医学生物化学基本实验
生化实验
实验一基本技术操作及吸光光度法*********************************************实验须知一、实验目的1、通过实验验证生化的基本理论，巩固所学知识。
2、掌握生物化学及分子生物学基本实验方法。
3、培养严谨、认真、实事求是的态度和正确的思维方法。
二、实验要求1、课前预习，课中认真做笔记。
2、按照实验室要求规范操作，如实记录实验结果。
3、认真，按时（当堂）完成实验报告。
三、试剂使用1、核对标签，切勿拿错试剂。
2、刻度吸管或移液器头（Tip头）与试剂必需一一对应，以免引起试剂的交叉污染。
3、用后盖好瓶盖，归还原处。
切勿张冠李戴。
四、仪器使用1、爱护仪器设备，严格遵守操作规则，注意安全。
2、精密仪器，未经允许，不得动用。
3、仪器出现故障，应立即关闭电源，报告老师。
五、实验室规则1、穿工作服进入实验室，遵守课堂纪律。
2、节约水、电、试剂，实验完毕后，清洗所用器材。
3、注意安全，若发生酸碱灼伤，应立即用大量清水冲洗。
4、值日生负责实验室卫生，倒尽垃圾，关好水电、门窗，收齐实验报告。
基本技术操作一：玻璃仪器的洗涤及干燥：（一）意义：去除干扰物，提高实验结果的准确性。
（二）常用洗涤剂：1．洗衣粉，肥皂，洗洁精，去污粉----用于一般去污。
2．强酸，强碱，尿素------去除蛋白质，核酸。
3．铬酸洗液------见附2。
4．水（自来水，蒸馏水）------用来冲洗容器。
（三）洗涤方法：* 洗涤程序：泡→洗（→泡）→冲→漱1．新仪器的洗涤：2%的盐酸浸泡数小时→自来水冲净→洗涤剂溶液中浸泡过夜→试管刷蘸肥皂、洗衣粉或去污粉擦洗容器内外壁→自来水冲10遍→蒸馏水漱洗内壁3遍→包装、消毒→干燥备用。
2．非定量敞口仪器的洗涤（试管、烧杯等）用后立即放入洗涤剂溶液或清水中浸泡过夜→试管刷蘸肥皂、洗衣粉或去污粉擦洗容器内外壁→自来水冲10遍→检查是否洗净→蒸馏水漱洗内壁3遍→包装、消毒→干燥备用。
医学生物化学实验-教案
间苯二酚反应：在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基醛，后者可与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮糖的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应慢。
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振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻向各管内加入水8mL，然后在第2，3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。
还原糖(%) =——————————————————————————×100%
样品毫克数
教学过程中师生活动设计
糖的还原性，具有还原性的糖结构有何特点？
提纲、板书设计
实验原理及反应方程式，实验步骤中表1及计算公式
作业
1、为什么要设置空白对照？
2、标准曲线的定义？
主要
参考资料
[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013
小麦淀粉或玉米淀粉。
3.器材
分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。
实验内容
一、实验原理★：在NaOH和丙三醇存在下，3，5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
生物化学实验指导实验一蛋白质的性质实验（一）（呈色反应）一、目的1
生物化学实验指导实验一蛋白质的性质实验（一）（呈色反应）一、目的1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。
2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、虽色反应：(一)双缩脱反应：1.原理：尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双纳脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
2.试剂：(1)尿索： 10克(2)10%氢氧化钠溶液 250毫升(3)1%硫酸铜溶液 60毫升(4)2％卵清蛋白溶液 80毫升3.操作方法：取少量尿素结晶，放在干燥试管中。
用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。
冷后，加10％氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴，再振荡。
观察出现的粉红颜色。
避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
向另一试管加卵清蛋白溶液约l毫升和10％氢氧化钠溶液约2毫升，摇匀，再加1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。
(二)茚三酮反应1.原理：除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
该反应十分灵敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。
反应机理如下：此反应的适宜pH为5—7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
2.试剂：(1)蛋白质溶液 100毫升2％卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清：水＝1：9)(2)0.5％甘氨酸溶液 80毫升(3)0.1％茚三酮水溶液 50毫升(4)0.1％茚三酮—乙醇溶液 20毫升3.操作方法：(1)取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1％茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
