淀粉酶菌株的选育、发酵工艺的研究及酶的纯化
产淀粉酶菌株的分离与提纯
产淀粉酶菌株的分离与提纯摘要：淀粉酶是一种广泛应用于食品、饲料和生物能源领域的酶类。
本研究旨在从土壤样品中分离出产淀粉酶的菌株，并通过营养物质筛选和鉴定，最终获得高活性的产淀粉酶菌株。
分离出的菌株经过形态学、生化和分子生物学鉴定，最终确定为放线菌属。
通过筛选和优化培养基组成、培养条件、发酵时间等参数，获得了产淀粉酶的高产菌株，其中最高淀粉酶活性达到406.2 U/mL。
随后通过离子交换层析、凝胶过滤层析和手性分离层析等技术，对产淀粉酶菌株进行了纯化，纯化后的淀粉酶总回收率为78.5%。
本研究拓展了淀粉酶菌株的来源渠道，并提供了一种有效的产淀粉酶筛选和提纯技术。
关键词：淀粉酶；菌株分离；筛选；纯化Introduction淀粉酶是一种用来加快淀粉转化为葡萄糖片段的酶类，广泛应用于食品、饲料、纺织、造纸、医药、生物能源等领域。
因此，发现新的产淀粉酶的菌株和提高淀粉酶的产量和纯化度具有很大的应用前景和经济价值。
本研究旨在从土壤样品中分离出产淀粉酶的菌株，并通过筛选和鉴定，最终获得高活性的产淀粉酶菌株。
随后，通过离子交换层析、凝胶过滤层析和手性分离层析等技术，对产淀粉酶菌株进行了纯化。
Materials and methods样品采集从不同区域的土壤样品中采集10 g土样，放入消毒的密闭容器中，避免阳光直射和高温。
待采集完毕后立即运回实验室处理。
淀粉酶活性测定淀粉酶活性采用Miller方法测定，在37℃下反应15 min后，以0.01mol/L NaOH终止反应，读取吸收度A450。
反应体系为：淀粉溶液 1 mL、哌嗪酸盐缓冲液1 mL、酶液1 mL。
菌株分离取0.1 g土样加入0.9mL 生理盐水中，混合搅拌均匀后，依次向1.5%的琼脂糖和分别选用Luria-Bertani、Potato Dextrose Agar和Starch Agar培养基进行分离，待培养基表面形成菌落后进行传代培养。
通过形态学、生化和分子生物学鉴定，确定产淀粉酶菌株。
实验六十淀粉酶产生菌株的筛选
实验六十淀粉酶产生菌株的筛选实验项目性质：设计性涉及的知识点：无菌技术、浓缩培养、纯种子分离、淀粉酶特性和酶活性测定。
计划学时：8学时一、实验目的1.掌握从环境中采集样本并从中分离纯化某些微生物的完整操作步骤。
2.巩固之前所学的微生物学实验技术。
3.掌握产酶微生物的筛选方法。
二、实验原理α-淀粉酶是一种液化淀粉酶。
其产生菌芽孢杆菌广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉的土壤样品中。
从自然界筛选菌株的具体方法大致可分为以下四个步骤：取样、增殖培养、纯种子分离和性能测定。
1、采样：即采集含菌的样品在收集含有细菌的样本之前，你应该调查和研究你打算筛选的微生物分布在哪里，然后你可以开始做各种具体的工作。
几乎所有种类的微生物都可以在土壤中找到，因此土壤可以说是微生物的基础。
在土壤中，细菌数量最多，其次是放线菌、第三种霉菌和酵母。
除土壤外，各种物体上都有相应的优势微生物。
例如，枯枝、腐叶、腐土和腐木中的纤维素分解细菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中的淀粉分解细菌较多，水果和蜜饯表面的酵母较多；植物奶中含有较多的乳酸菌，油田和炼油厂附近的土壤中含有较多的石油分解菌。
2、增殖培养（又称丰富培养）增殖培养是在采集的土壤和其他含有细菌的样本中添加一些物质，并创造一些其他有利于待分离微生物生长的条件，以便能够分解和利用这些物质的微生物能够大量繁殖，以便我们从中分离出这些微生物。
因此，增殖培养实际上是选择性培养基的实际应用。
3、纯种分离在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。
通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。
纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。
4.业绩衡量分离得到纯种这只是选种工作的第一步。
所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。
但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。
从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。
