生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制
发酵工程原理与技术第二章
施加选择压力的分离方法
分批式富集培养（摇瓶培养） 重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可 将优势微生物分离出来。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
施加选择压力的分离方法
连续富集培养： 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。 改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。
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几个应注意的问题
（1）出发菌株 出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。
几个应注意的问题
（2）复合诱变因素的使用 野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；老
菌种单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合 因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。
青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变， 再用UV处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可 获得高产菌株。
诱变育种
诱变育种理论基础：基因突变。
自然突变：自然条件下出现的基因突变。
诱发突变：用各种物理和生物因素、化学 因素人工诱发的基因突变。
诱变剂处理使菌种发生突变频率和变异幅度提 高—获得特性优良变异菌株的几率高。
诱变育种主要步骤
出发菌株的诱变处理 和 突变体的筛选。
前进
出发菌株诱变处理
包括：
出发菌株的选择 诱变剂的选择 诱变剂量和处理时间的确定
几个应注意的问题
乙烯亚胺和UV复合处理，氯化锂和UV复合处理，都 用得较普遍，且有一定成效。
氯化锂本身无诱变作用，与一些诱变因子一起使用时 能促进突变。
几个应注意的问题
（3）剂量选择
变异率取决于诱变剂量，变异率和致死率之间有一 定关系。用致死率作为选择适宜剂量的依据。
合适剂量：同时增加变异幅度与正突变。
生物化学代谢部分课件-物质代谢的调节及代谢网络3
与酶之间的相互作用；
• 有机分子与酶或蛋白质受体之间的相互作用； • 底物与酶分子之间的识别以及相互作用； • 无机金属离子与生物大分子之间的相互作用，如金
属离子与酶或蛋白质之间的络合及与生物小分子 （辅酶、ATP等）之间的络合作用。
激素可改变酶的催化活性或含量，也可改变 细胞内代谢物的浓度，从而影响代谢反应的速 度--激素水平的调节。高等动物不仅有完整的 内分泌系统，还有功能复杂的神经系统。在中 枢神经的控制下，或者通过神经递质对效应器 直接发生影响，或通过改变某些激素的分泌来 调节某些细胞的功能状态，并通过各种激素的 互相协调对整体代谢进行综合调节--整体水平 的调节。
A.
B.
疫
蛋泛 白素
泛 素
内 源
酶化 蛋 性
体的 白 抗
降内 解源 成性 肽抗
酶 体 降 解
原 在 胞
段原 途 内
被径的 28 降
S
免解
酶原的激活
• 有些酶在生物体内合成出来的是它的无活性前 体--酶原。一定的条件下，这些酶原水解去除 一部分肽链，使酶的构象发生变化，形成有活 性的酶分子—酶原激活。酶原从无活性状态转 变成有活性状态的过程是不可逆的。属于这种 类型的酶有消化系统的酶（如胰蛋白酶、胰凝 乳蛋白酶和胃蛋白酶等）以及凝血酶等。
（1）被修饰的酶可以有两种互变形式，一种为 活性形式（具有催化活性），另一种为非活性 形式（无催化活性）。正反两个方向的互变均 发生共价修饰反应，且都将引起酶活性的变化。
（2）共价修饰调节作用可以产生酶的连续激活 现象，具有信号放大效应。例如肾上腺素引起 糖原分解过程中的一系列磷酸化激活步骤，其 结果将激素的信号逐级放大了约300万倍。
细菌生态学的分子调控机制
细菌生态学的分子调控机制细菌是存在于自然界中的一类微生物，它们在许多生物系统中有着关键的作用。
如何维持细菌数量、调节生长发育以及进化适应生存环境，是细菌生态学中非常关键的问题。
在近年的研究中，细菌生态学的分子调控机制逐渐成为人们研究的热点，本文就围绕这个话题进行探讨。
一、概述细菌生态学的分子调控机制主要包括基因调控、信号转导、代谢调控等多个方面。
其中基因调控是细菌生长发育及适应环境的重要手段，通过改变细胞内关键代谢途径的活性、使外界信号传导停止或启动来调整细胞内基因转录活性，实现了对外界环境变化的响应。
此外，代谢调控是细菌适应生存环境的另一种重要方式，包括利用代谢产物进行共生、利用代谢产物调控群体行为等。