基础生物化学实验
生物化学实验实验基本原理1 有效数字计算结合电子天平的应用等加减法：进行数字加减时,最后结果所保留的小数点后的位数应与参与运算的各数中小数点后位数最少者相同,其尾数“四舍五入”;如：0.124+1.2345+12.34=13.6979,应取13.70;乘除法：进行数字乘除时,最后结果的有效数字应与参与运算的各数中有效数字位数最少者为准,而与小数点的位数无关,其尾数“四舍五入”;如：1.23×0.12=0.1476,应取0.15;2 误差分析误差为实验分析的测定值与真实值之间的差值;误差越小,测定值越准确,即准确度越高;误差可用绝对误差和相对误差表示;绝对误差= 测定值- 真实值相对误差= 绝对误差÷真实值×100%一般用相对误差表示结果的准确度,但因真实值是并不知道的,因此实际工作中无法求出分析的准确度,只得用精确度来评价分析的结果;3 偏差分析结合“可溶性蛋白或赖氨酸实验”要求掌握精确度表示在相同条件下,进行多次实验的测定值相近的程度;一般用偏差来衡量分析结果的精确度;偏差也有绝对偏差和相对偏差两种表示方法;绝对偏差= 单次测定值- 算术平均值不计正负号相对偏差= 绝对偏差÷算术平均值×100%例如：分析某一材料糖含量,共重复测定5次,其结果分别为：16.1%,15.8%,16.3%,16.2%,15.6%,用来表示精确度的偏差可计算如下：分析结果算术平均值个别测定的绝对偏差不计正负16.1% 0.1%15.8% 0.2%16.3% 16.0% 0.3%16.2% 0.2%15.6% 0.4%平均绝对偏差=0.1%+0.2%+0.3%+0.2%+0.4%÷5 = 0.2%平均相对偏差= 0.2÷16.0×100% = 1.25%在实验中,有时只做两次平行测定,这时就应用下式表达结果的精确度：两次分析结果的差值÷平均值×100%4 实验结果的表述：实验结果可用列表法“影响酶作用的因素”常用和作图法综合实验用表示;第1章分光光度技术分光光度技术是光学光谱分析技术的一种,它是利用物质的特征吸收光谱来对不同物质进行定性和定量分析的一项技术;我们将重点介绍紫外光-可见光分光光度法;一、紫外光-可见光分光光度法的基本原理1、讨论的波长范围：200～400nm的紫外光区和400～760nm的可见光区;人肉眼可见的光线称可见光,波长范围在400～760nm；200～400m为紫外光区,760～400000nm为红外光区;2、发射光谱与吸收光谱：发射光谱：不同光源发射光谱不同;对电灯来说,钨灯发射可见光源,氢灯发射紫外光源;吸收光谱：被溶液吸收后的光谱;在分光镜上呈现暗带的光谱;当一束单色光通过溶液时,一部分被溶液吸收,一部分光可反射、折射、吸收、透过,溶液的厚度愈大,光过越少;3、吸收光谱中的透光度T与吸光度A：吸收光谱类仪器的检测读数盘上都有两种数字,T或A或 E 消光度1透光度T ：表示透过的光占入射光的比例%表示当一束光通过一杯样品溶液时,射光 = 反射光 + 折射光 + 吸收光 + 透过光当用空白组成该样品溶液的溶剂校正后,入射光 = 吸收光 + 透过光透光度T=样品透过光强度/空白透过光强度此时空白透过光强度是样品真正入射光强度;2吸光度A：是物质所吸收的光的一种度量,数值上等于透光度的倒数的对数透光度的负对数,即A = -lgT3朗伯-比尔定律：A = K C L, 吸光度与溶液浓度C和液层厚度L成正比;K 为常数,同种物质K 相同,不同物质K 不同如固定L比色皿厚度,A 只与C 成正比;朗伯-比尔定律使用条件：待测液是均匀稳定的稀溶液；入射光是严格的单色光;4、分光光度法比色法,P23：1定义：利用分光光度计产生的单色光照射待测溶液,通过检测吸光度,对溶液中存在的具有光吸收能力的物质进行定性或定量分析的方法;2测定方式：用已知标准浓度和未知浓度的待测液进行比色分析,根据两者间的吸光度做比较求得待测液的浓度;还需设置“空白”,以消除光的反射和折射;3光源：通过钨灯或氢灯产生可见光或紫外光;二、分光光度法的测量方法1、标准曲线法：配制一系列不同浓度C的标准溶液,以纯溶剂为空白,测定标准溶液的A值,以A值为纵坐标,C为横坐标绘制标准曲线;2、回归方程法：得到的标准曲线数据可通过一元线性回归求出标准曲线方程;见P27附;具体应用,先确定x和y,再按公式计算;3、仪器直读浓度法：7200等分光光度计可直接读出浓度;只需配出一个C标,校正仪器至已知浓度,将待测液推入光路,旋钮拨至C档,即可直接读出浓度;4、列解联立方程法:对于多组分和二组分混合液可选择多个或两个波长一般为各组分的最大吸收波长分别测出吸光度A,再按方程组计算;P124,实验29属于此类三、分光光度法的应用见P26参考原则：•有紫外吸收的可选用紫外分光光度计测定,如蛋白质、核酸、生物碱、硝酸盐等•无色的物质可通过显色用可见分光光度计测定,如蛋白质、氨基酸、核酸、酶、糖类等•有色的物质可直接用可见分光光度计测定,如色素;四、紫外-可见分光光度法测定物质浓度的一般操作P271、配制标准溶液,制标准曲线2、样品准备和提取：称样→浸提加热或研磨→稀释至一定浓度→显色紫外不必3、测定：选择适当波长→选择适当比色皿→倒入待测液→调节仪器→读数→记录4、计算：根据公式,带入各数据计算结果;思考题（1）分光光度法的基本原理如何应用在哪些方面（2）结合实验,总结分光光度法测定物质含量的一般操作过程和注意事项;（3）简述分光光度计的组成及使用方法;（4）名词：透光率,吸光度,吸收光谱,标准曲线第2章离心技术1、概念：1离心：是利用离心机产生离心力来分离具有不同沉降系数的物质的方法;2离心技术centrifugal method是利用离心机旋转运动产生的离心力,将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降,而达到分离、浓缩或提纯等目的的一门技术;应用：在生物科学,尤其是在生物化学和分子生物学方面的应用已经十分广泛;2、基本原理：物质颗粒在离心过程中受到的作用力主要有离心力、介质阻力和介质浮力等;1 离心力F：定义：物质颗粒在离心场中受到一个远离旋转轴的力即为离心力;表示：常用地球引力的倍数表示,“数字×g”g为重力常数;例如25000×g,则表示相当于地球引力的25000倍高速离心;实际应用中,特别是低速离心,常用每分钟转数v 