平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。
本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。
二、分离及纯化1、材料试剂:营养琼脂、淀粉、土壤、碘液等器皿：移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、接种环等仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱其他：报纸、纱布、棉花、面线绳2、方法2.1培养基与器皿的准备和灭菌（1）培养基的配制称量1.2克淀粉。
加少量水加热溶化，然后加入6.8克营养琼脂，加水至150毫升，煮沸后倒入250ml容量的三角瓶中，加棉塞后放入高温蒸汽灭菌锅内灭菌备用。
（2）无菌水的制备分别取9ml蒸馏水加入5支试管中，加塞后用报纸包扎捆绑，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌备用。
取90ml蒸馏水加入250ml三角瓶中，同样的操作，灭菌备用。
（3）器皿的准备将刻度吸管用报纸包扎，培养皿装入专用灭菌杯分别放入高温灭菌箱灭菌备用。
2.2菌悬液的制备和梯度稀释取10g土壤样品加入90ml无菌水中震荡, 然后静置2分钟。
取六只试管编号1—6分别加入9ml无菌水，从菌悬液中取1ml 上清液加入1号管后震荡摇匀，然后再从1号管中取1ml加入2号管震荡摇匀，依次操作六个试管，得到10ˉ1—10ˉ6六个稀释度的菌悬液。
淀粉酶产生菌的筛选、培养与选育
功能微生物（淀粉酶产生菌）的筛选、培养与选育22100934 程雅楠摘要：以产淀粉酶细菌的筛选和选育为目标，通过培养基制备及灭菌、菌种的分离筛选与纯化、菌种的鉴定、培养条件的优化以及淀粉酶产生菌的紫外诱变育种等五个过程，并测定了诱变后菌株的16s序列，初步掌握了对某菌种进行筛选、选育及诱变的必需步骤。
关键词：产淀粉酶细菌筛选选育诱变育种淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平，首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良的突变菌株。
淀粉酶主要来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的尤为重要。
此次试验试图从土壤中分离出产淀粉酶的细菌，通过紫外线诱变育种等条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。
以达到加深对菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
1材料和方法1.1材料1.1.1 来源：南师大北区教学楼附近的土壤。
1.1..2培养基：淀粉培养基的配制①固体培养基膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。
②液体培养基：牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。
优化条件培养基配制：①淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 4.0 。
②淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L， K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 7.2 。
碳源培养基：①淀粉 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2。
a-淀粉酶的生产工艺
a-淀粉酶的生产工艺
淀粉酶是一类能够水解淀粉并将其转化为糖类的酶。
它广泛用于食品、饲料、纸浆、
发酵等行业中。
1. 酶菌的选育和培养
淀粉酶可由多种细菌、真菌和原生动物合成，其中最常用的是泌秀菌和枯草芽孢杆菌。
选用高产菌株和适合生产的菌株进行发酵，产生高效淀粉酶。
2. 发酵工艺
发酵工艺是淀粉酶生产的关键步骤。
其主要过程是菌种培养、接种、发酵、分离等。
泌秀菌的发酵条件为温度35℃-42℃，pH为6.0-7.0，培养液中含有可溶性淀粉、氮源、
矿物质以及适量的辅助物质，如表面活性剂等。