二、基因调控基因调控是细菌适应环境变化的重要机制之一。
研究表明，细菌通过细胞内的一系列蛋白质互作、信号传递，来调节关键代谢途径的活性，以及控制细胞内特定基因的转录。
1. 转录调控转录调控是细菌基因调控的主要途径之一。
其机制主要是基于转录因子所提供的DNA结合位点和其与区域间区分基序之间匹配的特异性，从而实现特定基因的转录活性进行调整。
2. 翻译后调控翻译后调控是通过翻译后调控元件来实现对特定基因或信号通路的调节。
三、信号转导信号转导是一类分子通讯的过程，其基本机制是通过一系列的信号分子，将外部信号转导至细胞内部，重新组装、激活、使得信号得以传导，从而启动内部信号通路的响应，实现整个生物体的适应性调整。
1. 激酶/受体的信号传递利用激酶和受体蛋白的组合使特定信号分子的信息传至细胞内部，从而通过后续级联或非级联信号传递机制，使得目标基因的表达或活性受到调整。
2. 二级信号通路的调控细胞内二级信号通路的调控是通过内部分子的运动、聚合、作用来实现激活、阻抗、稳态、调适等作用进行调节。
四、代谢调控代谢调控的基本思路是：利用代谢产物的作用、效应或者代谢功能促进和调控“个体”和“群体”的生长，致使其适应性增强。
3、微生物的代谢调节
B 环状3‘，5’－腺苷单磷酸（C‘AMP）的不足
支持低生长速率的碳源比迅速利用的碳源造成细 胞内更高的C‘AMP浓度。
环化AMP在细胞内的浓度与供给ATP 的多少成反 比。环状AMP在真核生物中不仅在酶的表达方面而且 在细胞分化方面起作用。
应当注意：一种能源可起分解代谢阻遏物作用的 效能不取决于它的特有的化学结构，只取决于它作为 碳和能源的效率。 在一种生物中可最为有效地起分解代谢阻遏物作 用的化合物可能在另一生物中并不起作用。
B 分枝途径的终点产物阻遏作用
分枝生物合成途径上的酶合成的阻遏作用机制很复 杂。如表3－3所示。
C 细菌调节机制的多样性
从生化观点看大多数微生物的生物合成途径都是 相同的。但是同一途径在不同的生物中可能受到不同 方式的调节。这种调节型式往往存在族的特异性。 从生化角度看各种不同的细菌类群的分解代谢途 径亦是相同的，其调节方式既不相同又呈族特异性。
3.8 微生物代谢的协调作用
为了生长和维持生命活力，微生物必须进行大量的 酶催化反应。以提供能量和中间体，又转化为大约 2000种蛋白质（DNA和三种类型的RNA，粘多肽，多 糖，辅酶和脂质）。它再利用这些高聚物来形成细胞 的结构（核、核辩体、细胞壁、细胞膜和线粒体）。
尽管其基因型是稳定的，微生物在改变其成份和 代谢以响应环境的变化方面具有惊人的灵活性。
细胞大分子成分随生长速率的变化可解释如下：
快速生长的细胞必须比缓慢生长的细胞合成蛋白 质快得多，这种高速蛋白质合成要求细胞含有更多的 核糖体，因单位核糖体的蛋白质合成速率是不变的。 细菌具有调整它的核糖体含量的能力。这对在环 境条件变化下维持高速率生长有着很重要的意义。 对核糖体的补给不足常会明显地限制生长速率， 核糖体的过量也会这样。
环境生态学重点章节重点知识点
第一章生态学的定义:生态学是研究生物与它所在地关系的一门学科生态学的研究对象:用“组织层次”或称为“生物学普”来表示生态学的研究对象。
每个组织层次和其环境的相互作用组成了其独有的功能系统。
生态学的分支学科:按生物类群分为动物生态学植物和微生物;按环境或栖息地分为陆地生态学淡水和海洋;按理论与人口资源环境等有应用生态学。
生态学的研究方法:1宏观研究与微观研究结合2野外调查实验室和长期定位实验结合3多学科交叉综合研究4系统分析方法和数学模型应用5新技术的应用种群生态学:研究栖息在同一地域同种生物个体的集合体所具有的特性,包括种群的年龄组成,型比例,数量变动与调节等及其与环境的关系。
群落生态学:研究栖息于同一地域中所有种群集合体的组合特性,他们之间及其与环境之间的相互关系,群落的形成与发展等。
环境生态学:环境科学与生态学之间的交叉学科,是研究认为干扰下,生态系统内在的变化肌理规律和对人类的反效应,寻求受损生态系统恢复,重建和保护对策的科学,既运用生态学理论,阐明人与环境间相互作用及解决环境问题的生态途径。
环境问题:是指环境中出现的各种不利于人类生存和发展的现象,分为原生环境问题和次生环境问题。
当前人类面临的主要环境问题:人口,资源,环境污染,生态破坏问题。
与人类的活动密切相关,人类活动超过了环境的承受能力,对自然生态系统的结构和功能产生了破坏作用,与生存环境不协调。
第二章环境及其类型:环境是指某一特定生物体或生物群体以外的空间,以及直接或间接影响生物体或生物群体生存的一切事物的总和。
分为宇宙环境,地球环境区域环境,微环境,内环境。
生态因子:对生物生长、发育、生殖、行为和分布等生命活动有直接或间接影响的环境要素。
类型:气候因子包括光温度湿度降水风和气压等,土壤因子地形因子生物因子和人为因子主要指人类对生物和环境的各种作用,随着人类生产能力的提高,人类活动对各种生物的影响和对环境的改变的作用越来越大。