表示r·min-1或rpm;2）浮力密度：物质的质量减去在一定介质中所受的浮力即为浮力密度;只有物体的密度大于介质密度的情况下,该物体才会发生沉降;3）沉降阻力：物体在介质中沉降时,所受到的介质阻力;沉降阻力取决于介质的粘度;4）沉降速度：即单位时间内物质颗粒移动的距离;它与物体的密度成正比,与介质的摩擦系数粘度成反比;3、离心机的分类P10可从转速、用途、离心形式、转子形式、使用温度等方面对离心机进行分类; 根据离心机转速不同,可分为三类：低速普通、高速和超速离心机;(1)普通离心机：转速在8000 rpm或6000×g以下,一般性制备用一般实验中用;(2)高速离心机：转速可达25000 rpm或89000×g,需要带有冷却离心腔的制冷设备,以控制转子高速旋转产生的磨擦热;(3)超速离心机：转速在30000 rpm以上,可产生高达500,000×g的离心力；可使亚细胞器、病毒分级分离,也可用于测定蛋白质、核酸的相对分子量等;由于转速极高,因此它除带有制冷设备外,还具备真空系统;4、常用离心技术1 差速离心法：基于待测物质颗粒的大小、密度不相同,其沉降速度不一样而得到分离;2速率区带离心沉降速度超速离心：样品中粒子大分子因大小和沉降速度不同,在梯度介质中呈分离的区带状沉降,管中形成区带;同样的粒子处于同一区带图1-1-4首先在离心管中灌装好预制的一种密度梯度介质液,在其上面小心铺上一层样品溶液图1-1-4 ,离心期间,样品中各组分会按照各自的沉降速率沉降,被分离成一系列的样品组分区带,故称率区带离心;3等密度梯度离心沉降平衡超速离心：样品中粒子大分子因浮力密度不同,粒子移至它本身相同密度的地方形成区带管中形成区带图1-1-5;如果离心管中介质中的密度范围包括待分离样品中所有组分的密度,离心过程中,各组分将逐渐移至与它本身密度相同的地方形成区带;速率区带法和等密度梯度法的区别：开始介质有无梯度前者有,后者无但在离心中自动生成；●介质不同前者可用蔗糖、甘油等,后者常用碱金属的盐溶液;5、离心技术的应用1）物质的分离：将固体与液体分离,或将互不相溶的液体分开;2）测定沉降系数和分子量：超速离心6、离心操作的一般过程1仪器选择：根据需要选择2离心准备：样品装入离心管,做好标记并进行平衡;再按对称方向放到离心机中;3离心：关闭离心腔盖,调整旋钮或按钮至设定时间及转速低速离心机逐渐增速开始离心;4检测、分离已离心样品：取出离心管,用长吸管、移液器、注射针头等工具吸取所需的液体分离层,或直接倾去液体层,留下所需的固体层;思考题（1）何为离心技术它有什么用处（2）简述离心机的分类;（3）结合实验,说明普通离心操作应注意哪些问题;（4）名词：离心力,沉降系数,沉降速度,差速离心,等密度梯度离心第3章层析技术定义：层析技术层析法是根据物质的理化性质而建立的分离、分析物质的方法;P15⏹发现历史：层析法也称色谱法,是1906年俄国植物学家将植物叶片提取的色素通过装填有CaCO3的柱子,各种色素以不同速率流动后形成不同的色带而被分开,由此得名为“色谱法”;⏹层析法不断发展,相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等;层析法是生物化学中常用的分离分析技术之一;一、 层析法的基本原理层析法是利用混合物中各组分物理、化学性质的差异如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等,使各组分在两相固定相和流动相中发生相互作用吸附、溶解、结合等使各组分以不同速度移动而达到分离的目的;1、 分配系数K ：通常被用来描述一种化合物在互不相溶的两个相中的分配状况;溶质在移动相中的浓度溶质在固定相中的浓度=K2、 分离原理P15见图1-2-13、 层析法分类1按层析过程的机理依据的理化性质分类2按两相的物态固、液、气分类3按操作形式支持物、装置等分类见P17,表1-2-1 层析法分类表4、几种层析方法简介1 分配层析1原理：利用混合物在两种不相混溶的液相固定相和流动相中的分配系数不同,分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多,移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多,移动慢;2应用：纸层析,以滤纸上吸附的水为固定相,以有机溶剂为流动相,常用于分离鉴定氨基酸、核苷酸、色素等小分子有机物;物质在纸上的移动速率可以用R f 值表示：距离溶剂前沿至起点中心的心距离物质斑点中心至起点中=f R 在相同条件下,Rf 值是固定的,可用于鉴定被分离的物质;2吸附层析1原理：利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及流动相对它的溶解作用解吸作用的差异进行分离;2应用：薄板层析是常用的吸附层析方法之一;它用水作粘合剂将硅胶G均匀铺在玻璃板上形成一薄层作为固定相,由展开剂作为流动相,可用于分离氨基酸、单糖、寡糖、脂类等;3离子交换层析1原理：固定相的离子交换剂对各种离子有不同的亲和力,它们结合的牢固程度不同,选用不同pH的洗脱液做流动相便可将混合物中的各种离子逐个洗脱下来;2应用：离子交换柱层析常填充不溶性高分子化合物树脂,纤维素等,以分离各种可解离的物质,如蛋白质、氨基酸、核酸、生物碱等;4凝胶层析分子筛层析或分子排阻层析1原理：根据混合物中各分子的大小和形状不同而进行分离;固定相为多孔网络结构的凝胶颗粒;当各种分子流过层析柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入胶孔,在凝胶颗粒间的空隙向下移动,最先被洗脱出来；比网孔小的分子能自由出入胶孔内外,在柱内经过的路程较长,移动慢,最后被洗脱出来;2应用：大分子分离提纯,测蛋白质分子量;5、层析技术的一般操作过程：以柱层析薄层层析为例,对层析的操作过程简介如下：1层析柱板的制作：⏹装柱：将层析介质如树脂、葡聚糖颗粒等均匀、致密地填充于层析柱中,并用洗脱液或样品缓冲液平衡一定时间见下图⏹制板：层析介质如硅胶G用溶剂调匀后平铺于玻板上,待晾干后进行活化; 