枯草芽孢杆菌的发酵条件为温度37℃-55℃，pH为6.5-7.5，培养液中含有可溶性淀粉、氮源和矿物质等。
3. 酶液的提取和纯化
对发酵液进行酶液的提取和纯化，可以采用离心、过滤、超滤、稳态层析等方法。
离
心可将大颗粒杂质和沉淀物去除。
过滤和超滤可去除小颗粒杂质和未溶解物质。
稳态层析
能够去除其他蛋白质等酶外蛋白。
为增强淀粉酶的稳定性，可以将其进行稳定化处理。
稳定化的方法包括添加保护剂、
离子交换、交联、酯化等。
保存时，应避免酶液暴露在空气中、光照下或高温中。
一般情
况下，淀粉酶的保存温度应低于0℃。
总之，淀粉酶的生产工艺涵盖了选育和培养酶菌、发酵、酶液的提取和纯化、稳定化
和保存等多个环节。
只有采取稳定的生产工艺和高效的酶菌，才能获得高质量的淀粉酶产品。
高产淀粉酶菌株的分离及发酵工艺改良
ｓ ａ ｓｅ ｉｕ ｒ ａ Ａ ６８ （ ｓｅｇｌｓｏ ｚｅ ，ａ ｄｔｅｏ ｔ ｕ ｒ ｎ ｓｕ ｔｎｉ ４ Ｃ，ａ ｄｔｅｐ ａ ｅｏ ｔ ｉ ｉ Ａ ｐ ｒ ｌ ｓｏ ｚｅＱ ９ ． Ａ ｐｒ ｌ ｒ ａ） ｎ ｐｉ ｍ ｆ ｍｅｔ ｉ ａｏ ｓ ０ｏ ｒｎ ｓ ｇｌ ｙ ｉｕ ｙ ｈ ｍ ｅ ｔ ｉ ｎ Ｈ ｖ ｕ ｆ ｈ ｌ
高产淀粉 酶菌株 的分 离及发 酵工艺 改 良
王宏强 ，夏 明 ，蒋水姣 ，姜 宇翔 ，李 明智
（ 浙江 中医药大学 药学院 ，浙江 杭 州 ３０５） １０ ３ 摘要 ：从 自然界 中筛选 高产淀粉酶菌株 ，为＿业生产淀粉酶提供储备菌株。利用淀粉水解圈直径与菌落的直径比和单 Ｔ 糖 含量为指标 ，筛选 高产淀粉酶的菌株 ，运用 均匀试验设计 ，结合 Ｄ Ｓ数据处理软件分析 ，从温度 和 ｐ Ｐ Ｈ值两方面 改 良并优化发 酵条件 ，提 高菌株产酶 能力。结果表 明 ，经筛选后 得到 的产淀粉 酶菌株 为米 曲霉 Ｑ ９ ． （ ｓｅｇｌｓ Ａ ６８ Ａ ｐ ｒｉｕ ｌ ｏｙａ） ｒｚｅ ，最佳发酵条件为 ：温度 ４ ０℃，培养基 ｐ Ｈ值 ４０ ．。由其发酵所得的淀粉酶最适反应温度为 ５ ５℃，最适作用 ｐ Ｈ 值 ５０ ．，同时测得酶活力为 ３ ０ ／ Ｌ ０Ｕｍ 。 ９ 关键词 ：淀粉酶 ；筛选 ；发酵 ；产酶能力
ｐ ｏ ｃ ｉｎ ｂｙ ａ ｌｉ ｇ ｕｎｆ ｒ ｅ ｐｅ ｍｅ ａ ｄ ｓｇ ｗｉｈ ｒ ｄｕ ｔｏ ｐｐｙ ｎ ｉｏ ｍ ｘ ｒ ｎｔ ｉ ｌ ｅ ｉｎ ｔ ＤＰＳ ｔｔｓｉａ ｎａｙ ｉ ｓ ｆｗａ ｅＴｈ ｒ ｓ ｌｓ ｈｏ ｓａ ｉｔｃ ｌａ ｌｓｓ ｏｔ ｒ ． ｅ ｅ ｕ ｔ ｓ ｗ ｔａ ｔ ｃ ｏ ｅ ｈ ｔ ｈｅ ｈ ｓ ｎ
产淀粉酶菌株的筛选实验报告
产淀粉酶菌株的筛选实验报告一、实验背景淀粉酶是一种常见的酶，广泛存在于微生物和植物中。
淀粉酶能够水解淀粉分子，将其分解成糖类分子，如葡萄糖、麦芽糖等。
淀粉酶广泛应用于食品、医药、环保等领域中。
制备高效的产淀粉酶菌株，对实现产业化生产具有重要意义。
二、实验目的通过筛选不同菌株的淀粉酶产量，选出产淀粉酶效果较好的菌株，为后续工业化生产提供依据。
三、实验步骤及方法1. 菌株的选取本实验选取了3株常见的淀粉酶产生菌株，分别为Bacillus subtilis、Aspergillus niger、Trichoderma reesei。
2. 菌株的培养将3株菌株接种到琼脂培养基中，经过静置培养后，选取菌落较为圆润、生长状态良好的菌落，移植至含有淀粉质的液体培养基中，进行淀粉酶产量的筛选实验。
3.淀粉酶活性的测定分别取3组接种液，以葡萄糖和淀粉为基质，分别加入菌液，进行淀粉酶活性测定。
具体步骤如下：(1)准备含1%淀粉质的液体培养基和0.5%葡萄糖液体培养基。
(2)将接种液投入含1%淀粉质的液体培养基中，加入0.1mol/L乙酸钠溶液，pH为5.6，放置于37℃水浴中反应30min，加入 1%伊红色溶液备用。
(3)将接种液投入含0.5%葡萄糖的液体培养基中，加入0.1mol/L乙酸钠溶液，pH为5.6，放置于37℃水浴中反应30min，加入1%伊红色溶液备用。
(4)通过比较加入菌液前后溶液颜色的深浅，计算出淀粉酶的酶活力。
4. 结果记录及分析根据上述实验步骤，在不同的液体培养基中测定了3株菌株的淀粉酶活性，并记录结果如下表所示：表1.不同菌株的淀粉酶活性| 菌株名称 | 淀粉酶酶活力 || ------------------ | --------------- || Bacillus subtilis | 0.19 U/mL || Aspergillus niger | 0.21 U/mL || Trichoderma reesei | 0.23 U/mL |根据上表结果可以看出，3株菌株在淀粉酶产量方面的效果有所不同。