生态因子作用的一般特征:综合作用,主导因子作用,直接作用和间接作用,阶段性作用,不可替代性和补偿作用生态因子作用的规律:1限制因子规律生物的生存和繁殖依赖于各种生态因子的综合作用,其中限制生物生存和繁殖的关键因子就是限制因子,2liebig最小因子定律生物的生长取决于环境中那些处于最小量状态的营养物质,3shelford耐性定律任何一个生态因子在数量上或质量上的不足或过多,就会影响该物种的生存和分布,那些对生态因子具有较大耐受范围的种类,分布较广,为广适性生物,反之为狭适性生物。
微生物育种学的主要原理和技术
微生物育种学的主要原理和技术摘要微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法。
微生物的育种技术已从常规的突变和筛选技术发展到基因诱变、基因重组和基因工程等，育种技术的不断成熟，大大提高了微生物的育种效果。
本文将讲述微生物育种学的主要原理和技术。
关键词：微生物育种原理方法技术1.微生物育种学的主要原理微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法。
其原理如下：生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制→不会有代谢产物的积累→解除或突破微生物的代谢调节控制→目的产物积累→微生物育种的目的2.微生物育种学的主要技术2.1 自然选育就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。
一般认为自然突变有两种原因引起，即多因素低剂量效应和互变异构效应。
所谓多因素低剂量效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等作用引起的突变。
互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配。
自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。
为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。
自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。
但是自然选育的效率低，因此经常要与诱变育种交替使用，以提高育种效率。
由于DNA的半保留复制以及校正酶系的校正作用和光修复、切除修复、重组修复、诱导修复等作用，使得自发突变几率极低，一般为10-6～10–10。
所以常规育种时间较长，工作量较大。
通过常规育种提高菌种生产能力、筛选高产菌株的效率较低，效果不明显。
01微生物细胞中代谢调节的部位与举措
录，翻译系统组成一个大复合物（包括 RNA （前体 MRNA）然后通过剪切甲基化等加工，
转录到蛋白பைடு நூலகம்合成全套因子）转录、翻译相 剩下部分连接起来成为成熟的 mRNA。
偶联，结构基因与 mRNA 是共线的。
3. 真核生物中功能相关的基因（称因基
3. 原核生物有关功能的基因连锁（彼此 簇）常距很远，甚至位于不同的染色体上，
3. 酶和底物的相对位置 限制酶与基质的有形接触（代谢途径的区域化）
二、真核微生物细胞的代谢调节部位
图 2—2 真核微生物细胞的代谢调节部位 1-可溶性营养物质或代谢产物的跨膜传送 2-代谢途径的酶的催化 3-核中进行的转录 4-细胞质中进行的翻译 5-细胞内溶质的跨膜传送
三、原核生物和真核生物在 基因表达上的重要区别
（一）与细胞质膜密切相关的调节
1. 膜的脂质（磷脂及其它脂类）的分子结构，以 及环境条件（如离子强度、温度、pH等）对膜 脂质理化性质的影响。
2. 膜蛋白（如酶、载体蛋白、电子传递链的成员 及其它蛋白质）的绝对数量及其活性的调节。
3. 跨膜的电化学梯度以及ATP、ADP、AMP体系 及无机（P）浓度对溶质输送的调节。
表 2—4 生物进化与代谢调节机制的出现
神经水平的调节
激素水平的调节
动
细胞水平的调节
单细
植物
物
胞生
酶水平的调节
物
五、微生物细胞的代谢调节的主要举措
1. 酶合成的调节 2. 酶活性的调节 3. 能荷的调节 4.细胞膜透性的调节
控制，其基因调控比较简单。不同染色体数
2. 真核生物基因的转录在核，转录在胞
目为 1。
质中。基因在核内形成前体 mRNA 与胞质成
生物工艺原理 重点1
1.生物工程一般是医学工程、农业工程、环境工程,卫生工程、人体功能工程等的总称，特点是不涉及化学催化反应过程，仅是生物过程与物理过程的结合。
生物技术（又称生物工艺学）则涉及的是生物催化反应过程。
2.生物工艺：生物技术是一门多学科、综合性的科学技术；过程中需生物催化剂参与；目的是建立工业生产过程或进行社会服务。
3.胞内酶：在细胞内起催化作用的酶，这些酶在细胞内常与颗粒体结合并有着一定的分布。
胞外酶：细胞内合成而在细胞外起作用的酶。
4.初级代谢产物：对数生长期形成的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸等，是菌体自身生长繁殖所必须的，称初级代谢产物或中间代谢产物。