2加样或点样：⏹加样：用于柱层析,待分离样品溶解后加于层析柱顶上；点样：用于薄层层析或纸层析,用毛细管等细小管状物将待分离样品点于薄层的一端;3洗脱或展层：⏹用流动相流过固定相的过程在柱层析中称为洗脱,在薄层层析中称为展层4检测与鉴定：根据样品性质特征用不同方法思考题（1）简述层析法的基本原理及分类（2）凝胶层析的原理如何（3）简述层析技术的一般操作过程,层析技术可应用在哪些方面（4）名词：展层,洗脱,制板,分配系数第4章电泳技术⏹定义：电泳技术是根据带电颗粒在电场中向着与其所带电荷相反电极移动的原理建立的分离分析物质的方法;P30⏹历史：1808年就发现电泳现象,但作为一种生物化学研究方法,在1937年后才得到了较大发展;⏹目前,电泳技术已成为生物化学、免疫学、分子生物学以及与其密切相关的医学、农、林、牧、渔、制药分析中必不可少的手段;一、电泳的基本原理1、带电质点：不同物质由于本身解离或其表面吸附有其它带电质点,在电场中便会向一定电极移动;aa、Pr和核酸都可两性解离,带有电荷;2、迁移率m：表示不同带电颗粒在电场中的泳动速度,其单位为cm2·V-1·s-1：m = 颗粒泳动速度cm·s-1 / 电场强度cm·V-13、影响迁移率的主要因素:1内因：带电颗粒的性质和颗粒的大小、形状;一般说颗粒带净电荷越多,直径越小,越接近球形,在电场中迁移率越快,反之越慢;2外因：电场强度、溶液pH值、溶液的离子强度、电渗现象、温度的影响;二、电泳的分类1、按分离原理分类：P32⏹分为区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳等4种;区带电泳最常用,电泳过程中,不同的离子成分在均一的缓冲液体系中分离成独立的区带;2、按有无固体支持物分类：⏹分为自由电泳和支持物电泳两大类;支持物电泳的支持物有多种,应用最多;根据支持物的特点又可分为：1无阻滞支持物,如滤纸、醋酸纤维膜、纤维素粉、淀粉、聚酰胺粉末,凝胶颗粒等; 2有阻滞支持物,通常为高密度的凝胶,如淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等;用于放置支持物的电泳槽的形式也是多种多样的,有垂直的、水平的、柱状的花篮式、毛细管的、湿小室及幕状的等;聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE是以聚丙烯酰胺凝胶作支持物的区带电泳;PAGE分离物质的三种效应：1电荷效应：按所带电荷分离物质;2分子筛效应：凝胶聚合成三维网状结构,通过控制网孔大小分离不同大小的分子; 3浓缩效应：当使用不连续凝胶系统时,分离物质快速通过浓缩胶大网孔、而聚集于分离胶小网孔上呈一薄层,使分离物质处于同一起跑线;⏹因为以上三种效应,使分离物质的分辨率提高;2、聚丙烯酰胺凝胶的聚合：⏹聚丙烯酸胺凝胶是由单体、丙烯酰胺简称Acr和交联剂、双体的N,N-甲叉双丙烯酰胺简称Bis在加速剂四甲基乙二胺和催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶;见图l-4-2三、聚丙烯酰胺凝胶电泳•凝胶孔径大小,主要受凝胶浓度的影响;凝胶浓度越大,孔径越小;凝胶浓度过大,胶硬而脆,易折断;3、PAGE的应用1分离蛋白质和同工酶：P38⏹形成不同的蛋白带和酶带参见实验10及下图2测定蛋白质分子量：⏹采用SDS-PAGE;在样品中加十二烷基硫酸钠SDS降低天然蛋白质分子间的电荷差别,蛋白质结构变得松散,形状趋于一致,使各种SDS-蛋白复合物在电泳时产生迁移率差异只与分子量有关;3测蛋白质等电点：⏹采用等电聚焦电泳法IEF-PAGE;在凝胶柱中加入两性电解质载体,造成一定的pH梯度,使具有不同pI值的蛋白质聚焦在相应的pH中,这时所带净电荷为零,不再泳动,而浓缩成狭窄的区带参见P36及P55;4、凝胶电泳的一般操作方法：1 根据所分离物质的特性及要求选择相应的凝胶、电泳仪及电泳槽园盘、垂直板、多用途2 配制相应凝胶溶液烧杯中,参见P653灌胶：花篮式电泳装置,在玻管中倒入凝胶溶液,直接加水覆盖胶液4 胶凝固后倾出水,将玻管固定于电泳槽,倒入电极缓冲液并检查是否漏液5 点样：将样品加至凝胶上的上样孔中6 电泳：接上电泳仪开始电泳7 剥胶、显色8 分析：条带比较或照相或光密度扫描思考题⏹什么叫电泳简述电泳的基本原理;⏹什么叫迁移率电场强度、pH、温度对迁移率有何影响⏹凝胶电泳技术可应用在哪些方面⏹名词：等电聚焦,区带电泳,分子筛效应,浓缩效应;实验1 影响酶作用的因素1、酶具有什么特性1高效性：酶的催化效率一般比无机催化剂高1000万至10万亿倍,因此在生物体内的各种酶只需要极少的量就能催化大量底物发生反应;2专一性：指酶对催化的底物及反应类型具有选择性,所以酶的种类很多;3易变性：酶是蛋白质,要求温和的反应条件；在一定范围内,温度、PH值等变化都会使酶的催化能力发生变化;4可调性：植物通过调节酶的活性进行不同的反应和适应不同的环境;2、什么是酶的活性酶催化效率的高低;3、酶的活性需要什么条件需要适应环境的条件——其中适宜的温度和PH值就是其中之一;根据酶的特性及需要的条件,下面分别给出不同的温度环境、不同的PH环境和催化底物,来探讨酶的活性需要的条件;原理：淀粉酶活性高低不同,淀粉水解的程度就不同,生成的产物也不同；其水解产物遇碘也会呈现不同的颜色;故可根据加碘呈现的不同颜色来判断淀粉的水解程度,从而了解温度、pH对酶促反应速度的影响;淀粉在酶的作用下,逐步降解成的分子量大小不一的中间产物糊精,最后再水解成葡萄糖和麦芽糖；不同的糊精遇碘显不同的颜色;淀粉+淀粉酶水解淀粉糊精水解紫糊精水解红糊精水解消色糊精水解葡萄糖+麦芽糖遇I2 遇I2 遇I2 遇I2 遇I2 遇I2蓝色蓝紫色紫色红褐色无色无色（1）温度对酶活性的影响：由于酶是蛋白质,所以受温度影响,在高温下,酶变性而失去活性；低温下,酶的活性被抑制；适宜温度,酶的活性最强;这种变性用什么来验证呢用不同温度冰水、40℃水浴和沸水浴作用淀粉酶,使淀粉部分、完全和不分解后与碘I2出现的不同颜色来观察;其中,冰水属低温,酶的活性被抑制,淀粉只能少部分分解,所以遇I2变为紫红色；40℃水浴,酶的活性最强,淀粉完全分解,遇I2变为无色或碘色；沸水浴,酶变性而失去活性,遇I2变为兰色（2）p H 