枯草杆菌摇瓶发酵生产α-淀粉酶实验方案
α-淀粉酶的生产工艺
食品111 陈雅媚 14号
目的：
学习并掌握α－淀粉酶的制备工艺。
α－淀粉酶的背景知识
α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中， 能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄 糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之 一。目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及 淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发 酵以及纺织等许多行业。本次设计的淀粉酶发 酵，分别以玉米粉为碳源，以豆饼为氮源，以 BF-7658枯草芽孢杆菌为生产菌种,同时做出 了生产工艺流程图，详细的介绍了α-淀粉酶的 生产工艺。
3 4 5 6 7
可溶性淀粉溶液 温度条件和 保持时间 斐林试剂 温度条件和 保持时间
2ml
煮沸 1mil
有砖红色沉淀
2ml
煮沸 1mil
无砖红色沉淀
2ml
煮沸 1mil
无砖红色沉淀
实验现象
The end
谢谢 本次课程到此结束
取三支洁净试管，编上号，并分别按下表中序号1至5要求操作。
序 号 1
项
目
试
管
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
可溶性淀粉溶液
1 2ml
60º C热水
2 2ml
沸水
3 2ml
冰块
2
3 4 5
温度条件 (保持5min)
新鲜淀粉酶溶液 （保持5min） 碘液（滴）
1ml 1
不变蓝
1ml 1
变蓝
1ml 1
变蓝
实验现象
二、PH对酶活性的影响
4. 不易以搅拌方式进行质量传递，因此发酵期间， 物质的添加无法达到均匀。 5. 由于不易侦测，从发酵工程的观点来看，许多 工作都只是在定性或观察性质，故不易设计反应 器，难以量化生产或设计合理化的发酵流程。
枯草杆菌生产_淀粉酶的研究
１０科技创新导报 Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ２０１０ ＮＯ．２９Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ研 究 报 告α－淀粉酶是在淀粉加工、食品工业、医药工业、发酵工业及酿造、制糖和纺织工业上应用广泛的酶种，也是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一。
α－淀粉酶一般可由微生物发酵产生，也可由植物和动物提取。
目前，工业生产上都以微生物发酵法为主进行大规模生产α－淀粉酶。
我国从１９６５年开始应用枯草芽孢杆菌（Ｂｃａｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＦ－７６５８生产α－淀粉酶，当时仅无锡酶制厂独家生产，年产量为１０．２２吨。
现在国内生产酶制剂的厂家己发展到上千个，其中约有４０％～５０％的工厂生产α－淀粉酶。
总产量上万吨。
近年来，国外生产耐热α－淀粉酶发展较快，己从嗜热真菌、高温放线菌、特别是从嗜热细菌（嗜热脂肪芽孢杆菌Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｔ和地衣芽孢杆菌Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｕｓ等）中分离得到了耐高温的α－淀粉酶菌种。
但就国内而言，虽己开展了耐高温α－淀粉酶的研究工作，目前仍以枯草杆菌菌株生产α－淀粉酶为主。
本文就枯草杆菌在淀粉培养基上产α－淀粉酶做一下研究，其对在以玉米（淀粉含量为７０％～７５％）或大米（淀粉含量为８０％～８５％）主要原料的发酵酿酒过程，具有实际的指导意义。
１ 材料和方法１．１实验材料１．１．１菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）为实验室保藏菌种。
１．１．２种子培养基 马铃薯固体（及液体）培养基（简称ＰＤＡ，马铃薯２００ｇ、蔗糖２０ｇ、琼脂１５ｇ、水１０００ｍｌ、ＰＨ自然，马铃薯去皮，切成块煮沸３０ｍｉｎ，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至１０００ｍｌ。
１２１℃灭菌３０ｍｉｎ）１．１．３发酵培养基 淀粉液体培养基（可溶性淀粉、蒸馏水、ｐＨ自然。
从枯草杆菌发酵液中提取a淀粉酶的流程
从枯草杆菌发酵液中提取a淀粉酶的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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枯草杆菌生产α-淀粉酶的研究 -回复
枯草杆菌生产α-淀粉酶的研究-回复枯草杆菌生产α淀粉酶的研究引言：淀粉是一种由葡萄糖分子组成的多聚体，是植物细胞中最重要的储能物质。
为了有效地利用淀粉，许多微生物产生了淀粉酶。
淀粉酶能够水解淀粉成为可被微生物利用的单糖，其中α淀粉酶是将淀粉水解成麦芽糖或是葡萄糖的主要酶类之一。
而枯草杆菌是一种广泛存在于土壤中的细菌，在许多领域都具有潜在应用价值。