它们受许多调节机制的控制。
次级代谢产物：在生长的稳定期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。
它们与菌体生长繁殖无明显关系，称为次级代谢产物，它也受许多调节机制的控制，如诱导调节、分解代谢物的阻遏和反馈调节等。
5.微生物的生物转化：利用微生物细胞的一种或多种酶对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。
6.现代生物技术：以DNA重组为主要手段，依靠清洁、经济的生物反应器，利用可再生性资源加工人类所需产品的具有可持续发展特性的技术。
包括：基因工程、细胞工程、酶工程，发酵工程。
基因工程在其中处于主导地位。
7.生物过程工程：尽管生物过程所生产的产品性质、加工方法、工艺流程以及设备型式等完全不同，甚至差异很大。
但却有共同点，即从原料转变为产品，均包括一系列生物反应过程、化学反应过程和物理操作过程，按照不同方式串联或并联而成。
生物反应过程是具有决定意义的一步。
是生物生产过程的核心，其他过程是为生物反应过程服务的。
8.工程理念：研究工业生产过程系统规律性的科学，实际上是探索如何有效地在合理的生产设备将原料转变为工业产品的科学。
对待任何工程问题，均需有以下四种工程理念：理论上的正确性技术上的可行性操作上的安全性经济上的合理性（核心）9.生产选种：是在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。
生物工艺学第二章 微生物代谢调节及其在工业生产中的应用
工业发酵的五字策略
在“ 载流路径 ” 、“ 代谢主流 ” 和“ 五段 式 ” 等概念的基础上，从统筹的角度出 发，提出能作为一个整体用于设计育种以及 发酵工艺控制的五字策略 ： \进 \通 \节 \堵 \出
①进，促进细胞对碳源营养物质的吸收；
②通，使来自上游和各个注入分支的碳架物 质能畅通地流向目的产物；
五 初级代谢产物的代谢调节
1 初级代谢： 能使营养物质转变成机体的结构物质和对机
体具有生理活性作用的物质或是为机体生长 提供能量的一类代谢； 产物有单糖、核苷酸、脂肪酸、蛋白质、核 酸、多糖、脂类等； 普遍存在于生物中的代谢类型，合成障碍， 引起生长停止，甚至死亡。
2 提高初级代谢产物产量的方法：
研究代谢工程的目的：精确地处理好微生物 细胞自身的利益与人类对微生物细胞提出的 要求之间的对立与统一的关系。
微生物生物工程的难题
既然微生物的代谢主流对网络中的途径有 自主的选择性，而工业发酵的目标又是要 微生物的代谢主流经理想载流途径，流到 目的产物，因此就有必要去解决理想载流 途径的设计问题和对代谢主流的合理导向 问题。
（7）改变细胞膜的通透性
理论基础：细胞内形成的代谢产物排出细胞 时，也与细胞膜的结构有关；
当控制物理、化学条件或者筛选细胞膜、细胞 壁结构组成的突变株以改进物质的进出速率， 影响代谢过程时，都有可能造成代谢产物的过 量生产；
例子：谷氨酸生产。
（8）筛选抗生素抗性突变株
一些主要抗生素的作用机制已比较清楚，筛选抗 生素抗性突变体——改变代谢调节——获得过量 生产。
②带实心箭头的虚线标示阻遏。
1 影响酶活性的调节模式（共 11 种）
①只有一个终端产物的（没有分支的）途径的 调节模式（共 3 种）
第二章微生物育种的原理和方法
第二章 微生物育种的原理和方法微生物育种原理和方法微生物育种筛选方法微生物育种原理和方法一、微生物育种原理方法：突变、体内重组体外重组（基因工程）1、从自然界中获得新菌种微生物资源分布：土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所2、分离微生物新种的步骤 采样、增殖、纯化和性能测定等步骤3、典型的微生物采样和筛选方法生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制不会有代谢产物的积累解除或突破微生物的代谢调节控制目的产物积累微生物育种的目的直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。
往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产二、诱变育种方法1、物理诱变：紫外线2、化学诱变：5-溴尿密啶1）紫外线诱变机理：造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应2）诱变过程中需要注意光复活作用：微生物等生物的细胞内存在光复活酶，光复活酶识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物（此时的光复活酶没有活性），可见光光能（300-500nm）激活光复活打开二聚体，将DNA复原。
暗修复：细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活，可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。