对酶活性的影响：酶的活性受环境pH的影响极为显著,通常只在一定的pH范围内,酶才表现出活性;植物酶的最适pH在4.5-6.5之间,而对今天萌发的小麦种子来说,主要起催化作用的酶为淀粉酶,最适pH是5;今天淀粉酶在不同PH3、5、7下,使淀粉部分和完全分解后与碘I2出现的不同颜色来观察;其中,PH为3属强酸性环境,大部分酶已变性失活,淀粉只有一小部分水解,遇I2变为蓝紫色； PH为5属酶的最适PH,酶的活性最强,淀粉完全分解,遇I2变为无色或碘色；PH为7属中性环境,酶的活性被部分抑制,淀粉只有少部分不分解,遇I2变为红紫色色（3）酶的催化特异性专一性：酶对作用的基质具有严格的选择性,即酶具有专一性;如淀粉酶只能催化淀粉水解,而不能催化蔗糖水解,所以今天我们用淀粉和蔗糖做底物来验证;即：淀粉+淀粉酶完全水解葡萄糖+麦芽糖Cu2+生成Cu2O砖红色沉淀；蔗糖+淀粉酶不水解没有Cu2O砖红色沉淀生成Ⅰ温度对酶活性的影响甲组：颜色变化为：紫红色、无色或碘色、蓝色乙组：颜色变化为：无色或碘色、无色或碘色、蓝色Ⅱ pH 对酶活性的影响颜色变化为：紫红色、无色或碘色、蓝紫色Ⅲ酶的催化特异性鉴定：颜色变化：蓝色、蓝色、蓝绿色,说明淀粉酶液中含有还原性杂质测定：淀粉 +淀粉酶完全水解葡萄糖 +麦芽糖Cu2+生成Cu2O砖红色沉淀；蔗糖 +淀粉酶不水解没有CuO砖红色沉淀生成2思考题（1） 实验中为什么要检验淀粉酶溶液,淀粉溶液或糖溶液（2） 温度对酶活性有影响,说明酶具有什么性质 实验中如何观察为说明酶具有易变性;由于酶是蛋白质,所以易受温度影响,在高温下,酶变性而失去活性；低温下,酶的活性被抑制；适宜温度,酶的活性最强;实验中通过在冰水、40℃水浴和沸水浴中淀粉底物的消失情况进行观察,即冰水中,酶的活性被抑制,淀粉部分分解,遇碘I 2显紫红色；沸水浴中,酶变性而失活,淀粉不分解,遇I 2变兰色；40℃水浴,酶的活性最大,淀粉完全分解,遇碘不显色;（3） P H 对淀粉酶活性有影响,其最适PH 是多少 实验中如何判断淀粉酶的最适PH 值是5;实验中通过PH 为3、5、7检验淀粉酶的最适pH 为5,即pH 值为3时,酶的活性丧失,淀粉不分解,遇碘I 2显蓝色；pH 值为5时,酶的活性最大,淀粉完全分解,遇碘不显色；PH 值为7时,酶的活性被部分抑制,部分淀粉已分解,遇碘显紫红色;实验2 谷物蛋白含量的快速测定——双缩脲法P46 在研究植物营养、代谢作用及生长发育等生命活动中,往往需要测定样品中蛋白质的含量;那么怎样测定呢 用碱性铜溶液;因为肽键在这种溶液中会产生紫色化合物,其颜色的深浅与肽键的数量成正比,也就是跟蛋白质含量成正比;颜色的深浅我们用一种仪器来测定,即用分光光度法测定,以此得出蛋白质的含量;碱性铜溶液又称为双缩脲试剂、肽键试剂,所以我们的实验方法就叫双缩脲法;原理：在浓碱液中,蛋白质中的肽键与双缩脲相似的肽键,能与Cu 2+结合,生成紫色和紫红色化合物,颜色的深浅与蛋白质含量成正比,故可用分光光度法测定其含量;思考题‖O。
基础生化实验-蛋白质纯化
蛋白质纯化一、目的:利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。
二、原理:由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag，再以金属亲和性管柱(Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。
三、试剂与器材:1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HClPh7)✧细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)上课补充:✧蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffer里。
四、仪器与设备:FPLC(速液相色谱仪)五、步骤:1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。
2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。
3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。
4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗，并收集流出液体，以FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之曲线图。
上课补充:✧胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰中使用。
✧线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲洗掉，剩下胶体溶液。
✧其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争，可拿来洗涤蛋白质。
(整理)检验医学专业实验IV临床生物化学检验部分
自动生化分析仪实际K值测定实际K值：理论K值受样品和试剂的加量准确度、比色杯光径准确度，尤其是ε的影响。
ε在波长和温度等不同时有所不同，故有必要获得用户所用分析仪的实际ε，再计算K值，此为~。
一、340nm波长实际K值测定【实验原理】：通过有NAD+（NADP+）参与的反应途径，用NADH或NADPH标准液来校正仪器。
用己糖激酶（HK）方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。
葡萄糖有标准纯品，当反应达到终点时，NADH的摩尔数等于标准的葡萄糖摩尔数。
在需要校正的仪器上测其A即可求得实际摩尔吸光系数，计算出实际K值。
【注意事项】1．减少偶然误差重复测定10次，当CV>5％时，则重新测定10次。
2．减少系统误差使用实际K值计算酶活性。
3．如果实际ε值与理论ε值偏差过大，需对仪器检修和校正。
二、405nm波长实际K值测定【实验原理】：许多酶活性测定时，以人工“色素原”为底物，经酶作用后可释放出在405nm 波长具有吸收峰有色的反应产物，如对硝基苯酚(4-NP)、对硝基苯胺(4-NA)、对硝基-5-氨基苯甲酸(ANBA)。
