α-淀粉酶的发酵、提取和
淀粉酶的使用方法
淀粉酶的使用方法淀粉酶的使用方法淀粉酶是一种生物酶制剂，BF7658α―淀粉酶采用地衣芽孢杆菌经发酵、提取精制而成。
广泛应用于淀粉糖、酒精、啤酒、味精、食品酿造、有机酸、纺织、印染、造纸及其他发酵工业。
近年来有钓友用淀粉酶作鱼饵添加剂，发现其诱鱼效果非常显着，而且价格相对低廉，已成为钓友们制作鱼饵的优良添加剂。
淀粉酶的使用方法：1、直接添加到饵料中。
基础饵料一千克，淀粉酶一百克。
淀粉酶用适量温水溶解后，直接添加到饵料中搅拌均匀，放置半小时左右即可使用。
2、作为酶制剂糖化饵料。
淀粉酶能够把基础饵料中的淀粉发酵分解，变成淀粉糖，而且使饵料变得松软甘甜、富有粘性，增加饵料的适口性。
1〉玉米糁（或者经过脱皮的干玉米粒）一千克，用水浸泡十二小时以上，直到完全泡胀。
2〉把泡好的玉米置于锅中加凉水，加到高于玉米一厘米左右。
取淀粉酶一百克，用凉水溶解，加一半（五十克）到锅中。
3〉慢火加热，过程约半小时。
至沸腾时保持五分钟，停止加热。
4〉放置冷却到七十摄氏度左右（不很烫手的程度）时，加入另一半已溶解的淀粉酶，保温半小时后自然冷却。
5〉把已冷却的玉米用细纱布滤出水分，即可用来做基础饵料。
（滤出的水分不要丢弃，可以浓缩后再加到饵料中，其中含有麦芽糖等多种营养物质）第二种用法实质上就是工业“双酶法”生产淀粉糖的简化过程。
用这种方法处理过的玉米糁或者玉米粒，其中的淀粉已经部分或全部被糖化，玉米也变得松软甘甜，极大提高了饵料的适口性。
糖化后的玉米粒可以直接挂钩作钓饵。
糖化后的玉米糁作基础饵料，再加入适量的氨基酸、DMPT、香味剂等添加剂，配制成适用的饵料。
用糖化玉米做钓饵，对鲫鱼、鲤鱼、草鱼、鳊鱼等鲤科鱼类均有极好的诱钓效果。
α-淀粉酶的生产工艺
食品111 陈雅媚 14号
目的：
学习并掌握α－淀粉酶的制备工艺。
α－淀粉酶的背景知识
α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中， 能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄 糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之 一。目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及 淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发 酵以及纺织等许多行业。本次设计的淀粉酶发 酵，分别以玉米粉为碳源，以豆饼为氮源，以 BF-7658枯草芽孢杆菌为生产菌种,同时做出 了生产工艺流程图，详细的介绍了α-淀粉酶的 生产工艺。
3 4 5 6 7
可溶性淀粉溶液 温度条件和 保持时间 斐林试剂 温度条件和 保持时间
2ml
煮沸 1mil
有砖红色沉淀
2ml
煮沸 1mil
无砖红色沉淀
2ml
煮沸 1mil
无砖红色沉淀
实验现象
The end
谢谢 本次课程到此结束
取三支洁净试管，编上号，并分别按下表中序号1至5要求操作。
序 号 1
项
目
试
管
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
可溶性淀粉溶液
1 2ml
60º C热水
2 2ml
沸水
3 2ml
冰块
2
3 4 5
温度条件 (保持5min)
新鲜淀粉酶溶液 （保持5min） 碘液（滴）
1ml 1
不变蓝
1ml 1
变蓝
1ml 1
变蓝
实验现象
二、PH对酶活性的影响
4. 不易以搅拌方式进行质量传递，因此发酵期间， 物质的添加无法达到均匀。 5. 由于不易侦测，从发酵工程的观点来看，许多 工作都只是在定性或观察性质，故不易设计反应 器，难以量化生产或设计合理化的发酵流程。
枯草杆菌生产_淀粉酶的研究
１０科技创新导报 Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ２０１０ ＮＯ．２９Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ研 究 报 告α－淀粉酶是在淀粉加工、食品工业、医药工业、发酵工业及酿造、制糖和纺织工业上应用广泛的酶种，也是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一。