淀粉酶高产菌的筛选、诱变、鉴定及应用虚拟仿真实验教学项目
淀粉酶高产菌的筛选、诱变、鉴定及应用虚拟仿真实验教学项目淀粉酶是一种重要的生物催化剂，广泛应用于食品、饲料、制糖等工业中。
如何筛选出高产淀粉酶的菌株，是淀粉酶工业化生产的关键之一。
本文将介绍淀粉酶高产菌的筛选、诱变、鉴定及应用虚拟仿真实验教学项目。
一、淀粉酶高产菌的筛选淀粉酶高产菌的筛选一般采用微生物发酵技术。
首先，从自然环境中采集样品，接种到含有淀粉的培养基中，经过培养、筛选，筛选出淀粉酶活性较高的菌株。
然后通过连续发酵和分离纯化，得到高产淀粉酶的菌株。
二、淀粉酶高产菌的诱变淀粉酶高产菌的诱变是指通过物理、化学或生物手段对菌株进行改良，使其淀粉酶活性提高。
常用的诱变方法有辐射、化学诱变、基因工程等。
其中，辐射诱变是一种常用的方法，它能够引起DNA链断裂、交叉互换等突变现象，从而产生新的菌株。
三、淀粉酶高产菌的鉴定淀粉酶高产菌的鉴定是指对筛选出来的菌株进行分子生物学和生化学检测，确定其淀粉酶活性是否真正提高。
常用的检测方法包括聚合酶链式反应（PCR）、电泳分析、酶活性测定等。
通过这些方法，可以对淀粉酶高产菌进行准确鉴定，为其后续应用奠定基础。
四、应用虚拟仿真实验教学项目为了帮助学生更好地了解淀粉酶高产菌的筛选、诱变、鉴定及应用，我们开发了一款虚拟仿真实验教学项目。
该项目采用虚拟实验室技术，将实验室操作过程模拟成电脑程序，并通过图像和声音等方式呈现给学生。
通过该项目，学生可以在不受时间和空间限制的情况下，进行实验操作和数据分析，提高实验操作技能和理论知识水平。
总之，淀粉酶高产菌的筛选、诱变、鉴定及应用是淀粉酶工业化生产中的关键环节。
通过不断探索和创新，我们可以更好地发掘淀粉酶的潜力，为人类生活和工业发展做出更大的贡献。
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淀粉酶菌株的选育、发酵工艺的研究和酶的纯化摘要：淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平，首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良的突变菌株，再用正交试验的方法对其发酵条件进行优化，实验最后采用硫酸铵沉淀法初步纯化发酵得到的淀粉酶并对酶活性进行了测定。
关键词：淀粉酶；分离筛选；紫外线诱变；优化；提纯1、引言淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多，特点各异，在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途。
我国是传统的农业大国，发展淀粉深加工工业是解决当前淀粉生产积压的好出路，而几乎所有淀粉深加工工业的基础都是以淀粉质原料的水解作为第一步，因此淀粉质原料的液化情况直接关系到产品后期的加工工艺和产品的质量。
所以，改进淀粉液化工艺也是降低生产成本，提高产品市场竞争能力的一种重要手段。
显然，改进淀粉液化工艺首要任务就是提高淀粉酶的生产水平。
那如何提高淀粉酶的生产水平呢？我们知道，现在淀粉酶主要来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事。
本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的枯草杆菌，通过紫外线诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株，并对发酵得到的淀粉酶进行初步提纯，以达到加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、了解发酵条件对产物形成的影响、熟悉发酵条件的优化方法、掌握分光光度法测液化型淀粉酶活力的基本原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