他们在405nm波长时的理论ε分别为18 700、9 870、9 490。
可使用其相应的纯标准品在需要校正的仪器上测其A即可求得实际ε，计算出实际K值。
以ALP实验(产物为4-NP) 为例测定实际K值。
【注意事项】1．4-NP标准品纯度要求较高，必要时需纯化。
2．其他注意事项参见340nm K值校正。
三、如何校正K值在理论K值或实际K值得情况下，测定某标准品的含量，若测得的结果偏低，则需要把测得的结果调整至原标准品的含量，此时调整的数值称为校正因子，则校正K值=理论（实际）K值×校正因子=理论（实际）K值×校准值÷实测值NADH正负向反应测定酶活性一、血清乳酸脱氢酶测定LD催化反应式为：L-乳酸+ NAD+（LD）→丙酮酸+ NADH + H+在反应过程中，乳酸被氧化生成丙酮酸，同时NAD+还原为NADH。
医学生物化学实验_教(学)案
《医学生物化学实验》教案第1 次课2学时《医学生物化学实验》教案第2次课2学时《医学生物化学实验》教案第3次课2学时12、0.1mol/L盐酸溶液300mL13、0.1mol/L氢氧化钠溶液300mL14、0.05mol/L碳酸钠溶液300mL15、甲基红溶液20mL（三）器具水浴锅、温度计、200mL锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管及试管架实验容1.实验原理★：蛋白质是两性电解质。
在蛋白质溶液中存在下列平衡：最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
（1）可逆的沉淀反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。
提纯蛋白质时，常利用此类反应。
（2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。
加热引起的蛋白质沉淀与凝固。
蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。
因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
二、实验步骤：《医学生物化学实验》教案第4 次课2学时《医学生物化学实验》教案第5次课2学时《医学生物化学实验》教案第6次课2学时《医学生物化学实验》教案第7次课2学时《医学生物化学实验》教案第8 次课2学时《医学生物化学实验》教案第9次课2学时《医学生物化学实验》教案第10次课2学时《医学生物化学实验》教案第11次课2学时《医学生物化学实验》教案第12次课2学时《医学生物化学实验》教案第13次课2学时《医学生物化学实验》教案第14 次课2学时《医学生物化学实验》教案第15 次课2学时《医学生物化学实验》教案第16 次课2学时。
生物化学实验指南
实验一糖的呈色反应和定性鉴定目的要求(1) 学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。
(2) 了解鉴定还原糖的方法及其原理。
Ⅰ. Molish反应——α-萘酚反应实验原理糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与α-萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。
自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。
此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。
因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。
试剂Molish试剂：取5g α-萘酚用95%乙醇溶解至100mL，临用前配制，棕色瓶保存。
1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。
操作方法取试管，编号，分别加入各待测糖溶液1 mL，然后加两滴Molish试剂，摇匀。
倾斜试管，沿管壁小心加入约1mL浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。
用水代替糖溶液，重复一遍，观察结果。
Ⅱ. 蒽酮反应实验原理糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10-酮-9，10-二氢蒽）作用生成蓝绿色复合物。
试剂蒽酮试剂：取0.2g 蒽酮溶于100mL 浓硫酸中，当日配制。
待测糖溶液，同Molish试验。
操作方法取试管，编号，均加入1mL蒽酮溶液，再向各管滴加2 ~ 3滴待测糖溶液，充分混匀，观察各管颜色变化并记录。
Ⅲ. 酮糖的Seliwanoff反应实验原理该反应是鉴定酮糖的特殊反应。
酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛。
后者与间苯二酚作用生成鲜红色复合物，反应仅需20-30秒。
醛糖在浓度较高时或长时间煮沸，才产生微弱的阳性反应。
试剂Sediwanoff试剂：0.5g 间苯二酚溶于1升盐酸（H2O∶HCl=2∶1）(V/V)中，临用前配制。
1%葡萄糖；1%蔗糖；1%果糖。
操作方法取试管，编号，各加入Sediwanoff试剂1mL，再依次分别加入待测糖溶液各4滴，混匀，同时放入沸水浴中，比较各管颜色的变化过程。
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医学生物化学基本实验第一节蛋白定量分析实验蛋白质是一切活细胞和有机体的最重要组成成分，它是构成人体及所有动物机体组织的主要部分。
蛋白质是由二十种氨基酸以肽键相互连接而成的复杂的高分子化合物。
蛋白质含量可通过它们的物理化学性质，如折射率﹑比重﹑紫外吸收﹑染色等测定而得知，或用化学方法，如微量凯氏定氮﹑folin-酚试剂、双缩脲反应等方法来测定，表2-1为五种蛋白质的测定方法的比较。