α－淀粉酶一般可由微生物发酵产生，也可由植物和动物提取。
目前，工业生产上都以微生物发酵法为主进行大规模生产α－淀粉酶。
我国从１９６５年开始应用枯草芽孢杆菌（Ｂｃａｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＦ－７６５８生产α－淀粉酶，当时仅无锡酶制厂独家生产，年产量为１０．２２吨。
现在国内生产酶制剂的厂家己发展到上千个，其中约有４０％～５０％的工厂生产α－淀粉酶。
总产量上万吨。
近年来，国外生产耐热α－淀粉酶发展较快，己从嗜热真菌、高温放线菌、特别是从嗜热细菌（嗜热脂肪芽孢杆菌Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｔ和地衣芽孢杆菌Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｕｓ等）中分离得到了耐高温的α－淀粉酶菌种。
但就国内而言，虽己开展了耐高温α－淀粉酶的研究工作，目前仍以枯草杆菌菌株生产α－淀粉酶为主。
本文就枯草杆菌在淀粉培养基上产α－淀粉酶做一下研究，其对在以玉米（淀粉含量为７０％～７５％）或大米（淀粉含量为８０％～８５％）主要原料的发酵酿酒过程，具有实际的指导意义。
１ 材料和方法１．１实验材料１．１．１菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）为实验室保藏菌种。
１．１．２种子培养基 马铃薯固体（及液体）培养基（简称ＰＤＡ，马铃薯２００ｇ、蔗糖２０ｇ、琼脂１５ｇ、水１０００ｍｌ、ＰＨ自然，马铃薯去皮，切成块煮沸３０ｍｉｎ，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至１０００ｍｌ。
１２１℃灭菌３０ｍｉｎ）１．１．３发酵培养基 淀粉液体培养基（可溶性淀粉、蒸馏水、ｐＨ自然。
α-淀粉酶
α-淀粉酶在结构上的相似性使人们相信它们具有相似的 催化机制。McCarter、Davies均提出α-淀粉酶的催化过 程包括三步，共发生2次置换反应。第一步，底物某个 糖残基要先结合在酶活性部位的-1亚结合位点，该糖基 氧原子被充当质子供体的酸性氨基酸(如Glu)所质子化;第 二步，-1亚结合位点的另一亲核氨基酸(如Asp)对糖残基 的Cl碳原子进行亲核攻击，与底物形成共价中间物，同 C 时裂解Cl-OR键，置换出底物的糖基配基部分;第三步， 糖基配基离去之后，水分子被激活(可能正是被刚去质 子化的Glu所激活)，这个水分子再将Asp的亲核氧与糖残 基的C1之间的共价键Cl-Asp水解掉，置换出酶分子的Asp 残基，水解反应完成。在第二次置换反应中，如果进攻 基团不是水分子，而是一个带有游离羟基的糖(寡 糖)ROH，那么酶分子的Asp残基被置换出后，就发生了 糖基转移反应而非水解反应。
在米曲霉的Taka-淀粉酶A(TAA)中，在活性部 位发现有三个酸性氨基酸残基，Asp206， Glu230，Asp 297，定点突变研究发现它们 是催化所必需的氨基酸。研究发现TAA中这 三个催化所必需的氨基酸在其它的α-淀粉酶 以至于α-淀粉酶家族中也是共有的。
Tonozaka(1993)通过对不同来源的37个α-淀粉酶基因分支酶基因，异 淀粉酶基因等进行同源序列的比较，微生物与动物和植物产生的α-淀 粉酶的氨基酸序列之间的同源性不超过10%，但发现这些淀粉酶有 ABCD四个区域有高度的保守性，推测这些保守区域与其底物的结合 或催化中心有关。 尽管不同来源的α-淀粉酶在氨基酸序列上是不同的，但它们却共同拥 有相同的基本次级结构，如(β/α)8结构(亦称之为TIM－桶)——由8个螺 旋包围8个β-折叠组成的筒状结构。该结构被认为具有催化能力的结 构。 YJanec k，S.通过对α-淀粉酶家族研究发现大部分α-淀粉酶除了含有 八个(β/α)桶状结构的催化中心(domain A)外，还包括domains B、C和 D。其中domain B具有三个β折叠和三个α螺旋，长度和结构随来源的 不同而变化。Domain C区是催化区域后面的区域，主要由β折叠组成， 该区被认为有保护催化中心疏水氨基酸的稳定性的作用。 另外，有一些α-淀粉酶包含一个没有催化功能的淀粉结合位点(starchbinding domain)。 此外，几乎所有α-淀粉酶都是金属酶，每个酶分子至少含有一个钙离 子，钙离子使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定 性。