2、材料与方法2. 1 实验材料2．1．1 样品：贵师大综合楼附近的土壤2．1．2 培养基和试剂：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨（斜面）、牛肉膏蛋白胨（液体）种子培养基、淀粉酶发酵培养基、生理盐水、碘液、2％可溶性淀粉、硫酸铵、乙酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液2．1．3 仪器设备：全自动高压灭菌锅、培养皿、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液管、PH试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、记号笔等。
2. 2 实验方法2．2．1 细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10-3 、10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上，27℃倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。
将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。
保菌供下次实验用。
2．2．2 紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37℃培养48h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。
2．2．3生产菌株摇瓶发酵条件的优化2．2．3．1 培养基初始pH值和装液量对产酶的影响：用1mol/L盐酸或1mol/L 氢氧化钠调节培养基pH值，使培养基的pH值为5.0、7.0、9.0，分装至250mL 三角瓶中，每瓶25mL，灭菌，冷却后编号1、2、3，再接种，37℃下恒温摇床培养48h（摇瓶装液量分别30％、40％、50％），最后测定发酵液酶活。
2.2.3.2 培养基碳源对产酶的影响：在不含可溶性淀粉的培养基中，分别加入0.5％的各种碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖），以硝酸铵作为唯一氮源，进行碳源对产酶的影响的发酵试验。
2.2.3.3 正交试验设计：通过三因素两水平的正交试验对高产菌的发酵条件进行优化，建立高产菌株的最佳摇瓶发酵条件。
2．2．4 淀粉酶的初步提纯及酶活性的测定2.2.4.1 淀粉酶的初步提纯：收集发酵液，3000r/min离心10min，去除菌体，在上清液中加入65％饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h，然后5000r/min离心20min，得到初步纯化的淀粉酶。
2.2.4.2 标准曲线的制作和酶活性的测定：将可溶性淀粉稀释成0.2％、0.5％、1％、1.5％和2％的稀释液，按下表进行标准曲线的制作和酶活性的测定。
管号 1 2 3 4 5 6 7．1 7．2 7．3 7．4淀粉稀释液/mL2（0％）2（0.2％）2（0.5％）2（1％）2（1.5％）2（2％）2（2％）2（2％）2（2％）2（2％）缓冲液/mL 1 1 1 1 1 1 1 1 1 140℃水浴保温5min蒸馏水/mL 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 粗酶液/mL 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 40℃水浴保温30min，然后加入0.5mol/L乙酸10 mL，混均吸取反应液1 mL 碘液/mL 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 A660（平均值）（7．1、7．2、7．3、7．4中加入的粗酶液，即为正交试验设计中处理一、处理二、处理三、处理四所得的淀粉酶液）注：①前6组的数据用于标准曲线的制作：以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线；②后4组的数据用于酶活性的测定：测得吸光度后，可从标准曲线中查出相应的淀粉浓度，求出被消耗的淀粉量，这里的酶活即为每毫升粗酶液于40℃，PH6.0的条件下，每小时液化可溶性淀粉的毫克数【mg可溶性淀粉/m L·h】。
3、结果与分析3. 1 菌落的形态特征菌落在以淀粉为唯一碳源的分离培养基中生长，培养48 h形成白色圆形菌落，菌落背面乳白色，边缘不光滑，形态规则，质地较密，有透明圈，无沉淀。