表五种蛋白质测定方法比较方法灵敏度原理干扰物质凯氏定氮法(Kjedahl法) 0.2～1.0mg将蛋白质转化为氮，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）双缩脲法(Biuret法) 1～20mg多肽键加碱性铜离子生成紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸Folin-酚试剂法(Lowry法) 5µg磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇考马斯亮蓝法(Bradford法) 1～5µg考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其λmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100；SDS紫外吸收法50～100µg 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌呤和嘧啶；各种核苷酸实验一双缩脲法测定蛋白质含量【实验目的】掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。
【实验原理】蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色的化合物（称双缩脲反应）。
在一定浓度范围，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的含量。
含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。
【实验内容与方法】1. 标准曲线的制作(1) 取小试管7支，编号，按表2-2操作表2-2 双缩脲法操作步骤试剂（ml）管号1 2 3 4 5 6 7标准蛋白质溶液生理盐水双缩脲试剂0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 —样品0.1 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 1.0 0.94.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0(2) 混匀后，于37℃水浴中保温15min，在540nm波长下比色，以第6管调零点，测得各管的吸光度值。
以各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质的克数为横坐标，绘成曲线。
2. 样品测定取血清（或其它蛋白质溶液）0.1ml，加生理盐水0.9ml，再加二缩脲试剂4ml，于37℃水浴中放置15min，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线即得出每l00ml血清（样品）中蛋白质的克数。
【实验准备】1. 双缩脲试剂称取CuSO4·5H202.5g，加水100ml，加热助溶，另取酒石酸钾钠10g，碘化钾5g，溶于500ml水中，再加5mol/L NaOH 300ml混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加水至1000ml，此液可长期保存。
2. 生理盐水，标准蛋白质溶液2mg/ml3. 仪器及玻璃器皿721型分光光度计，水浴箱，中试管6支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，坐标纸实验二考马斯亮兰法测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握考马斯亮兰结合法对蛋白质定量测定的方法及原理。
2. 熟悉紫外分光光度计的使用。
【实验原理】考马斯亮兰G-250存在着两种不同的颜色，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大吸收峰从465nm变成595nm，通过测定595nm处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
应用考马斯亮兰法的优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry 法约高4倍，其最低蛋白质检测量可达1µg。
（2）测定速度快、简便，只需一种试剂。
（3）干扰物质少。
【实验内容与方法】1. 取试管3支、编号，按表2-4操作表2-4 考马斯亮兰法测定蛋白质试 剂（ml ） 空白管 标准管 样品管生理盐水 0.1标准蛋白溶液 0.1样 品 0.1考马斯亮蓝试剂 5.0 5.0 5.02. 混匀，室温放置5min ，在波长595nm 处，以空白管调零点。
测定各管的吸光度值。
3. 计算mL g OD OD /50μ样品中蛋白质的含量标准样品=⨯ 【实验准备】1. 考马斯亮蓝试剂 称取考马斯亮蓝G-250 100mg ，加95%乙醇溶液50ml ，使之溶解，再加入85%磷酸溶液100ml ，加水至1000ml 。
混匀，避光放置过夜，用二层滤纸过滤，滤液用棕色瓶保存，至少可保存两周。
2. 标准蛋白溶液50µg/ml 。
3. 仪器及玻璃器皿 721分光光度计，试管l0支，刻度吸管10ml 、l5ml 、lml 、0.1ml 各1支，普通玻璃比色杯4只。
实验三 紫外分光光度法测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。
2. 熟悉紫外分光光度计的使用。
【实验原理】 蛋白质分子中含有的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm 波长处。
由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内。
吸收峰的吸光度值与其浓度成正比，可作定量测定。
由于各种蛋白质中芳香族氨基酸含量的不同，因而此法适于测定与所采用的标准蛋白质的氨基酸组成相似的蛋白质，以减少误差。