本文将探讨枯草杆菌生产α淀粉酶的研究目的、方法、结果和展望。
目的：本研究的目的是通过培养枯草杆菌，使其表达α淀粉酶，以探索其在产业应用上的潜力。
方法：1. 枯草杆菌菌种的筛选：从不同的土壤样本中筛选出具有较高淀粉酶产量的枯草杆菌菌株；2. 培养基的优化：对枯草杆菌菌株进行不同培养基的筛选和优化，以提高淀粉酶产量；3. 发酵条件的优化：调节发酵条件，包括温度、初始pH、培养时间和淀粉浓度，进一步提高淀粉酶活性；4. α淀粉酶的提取和纯化：通过离心、过滤、浓缩和柱层析等技术，将淀粉酶从菌体中分离提取，并进行纯化。
结果：通过以上的实验步骤和优化条件，我们成功获得了一株高产α淀粉酶的枯草杆菌菌株，并获得了较高的淀粉酶产量。
实验结果表明，枯草杆菌在适宜的发酵条件下能够表达和产生大量的α淀粉酶。
展望：虽然本研究已经取得了一定的成果，但仍然存在一些挑战和改进的空间。
首先，我们可以进一步优化发酵条件，以提高淀粉酶产量。
其次，可以通过基因工程手段改良枯草杆菌的基因组，提高其淀粉酶产量和活性。
此外，可以进一步研究α淀粉酶的性质和机制，以在其应用领域发挥更大的作用。
结论：本研究通过对枯草杆菌的研究，成功实现了α淀粉酶的生产。
这为淀粉酶的产业化应用提供了新的途径和可能性。
枯草杆菌生产α淀粉酶具有较高的生物安全性和可行性，且可以通过合理优化发酵条件和基因工程手段，进一步提高产量和活性。
通过深入研究淀粉酶的性质和机制，有望在食品加工、饲料行业和生物能源领域等方面发挥重要作用。
总结：枯草杆菌是一种潜在的产α淀粉酶的微生物菌株。
枯草杆菌摇瓶发酵生产α-淀粉酶
试剂及溶液
试剂：
碘、碘化钾、 α-淀粉酶制剂、磷酸氢二钠、柠檬 酸、盐酸、可溶性淀粉（湖州展望化学药业有限公 司）。
溶液配制： 原碘液：称取11.0 g碘和22.0 g碘化钾，用少量水 使碘完全溶解，定容至500 mL，贮存于棕色瓶中。 稀碘液：吸取原碘液2.00 mL，加20.0 g碘化钾用 水溶解并定容至500 mL，贮存于棕色瓶中。
酶的比活力
酶的比活力是酶纯度的一个指标，是指在特定条 件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的 酶活力单位数。 酶活力：样品中酶总共有多少个酶单位。 比活力：每mg蛋白质中有多少个酶单位。 酶比活力＝酶活力（单位）/ mg （蛋白或RNA） 可用以比较每单位质量酶蛋白的催化能力。 对同一种酶，比活力可以代表酶的纯度，比活力 愈高，表示酶愈纯。在酶纯化过程中，比活力增 高。
4、菌种的制备：将斜面菌种在无菌条件下接种至 液体种子培养基中，在一定温度、转速下培养。
5、发酵：将摇床培养好的种子培养液接入发酵培 养基中，接种量为5 mL，共接3 瓶（100ml/250ml 瓶），做好标记。
实验步骤
发酵结束后：检查是否染菌 固液分离：方法自定； 发酵结束时，显微镜检查每个发酵瓶是否 污染，若无污染合并发酵液并测定发酵酶 活力。
α-淀粉酶制剂的理化要求
α-淀粉酶制剂的卫生要求
三、实验内容
微生物发酵法是酶制剂生产的主要方法。发酵生 产中多用液体深层发酵法制备酶。 大规模液体深层发酵之前，首先在实验室对保藏 的目的菌种进行活化和扩大培养，制得生产种子。 扩大培养多采用摇瓶培养，即在锥形瓶中加入一 定量的液体培养基，在摇床上以一定转速摇动进 行恒温培养。 摇瓶培养也是实验室模拟生产上进行发酵产酶的 一种模拟实验。（摇瓶发酵生产α-淀粉酶）
α-淀粉酶的生产工艺
a-淀粉酶的发酵生产工艺扌商要：a•淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
目前，a•淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。
1•菌种的选育1. 1细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10乞10-\10腐分别涂布到淀粉培养基上，27C倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。
将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。
保菌供下次实验用。
1. 2紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min.4min.6min、8min.10min,每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37C培养48h,分别计•数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。
1.3诱变方法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。
②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量（包/ml）,在一定pH值的缓冲液中30T恒温振荡处理1~4h°③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。
④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24h培养形成小菌落。
⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉B丫液体培养基中，30E培养36ho⑥用2#定性滤纸制成5mmdisc（小圆纸片），并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素（抑菌）。
倒入200mmx300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。
然后把5mmdisc纸顺序放在培养基表面。
⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。
把disc培养皿经37C,24h分别培养。
⑧把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc,用相对应的1ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。
枯草杆菌工业生产α-淀粉酶 郑州轻工业学院结课论文
枯草杆菌生产α-淀粉酶摘要：α-淀粉酶广泛应用于生产生活的各个方面，并且枯草杆菌生产技术也已经拥有相当成熟的工业生产线。
但随着社会的发展，对α-淀粉酶的生产也提出来更高的要求。
本文着重介绍枯草杆菌生产α-淀粉酶生产流程以及最新的最新研究进展。
关键词：枯草杆菌α-淀粉酶基因工程菌筛选1、α-淀粉酶：1.1理化性质：米黄色、灰褐色粉末。
能水解淀粉中的α-1，4,葡萄糖苷键。
能将淀粉切断成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，即起到降低稠度和“液化”的作用，所以此类淀粉酶又称为液化酶。
作用温度范围60~90℃，最适宜作用温度为60~70℃，作用pH 值范围 5.5~7.0，最适pH 值为6.01.2化学性质：α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。
此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1,4-链。
2、枯草芽胞杆菌：2.1细胞及菌落形态：枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。
单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
2.2产α-淀粉酶机制2.2.1机制一：枯草杆菌含有α-淀粉酶基因，通过基因的转录表达可以产生α-淀粉酶。
为了提高枯草杆菌的产酶能力，物理方法(射线和紫外线等)和化学方法(亚硝酸胍)常被用于诱变育种，其产酶能力提高一般5—6倍。
2.2.2机制二：利用基因工程的手段将枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因导入基因工程菌内并得到表达，提高产酶能力。
3、α-淀粉酶工业生产流程：3.1菌种的初筛复筛及优化3.1.1初筛：将土壤样品10g放入带有玻璃珠盛有100ml无菌水的三角瓶中。
淀粉酶实验方案
淀粉酶发酵制备一、实验目的1.学习并掌握从大曲中分离产淀粉酶菌种的方法1．学习并掌握液体摇瓶发酵法制备α-淀粉酶的工艺；2．掌握α-淀粉酶酶活测定原理及方法。
二、实验原理α-淀粉酶生产菌主要有芽孢杆菌和霉菌等。
芽孢杆菌所产α-淀粉酶由于活性高，发酵周期短，酶的耐热件高，尤其是枯草杆菌为大多数工厂所采用。
α-淀粉酶比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。
β-淀粉酶与α-淀粉酶相反，它不耐热但耐酸，70℃保温 15 min 可使其钝化。
通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。
可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70℃加热15 min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。
另外，β-淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。
还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。
以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。
三、实验器材与试剂1．实验器材（1）烧杯，三角瓶，玻璃棒，试管，容量瓶、离心管、移液管。
（2）电炉（加热板）、高压灭菌锅、恒温水浴锅、摇床、离心机、电子天平。
2．材料与试剂（1）菌种：大曲粉中产淀粉酶的菌种（经查资料为枯草杆菌）（2）培养基：1）斜面培养基：可溶性淀粉2%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH 7.0-7.2。
2）种子液体培养基：可溶性淀粉1%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH 7.0-7.2。
3）发酵培养基：葡萄糖 5%，豆饼粉5%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，无水氯化钙0.2%，MgSO4·7H2O 0.02%，pH7.0-7.2。