暗修复体系有四种酶参与反应。
紫外诱变的特点：方便、诱变效果很好的常用诱变剂由此说明紫外线照射引起微生物突体形成是一个复杂的生物学过程。
紫外线引起DNA结构的改变仅仅使微生物，于亚稳定状态，点亚稳定到稳定的突变体的形成需要“定时间和过程，所以在实际诱变工作中要采取某些措施避免以上的修复作用，要注意避光或加入某些物质，提高突变的频率。
因此，用紫外线进行诱变时，照射或分离均应在红光下进行。
3）化学诱变剂诱变机理：5-溴尿嘧啶诱变——碱基类似物机理：与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应注意的参数：参数：浓度、时间、缓冲液三、诱变育种的基本过程诱变育种的基本过程如下：1）出发菌株的选择A、一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。
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表皮葡萄球菌能产生一种内肽酶——葡萄球菌素，溶解
•革兰氏阴性菌不能直接溶壁，只有当乙二胺四乙酸 （EDTA）存在时，某些革兰氏阴性菌的细胞壁才能够被 溶菌酶溶解。
•放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌也可采用溶菌酶 •真菌细胞壁主要由纤维素、几丁质和葡聚糖等组成
青霉菌多用纤维素酶和-1,3-糖苷酶等溶壁
• 平皿快速检测法
平皿快速检测法是利用菌体在特定 固体培养基平板上的生理生化反应， 将肉眼观察不到的产量性状转化成 可见的“形态”变化。
纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生 长圈法和抑制圈法等。——定性或半定量 用 ，大大提高筛选的效率 ——初筛
微生物特异性平板检测方法
饱浸含某种指示 剂的固体培养基 的滤纸片变色圈
产孢子或芽孢的微生物最 好采用其孢子或芽孢
菌悬液的细胞浓度一般控制为： 真菌孢子或酵母细胞106107个/ml，放线菌或 细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水 （0.85%NaCl）稀释。 •诱变处理 合适诱变剂量的选择 在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体 死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。 就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但 达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。 致死率在70%-80%
致死 营养缺陷
抗性突变菌株的筛选方法 • 一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中， 一次性筛选出少量抗性变异株。
噬菌体抗性菌株
耐高温菌株
• 阶梯性筛选法
梯度平板法
纸片扩散法 用打孔器将较厚的滤纸（如新华六号）打成小圆片，并使 纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布 了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放臵三片 为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的 可能就是抗性菌。
曲霉用-1,3-糖苷酶和-1,4-糖苷酶等 蜗牛酶
酵母菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质
原生质体制备的其他因素：
• 培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解
•在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性 •在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感
•菌龄：对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感
天冬氨酸激酶(AK)被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制
通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株， 该突变型不能产生苏氨酸。
在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长， 并且因为消除了反馈抑制
突变型能过量生产L-赖氨酸
抗阻遏和抗反馈突变型 抗阻遏和抗反馈突变型都是由于代谢失调所造成的， 在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地 合成这一产物。
诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。
4.2.2 菌种筛选的策略 筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求
初筛：要力求快速、简便 复筛：应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平
(1)从菌体形态变异分析——初筛 有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，在筛 选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。
酮式的5-BU结构与胸腺 嘧啶相似 ，与A配对
5-BU很容易进行酮式与 烯醇式结构的互变异构
烯醇式5-BU不与A而与G配对
参数：浓度、时间、缓冲液
A：TG：C
诱变育种的基本过程如下：
合适诱变剂量的选择 在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体 死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。
• 出发菌株的选择 一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或 潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶 系的基因。 菌株来源 •自然界直接分离到的野生型菌株 •经历过生产条件考验的菌株 •已经历多次育种处理的菌株 其次是出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生 长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。
4、工业微生物育种
生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制
不会有代谢产物的积累
解除或突破微生物的代谢调节控制 目的产物积累
方法：突变、体内重组 体外重组（基因工程）
微生物育种的目的
4.1从自然界中获得新菌种 微生物资源分布
土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生 物的主要栖居和生长繁殖场所
分离微生物新种的步骤 采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。
固体培养基中渗入溶解性 差、可被特定菌利用的营 养成分，造成不透明的培 养基背景。菌落利用此物 质形成透明圈。
指示剂直接掺入或喷洒固 体培养基，菌落周围形成 变色圈。如淀粉的平皿上 喷上稀碘液
待筛选的菌株能 分泌产生某些能 利用一些有特别营养要 抑制工具菌生长 求的微生物作为工具菌， 的物质 如待筛选菌具有该营养 物的前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕 该菌生长
重组子的检出方法有两种：
直接法 将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的 高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子 间接法 把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株 和重组子都再生成菌落 ，然后用影印法将它们复制到 选择培养基上检出重组子。
融合重组子
融合重组的频率 = 两亲株原生质体再生菌落的总数 4.3.2 杂交育种
•一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性
原生质体融合
•聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合 •一般PEG的使用浓度范围在25-40% •采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合 原生质体再生 •使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细胞形态结构
•不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个 共同点是都需要高渗透压 再生率 细菌为3-10% 真菌在20-80% 融合重组子的筛选 通过两亲株遗传标记的互补而得以识别 两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组 子应是A+B+或A-B-
典型的微生物 采样和筛选方法