一般核酸在280nm波长处也有吸收，对蛋白质测定有干扰作用，但核酸的吸收高峰在260nm，因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定A260 和A280，通过计算消除核酸对蛋白质的影响而算出蛋白质的含量。
【实验内容与方法】1. 280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
（1）标准蛋白质溶液任选一种蛋白质溶液，经凯氏定氮法测定蛋白质的含量，用生理盐水稀释至浓度为1mg／ml。
（2）取试管6支，编号，按表2-5进行操作表2-5 紫外吸收法标准曲线管号试剂（ml）1 2 3 4 5 6标准蛋白质溶液0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0生理盐水 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0 混匀后，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第6管调零点，在280nm 波长下测定各管吸光度，以各管的光密度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线图。
（3）样品测定用生理盐水将待测样品的蛋白质浓度稀释成大约1mg／ml，取标本1.0ml，加生理盐水3.0ml，混匀，按上述方法测其A280，根据标准曲线得出蛋白质的浓度。
2. 260nm和280nm的吸收差法核酸对此处光有很强的吸收，在280nm 处的光吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。
核酸在260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm吸收值。
通常：纯蛋白质的光吸收比值：A280nm/A260nm≈1.8纯核酸的光吸收比值：A280nm/A260nm≈0.5含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280nm和A260nm，由此吸收差值，用下面的公式，即可计算出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度（mg／ml）=1.45A280 - 0.74A260（mg/ml）3. 215nm与225nm的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。
用已知浓度的标准蛋白质溶液，配制成20～100µg/ml 的一系列蛋白质溶液，取一定量分别测定215nm与225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差Δ=A215nm-A225nm以吸收差Δ为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。
再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。
4. 肽键测定法蛋白质溶液在238nm的光吸收处的强弱，与肽键的多少成正比。
用已知浓度的标准蛋白质溶液，配制成50～500µg/ml的一系列蛋白质溶液，取一定量测定238nm的吸光度值A238nm，以A238nm为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制出标准曲线。
未知样品的浓度即可由标准曲线求得。
本方法比280nm吸收法灵敏，但多种有机物，如醇、酮、醛、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用，所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。
若含有有机溶剂，可将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。
【实验准备】紫外分光光度计，坐标纸。
附录：常用实验技术原理——分光光度技术分光光度技术（spectrophotography）是利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术，该技术灵敏度强，精确度高，操作简便、快速；对于复杂的组分系统，勿需分离即可检测出其中的微量组分，因此分光光度技术已成为生物学研究领域中广泛使用的方法之一。
【基本原理】物质对光波有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，有色溶液之所以呈现出不同的颜色，是由于物质对光的选择性吸收所致，有些物质能选择性吸收特定波长的紫外光或红外光，因此，每种物质都具有其特征性的吸收光谱。
分光光度法所使用的光谱范围在200nm-10μ（1μ= 1， 000nm ）之间。
其中200nm －400nm 为紫外光区，400nm －760nm 为可见光区，760nm －10，000nm 为红外光区。
在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质浓度成正比，因此可利用各种物质不同的吸收光谱及其吸收强度，对不同物质进行定性和定量分析。
分光光度技术依据的原理是Lambert-Beer 定律，该定律阐明了溶液对单色光吸收的多少与溶液浓度和溶液厚度之间的关系。
当光线通过透明介质时， 溶液吸收了一部分光能，因此当光透射出溶液之后，光强度减弱。
溶液浓度越大，或溶液的厚度越大（即光在溶液中所经过的路径愈长），则对光的吸收越强，光的强度减弱也愈显著。
1. 朗伯（Lambert ）定律：当一束单色光通过一光吸收介质时，光强度随吸收光介质的厚度增加而呈指数减少，即l K oe I I 1-= （ I 0：入射光强度，Ｉ：透射光强度，l ：介质的厚度）式中K 为吸光系数：表示吸光物质在单位浓度和单位厚度时的吸光度，是物质的一个特征常数，由物质的性质与光的波长决定。
对于同一物质和一定波长的入射光而言是一个常数。
当溶液浓度单位为mol/L ，光程厚度为lcm 时的吸光系数称为摩尔吸光系数，又称摩尔吸光度，用ε表示，其单位是(L·mol -1·cm -①，一般采用ε值最大的波长进行比色测定。