（3）酶活测定：1）称取碘11 g，碘化钾22 g，加水溶解，稀释至500 mL。
2）标准稀碘液：取碘原液15 mL，加碘化钾8 g，定容至500 mL。
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枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验
一、实验原理
以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。
通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。
淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。
芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。
通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。
二、实验材料
（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌
（二）培养基：
1、种子培养液：葡萄糖1% 、胰蛋白胨：1%, 、酵母提取物：0.5%、NaCl(氯
化钠)：1%
调pH7.2 ，若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。
2、产淀粉酶发酵培养液：玉米粉 2 .0 % 、蛋白胨1 .5% 、CaCl
2
0 .02 % 、
MgSO
40 .02% 、NaCl 0 .25% 、K
2
HPO
4
0 .2% 、柠檬酸钠0 .2% 、硫酸铵0 .075% 、
Na
2HPO
4
0 .2 %
调节pH 值7 .0
（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）
（四）实验仪器
离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管
三、实验过程
1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。
2、种子斜面及种子液准备
A.挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。
B.将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（ 100KPa 20min ）。
C.在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培养液中（每支斜面接两瓶），37℃ 120r／min振荡培养16h作种子液。
（6瓶/组）
3、发酵培养
A、按15-20％的接种量接种于装有50mL已灭菌菌发酵培养基的250ml三角瓶中。
37℃培养48h。
B、在无菌操作条件下，每4h取样2mL，测定酶活。
40-48h酶活降低后结束实验。
4、发酵结束后，用显微镜检查是否染菌。
5、待测酶液的制备：
称取1g~2g酶粉(精确至0.000 1 g)或准确吸取酶液1.00 mL，用少量磷酸缓冲液充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀。
用四层纱布过滤，滤液待用。
注:待测中温a-淀粉酶酶液酶活力控制酶浓度在3.4 u/mL~4. 5 u/mL范围内，待测耐高温淀粉酶活力控制酶浓度在60u/mL~65u/mL范围内。
6、酶活力的测定
吸取10.0 mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液2.5 mL，摇匀后，置于60℃±0.2℃(耐高温α-淀粉酶制剂置于70℃±0. 2℃)恒温水浴中预热8 min；加入0.5 mL稀释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5 min；
立即用移液管吸取1.0 mL反应液，加到预先盛有0.5 mL盐酸溶液和5.00mL 稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5 mL盐酸溶液和5.00 mL稀碘液为空白，于660 nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。
根据吸光度查表A.1，求得测试酶液的浓度。
7、酶活力计算
（1）中温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算:X1 = c× n
式中:
X
—样品的酶活力，u/mL或u/g
1
c—测试酶样浓度，u/mL或u/g
n—样品的稀释倍数（可通过反应时间和加入固定化酶的量来控制）。
注：所得结果表示至整数。
允许差：平行试验相对误差不得超过5%
（2）耐高温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算:X2 = c×n×16.67
式中:
X
—样品的酶活力，u/mL或u/g
2
c—测试酶样浓度，u/mL或u/g
n—样品的稀释倍数
16.67 —根据酶活力定义计算的换算系数。
注：所得结果表示至整数。
允许差：平行试验相对误差不得超过5%。