α-淀粉酶的生产工艺流程
α-淀粉酶的生产工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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α淀粉酶
6制药和临床化学分析
已有报道，基于α一淀粉酶的液体稳定试剂已应用于全自动生化分析仪(CibaComingExpress)临床化学系统。
二α—淀粉酶的研究现状
1国内α一淀粉酶研究现状
1965年，我国开始应用淀粉芽孢杆菌BF一7658生产一淀粉酶，当时只有无锡酶制剂厂独家生产。1967年杭州怡糖厂实现了应用α一淀粉酶生产饴糖的新工艺，可以节约麦芽7％～10％，提高出糖率10％左右。1964年我国开始了酶法水解淀粉生产葡萄糖工艺的研究。l979年9月通过了酶法注射葡萄糖新工艺的鉴定，并先后在华北制药厂、河北东风制药厂、郑州嵩山制药厂等单位得到应用，取得了良好的经济效益。
2淀粉的液化作用和糖化作用
α一淀粉酶的主要市场是淀粉水解的产物，如葡萄糖和果糖。淀粉被转化为高果糖玉米糖浆(HFCS)。由于他们的高甜度，被用于饮料工业中软饮料的甜味剂。这个液化过程就用到在高温下热稳定性好的α一淀粉酶。α一淀粉酶在淀粉液化上的应用工艺已经相当成熟，而且有很多相关报道。
3纤维脱浆
由于α一淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。国内有代表性的研究单位有：四川大学，主要研究α一淀粉酶的生产菌株及其培养条件；江南大学，主要研究α一淀粉酶的结构以及应用性能，如耐热性、耐酸性；西北大学，主要研究α一淀粉酶的变性机理以及环境对α一淀粉酶的影响；华南理工大学，主要研究α一淀粉酶的固定化和动力性质；还有华中农业大学，中国科学院沈阳应用生态研究所，天津科技大学，南开大学生命科学学院，中国农业科学院，中国科学院微生物研究所等多家研究机构对多种α一淀粉酶生产菌的一淀粉酶基因进行了克隆以及表达研究。国外有代表性的研究单位有：加拿大的UniversityofBritishColumbia，他们对人胰腺的一淀粉酶结构和作用机理进行了深入的研究；丹麦的Carlsberg实验室主要研究大麦α一淀粉酶结构域与结合位点；美国的WesternRegionalResearchCenter主要研究大麦的α一淀粉酶与抗菌素的作用以及大麦α一淀粉酶的活性位点。
实验6：α淀粉酶固定化
实验预期结果： 水解产物糊精遇碘呈红色.
固定化酶技术生产果糖浆的图示：
把酶固定在反应柱上 有何好处？
反应柱能连续使用半 年，大大降低了生产 成本，提高果糖的产 量和质量。
三、 酶的固定化方法
1、物理吸附法：将酶吸附到固体吸附剂表面的 方法，固体吸附剂多为活性碳、 多孔玻成格子型或 包埋成微胶囊型
酶的固定化方法
酶 物理吸附法 交联法 包埋法
直接使用酶和固定化酶的优缺点
类型 优点
不足
直接 使用 酶
催化效率高，低耗 对环境条件非常敏感，容易
二 、酶的特点 ①天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机 溶剂等条件非常敏感，容易失活 ②溶液中酶很难回收，不能再次利用，提 高了生产成本 ③反应后，酶会混在产物中，影响产品质量， 难以在工业生产中广泛应用
固定化酶：将水溶性的酶用物理或化学的方法固 定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活 性的制剂。
能、低污染等
失活；溶液中的酶很难回收，
不能被再次利用，提高了生
产成本；反应后酶会混在产
物中，可能影响产品质量.
