
●
△健康男性 ○健康女性
▽男性携带者 ◎女性携带者
▲男性患者 ●女性患者
第三节 肿瘤的基因诊断
肿瘤基因诊断的策略
1 通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤 慢粒：（染色体易位）费城染色体 PCR检测融合基因 检测肿瘤相关基因
（一）DMD分子基础：
抗肌萎缩蛋白基因长约2900kb，含79个外显 子。抗肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非 基因缺失型。 （1）DNA片段缺失（60%的病例→导致阅读框移 码→移码实变→致DMD，整码缺失→BMD）。缺 失的2个热点区①该基因5’端处②45~55外显子范 围内。 （2）非基因缺失型部分重复（病例的5%）
即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链
解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形
成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核
苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在
与其互补的同源核苷酸序列。
probe
probe
核酸杂交的关键要素
probe DNA target DNA signal detection
癌基因（ras）、抑癌基因（ p53）、肿瘤转移基因
2 3
检测肿瘤相关病毒基因 HBV HCV－肝癌 EB－鼻咽癌
4
检测肿瘤标志物基因或mRNA
肝癌—甲胎蛋白（AFP） 结肠癌—癌胚抗原（CEA）
引物A
1. 肿瘤标记物基因的检测
bcr-mRNA
染色体 22 着丝粒 染色体 9 c- abl gene bcr gene
目的基因 引物序列 扩增片段
C
5’ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT3’ 425 bp 5’AGTGCGAATCCACACTC3’
*HIV病毒基因组结构
长末端 重复序列
正常的病毒基因
调节蛋白基因
LTR
gag
pol
env
tat，rev LTR
调节和 产生病毒 启动转录 核心蛋白
产生逆转录 产生病毒 附加基因 酶和整合酶 外膜蛋白
（一） β地贫病的分子基础
β珠蛋白基因全长2053bp，含2个内含子 （IVS－I和IVS-II），3个外显子。 目前发现突变有百余种，中国人群发现约 20种； 一般对特定种族来说，90%的β地贫基因仅 由4～6种突变组成。
（二） β地中海贫血的基因诊断
PCR/ASO斑点杂交法 合成2对PCR引物（扩增区段700bp和 580bp，分别包含14种和1种可能突变）→ 合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（4～6对， 分别标记） →制备DNA样品 →PCR扩增 →斑点印迹杂交 RFLP分析法
5 6 7 --Pro Ala Glu— --CCT GTG GAG--
突变基因
（二）镰状细胞贫血的基因诊断方 法
限制性内切酶/Southern blot
采集制备血液DNA→内切酶MstⅡ消化→电 泳→转膜→32P标记的β 珠蛋白cDNA杂交→ 放射自显影
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
1. PCR—SSCP 2. PCR—测序 3. PCR—RFLP
㈢ 其它基因的 检测
PCR结合其它技术 基因芯片
4、肿瘤标志物检测或mRNA诊断
肿瘤标志物 是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和 发展相关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、 同工酶等。 基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）
检测方法：
第九章
基因诊断
第一节 基因诊断的概念 及常用技术
一、基本概念
基因诊断—利用分子生物学技术， 从DNA/RNA水平检测基因的存在, 分析基因的结构变异和表达状态， 从而对疾病作出诊断。
二、基因诊断常用方法
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ 核酸分子杂交 PCR DNA序列测定 DNA芯片技术
(一)
核酸杂交
基本原理-------核酸变性和复性理论
是最经典的基因分析方法，不但能检出特异 的DNA片段，而且能进行定量和测定分子 量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变 分析等。
Northern杂交
用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA 或mRNA进行定性和定量分析。