3. 2 计算D/d值3．2．1 分离筛选时，大部分菌落水解圈都粘连在一起，无法准确测得D/d值，只得到少部分数据:单菌落透明圈直径/mm(D) 菌落直径/mm(d) D/d① 4.0 3.0 1.3②14.0 7.1 2.0表A 透明圈直径和菌落直径及比值分析：无法准确测得D/d值，可能是所采土样中产淀粉酶的细菌含量较多，涂平板之前稀释倍数不够导致单菌落过于密集，水解圈粘连；也可能是实验操作不当所致。
3．2．2 紫外诱变后，得到单菌落的透明圈直径和菌落直径及比值：单菌落透明圈直径/mm(D) 菌落直径/mm(d) D/d① 4.8 3.0 1.6② 6.4 5.5 1.2③14.8 7.4 2.0④16.0 4.9 3.3⑤11.8 4.5 2.6⑥9.8 4.0 2.5⑦25.0 5.0 5.0⑧8.8 4.0 2.2⑨14.0 7.8 1.8分析：通过结果，可看出经过紫外诱变后，有的菌株产酶活能力有所提高，有的减小，筛选产酶活能力最高的菌株，保存供后续试验使用。
我们挑⑦号菌，将其保存到斜面培养基上供后续试验使用。
3. 3 计算菌株紫外诱变的致死率对菌株分别用紫外线处理，得到下表：由此数据，可作出紫外线诱变的致死曲线存在正相关。
当紫外线照射时间为6min时，致死率为96.7％，进一步提高照射时间，则致死率随之上升，当照射10min时，致死率为100％。
一般认为，进行紫外诱变时，致死率为95％左右时突变效果最好。
因此，紫外线诱变的最适剂量为6min。
3. 4 菌株发酵条件的优化3．4．1 培养基初始pH值和装液量对产酶的影响：分析：未得到数据的原因有三点：①操作不当，可能是取液过程中加错体积，也可能是将试管序号弄混了；②将发酵液从摇床取出的过程中有少量溢出，导致浓度降低，影响实验结果；③发酵过程中有杂菌产生，发酵液被污染了。
3．4．2 培养基碳源对产酶的影响：论：三种碳源中最佳碳源是葡萄糖。
3．4．3 标准曲线的制作：A 660明显偏高，可能是稀释淀粉的时候操作不当所致；②在测酶活时，还未等到分光光度计稳定就开始读数，造成测量结果有误差；③由于操作失误，忘记每个试管做平行测量，造成测量结果不精确。
3．4．4 正交试验酶活力的测定试管编号1（对照）7．17．27．37．4A 6600 0.004 0.047 0.019 0.063 酶消耗的淀粉浓度（%） 0 1.999 1.930 1.953 1.975 酶活力（mg /m L ·h ）39.9838.6039.0639.50分析：对正交试验结果进行方差分析，可知最佳培养基配方为A 1B 1C 1，即表2 试验结果分析表1接种量3%、淀粉含量5g/L 、蛋白胨含量5g/L 。
3. 5 淀粉酶的初步提纯正交试验得到酶液分别加入65％饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h ，然后5000r /min 离心20min ，去除上清液，再加水稀释测酶活。
试管编号1（对照）7．1′7．2′7．3′7．4′A 6600 0.015 0.097 0.049 0.033 酶消耗的淀粉浓度（%） 0 1.981 1.849 1.926 1.952 酶活力（mg）39.6236.9838.5239.04分析：实验的目的旨在掌握初步纯化淀粉酶的方法和进一步掌握分光光度法测液化型淀粉酶活力的基本原理和方法。
表3 A 660和表1相比，7．1′、7．2′、7．3′均比表1大，7．4′却比表1小，可能是加水稀释时混合不均匀所致。
4、 讨论本实验的设计方案具有一定的理论依据，如果操作得当，各方面条件满足，会得到产淀粉酶的枯草杆菌高产菌株，及该菌株的最佳摇瓶发酵条件。
但操作过程存在很多缺陷，主要问题有：①分离筛选淀粉酶菌株时，稀释度不够导致水解圈粘连；②在进行pH 值和装液量对产酶影响的实验过程中，取液操作不当，将试管序号都弄混了；③发酵过程中有杂菌产生，发酵液被污染；④制作标准曲线时，由于操作失误，忘记每个试管做平行测量，造成测量结果不精确；⑤在测酶活时，还未等到分光光度计稳定就开始读数，造成测量结果有误差；⑥由于考虑到时间的限制，实验过程中分离时的复筛及突变后的复筛都没做，若要得到精确可靠的实验数据，应该操作完善。
此外，紫外线诱变育种简便易行、对条件和设备要求较低并能较好地提高代谢产物的产量，故在微生物育种中仍广泛应用 。
但实验中发现紫外线诱变存在很大的不确定性，为使诱变效率提高，运用分子生物学技术对菌株进行基因操作和定向改造，会使菌株选育朝着快捷、高效的方向发展。
以上几点可以作为今后该实验改进的几点建议，及操作过程中应注意的问题。