固定 化酶
酶既能与反应物接 一种酶只能催化一种化学反 触，又能与产物分 应，而在生产实践中，很多 离，同时，固定在 产物的形成都通过一系列的 载体上的酶还可以 酶促反应才能得到的 被反复利用
• 实验原理：用吸附法将a-淀粉酶固定在石英砂 上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后， 可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试， 流出物呈红色表明水解产物糊精生成.
淀粉 α-淀粉酶 糊精 β淀粉酶 麦芽糖 糖化淀粉酶 葡萄糖
α-淀粉酶
根据淀粉酶对淀粉的水解方式不同，可将其分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶等。
其中，α-淀粉酶（α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖苷酶)多是胞外酶，其作用于淀粉时可从分子内部随机地切开淀粉链的α-1，4糖苷键，而生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子构型为α-构型，故称α-淀粉酶。
α-淀粉酶来源广泛，主要存在发芽谷物的糊粉细胞中，当然，从微生物到高等动、植物均可分离到，是一种重要的淀粉水解酶，也是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
它可以由微生物发酵制备，也可以从动植物中提取。
不同来源的α-淀粉酶的性质有一定的区别，工业中主要应用的是真菌和细菌α-淀粉酶。
目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，是一种重要工业用酶。
如在淀粉加工业中，微生物α-淀粉酶已成功取代了化学降解法；在酒精工业中能显著提高出酒率。
其应用于各种工业中对缩短生产周期，提高产品得率和原料的利用率，提高产品质量和节约粮食资源，都有着极其重要的作用。
相对地，关于α-淀粉酶抑制剂国内外也有很多研究报道，α-淀粉酶抑制剂是糖苷水解酶的一种。
它能有效地抑制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，降低人体糖份吸收、降低血糖和血脂的含量，减少脂肪合成，减轻体重。
有报道表明，α-淀粉酶可以帮助改善糖尿病患者的耐糖量。
α-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，其最早的商业化应用在1984年，作为治疗消化紊乱的药物辅助剂。
现在，α-淀粉酶已广泛应用于食品、清洁剂、啤酒酿造、酒精工业和造纸工业。
在焙烤工业中的应用：α-淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大，纹理疏松；提高面团的发酵速度；改善面包心的组织结构，增加内部组织的柔软度；产生良好而稳定的面包外表色泽；提高入炉的急胀性；抗老化，改善面包心的弹性和口感；延长面包心储存过程中的保鲜期在啤酒酿造中的应用：啤洒是最早用酶的酿造产品之一，在啤洒酿造中添加α-淀粉酶使其较快液化以取代一部分麦芽，使辅料增加，成本降低，特别在麦芽糖化力低，辅助原料使用比例较大的场合，使用α-淀粉酶和β-淀粉酶协同麦芽糖化，可以弥补麦芽酶系不足，增加可发酵糖含量，提高麦汁率，麦汁色泽降低，过滤速度加快，提高了浸出物得率，同时又缩短了整体糊化时间。
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0.0
双缩脲试剂（ml）
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
蛋白含量（mg/ml）
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1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
?