直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。 往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一 步的人工改造才能真正用于工业生产
菌种选育
突变、体内重组 体外重组（基因工程）
4.2 诱变育种 物理诱变 化学诱变 4.2.1 紫外线诱变 紫外线 5-溴尿密啶 机理
造成DNA链的断裂，或使DNA分子 内或分子之间发生交联反应
选育结构类似物抗性突变株
结构类似物是指一些和 细菌体内氨基酸、嘌呤、 维生素等代谢产物结构 相类似的物质
主要用于末端产物的积累
抗性突变菌株的筛选 抗生素抗性突变株 • 在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗 性突变可提高抗生素产量。 • 抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外， 还能提高其它代谢产物的量。 条件抗性突变 • 因环境不同，能表现为"野生型"菌株的特性和突变型 菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。 •温度敏感突变常用于 提高代谢产物产量
组成酶变异株的筛选
诱导酶的生产需要诱导物，而且受到 诱导物的种类、数量以及分解产物的 影响。能迅速利用的碳源（如葡萄糖） 会引起酶合成的减少，诱导物有时又 比较昂贵。
生产成本提高
控制酶合成的调节基因发生了变异
诱导酶转变成组成型酶 具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法 • 恒化器法：恒化器常被用于微生物的“驯化”，添加不 能起诱导作用的低浓度底物，缓慢生长 • 循环培养法：利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的 培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶 变异株得到富集。 •诱导抑制剂法：加入诱导抑制剂如α-硝基苯基-β-岩藻 糖苷阻止某些诱导酶的合成
可见光光能（300-500nm）激活光复活酶
打开二聚体，将DNA复原。
PRE为光复活酶
暗修复
细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活
可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。
暗修复体系有四种酶参与反应。
核酸内切酶切开二聚 体的5’末端,形成3’-OH 和5’-P的单链缺口
核酸外切酶从5’-P到 3’-OH方向切除二聚 体，并扩大缺口
• 摇瓶培养法 摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角 瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分 析测定。
•特殊变异菌的筛选方法 营养缺陷型突变株 抗阻遏和抗反馈突变型 抗生素抗性突变株 条件抗性突变
营养缺陷型突变株 筛选步骤： 浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。
• 浓缩营养缺陷型菌株 常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和 引起模板转换，重组因而发生 导入体内后 选择正突变体作新一轮的体外重组
基本步骤
(1)用DNase I消化功能 相同的一组基因片段(A)， 从而产生随机小片段(B)。 (2)经提纯后，用无引物(经变 性后可互为引物)的类似PCR反 应重新装配这些小片段成完整 长度的重组基因片段(C)，在 装记过程中被证明有低水平点 突变产生。 3)克隆并选择正突变体(D)， 并将正突变体的重组基因 片段作新一轮的体外重组。
进行体内基因重组育种的其它方法包括接合、转化、转导等 许多重要的具生产价值的微生物的杂交、有性世代等尚未揭示
妨碍了杂交育种手段的实际应用
4.3.3、基因工程
这是一种自觉的、能象工程一样事先设计和控制的育 种技术，可以完成超远缘杂交，是最新最有前途的育 种方法。
基因工程的应用仍有很大的局限性： • 基因工程产品主要还是一些较短的多肽和小分子蛋白质
• 蛋白质类以外的发酵产物（如糖类、有机酸、核苷酸 及次级代谢产物）产生往往受到多个基因的控制，尤其 是还有许多发酵产物的代谢途径还没有被确证 •基因工程（包括代谢工程）还难以完全取代传统的菌 种选育方法
4、DNA Shuffling技术
基本原理
来源不同但功能相同的一组同源基因 用DN定且具有优势互补的两个亲株 • 为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株 一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养 缺陷型或抗药性等 原生质体制备 • 去除细胞壁是制备原生质体的关键