震荡15分钟，室温静置30分钟后，540nm比色，以蛋白质含量（mg/ml）为横坐标，吸 光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 取发酵液5ml +5ml去离子水(即稀释一倍) 3. 分别测定发酵液和提取液中的α-淀粉酶的酶活并 计算它们各自的酶比活力 α-淀粉酶的酶活测定 （1）吸取1ml标准糊精溶液，置于盛有3ml标准 稀碘液的试管中 （2） 在试管中加入2%可溶性淀粉5ml,加缓冲液 5ml,在60度水浴中平衡4-5分钟,加入1ml稀释酶液, 立即记时,充分混匀,1分钟后取出1ml反应液于预先 盛有3ml比色稀碘液的试管内(也需放在水浴中),当 颜色反应由紫色逐渐变成棕色,与标准比色管颜色相 同时,记录时间为反应时间(发酵液和提取液每组各 做2个重复)
四、 思考题 1．活性回收率通常小于1，有没有可能大于1， 为什么？ 2.双缩脲法测定蛋白质质量，只与待测蛋白质 质量有关，而与分子量无关，为什么？ 实验报告 清洁
发酵培养基
摇瓶发酵：500ml三角瓶内装发酵培养基 50ml，其组成为：玉米粉7%，豆饼粉5%， 磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钠 0.15%，灭菌前ph7.0~7.5，灭菌后 ph6.5~7.0.接种后置往复式摇床（往复次数 96次/分钟），37±1℃下培养44~48小时。 所有比例均为重量体积比 g/ml 共装三瓶，每瓶50ml，共计150ml
2. 在碱性溶液(NaOH)中，双缩脲 (H2NOC—NH—CONH2)能与Cu2+作用， 形成紫色或紫红色的络合物，这个反应 叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含 有很多与双缩脲结构相似的肽键（－CO －NH－），因此，蛋白质可与双缩脲试 剂发生颜色反应。 此络合物在540nm吸 收值在一定范围内与蛋白质的质量成正 比.
3. 淀粉在碘液中会呈现紫色。α-淀粉酶 作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1， 4键而生成糊精和还原糖。而糊精和还原 糖在碘液中不显色，故可通过预先盛有 淀粉和比色稀碘液的试管中的颜色变化 （由紫色变棕色）来辨别反应终点。
三、实验步骤 1. 硫酸铵沉淀法从发酵液中分离α-淀粉 酶。 先将固体硫酸铵研成细粉末，然后按37% （重量/体积比）的比例加入到经离心的发 酵液中，混合均匀， 静置30min。 具体操作:50ml发酵液,加18.5克硫酸铵细 粉末,混匀, 静置30-60min. 两组配平,4000r.m.p离心10分钟, 离心去 除上清液保留沉淀。测活前加入10ml去离 子水溶解。
2.双缩脲法绘制小牛血清白蛋白标准曲线 取7支试管，编号，按下表加入试剂：
管 试 剂 1 2 3 4 5 6 7 号
标准蛋白溶液（ml）
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Hale Waihona Puke 1.00.5 ml (待测蛋白) +0.5 ml（0.1M NaOH
0.05M NaOH（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
α-淀粉酶的发酵、提取和活性测定
背景知识
淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，广 泛存在于动植物和微生物中。α-淀粉酶作 用于淀粉时，可从分子内部切开α-1，4键 而生成糊精和还原糖。产物的末端葡萄糖 残基C1碳原子为α-构型，故称α-淀粉酶。 如枯草杆菌BF7658 α-淀粉酶，广泛应用于 食品、酿造、制药、纺织以至石油开采等 许多方面。
一、实验目的 通过以α-淀粉酶的发酵生产为实例，学 习和掌握酶的液体发酵和盐析沉淀法提 取纯化的基本原理和过程，掌握α-淀粉 酶分析方法、发酵和提取的评价标准。
二、实验原理 1、工业生产中酶的提取多数采用盐析沉 淀法，即：通过加入不同的金属盐破坏 酶的水化层同时中和酶的表面电荷，而 使酶快速的形成沉淀，得到分离纯化。 本实验通过向枯草杆菌发酵液中加入适 量的硫酸铵，对发酵液中的胞外α-淀粉 酶进行纯化提取。
计算: 酶活性单位:以1克酶粉或1ml酶液于60 度,pH为6.0的条件下,在1小时内液化可溶性 淀粉的克数表示（u） 淀粉酶活力单位=(60/t *5*2%*f)/体积 试中f表示酶的稀释倍数,t为反应时间 淀粉酶比活力=活力单位/蛋白质含量（u/mg） 活性回收率=（提取液酶活×提取液体积）/ （发酵滤过液酶活×用于盐析沉淀的发酵滤 过液体积）