基因工程常用工具酶及应用共42页文档
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29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
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30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
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27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
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28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
基因工程常用的工具酶
2024/10/14
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识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构
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第三节 DNA聚合酶
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DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
❖作用特点
能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催 化核苷酸的聚合
❖作用条件
➢ 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d
HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ
不同限制修饰系统
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三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
5‘ HO 3‘ HO
T4-PNP
5‘ p 3‘ HO
OH 3‘ OH 5‘
Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）
OH 3‘
5‘ HO
BAP / CIP
基因工程-2-工具酶
5‘ (a) 3’ 5‘ 3‘ 5’ 3‘
(a)DNaseI处理双链的DNA 分子
(b)带有3’-OH末端的单链缺口 (c) polⅠ从5‘-P移去一个核 苷酸 (d) polⅠ将32P标记的核苷 酸参入取代被移去的核苷酸 (e)重复(c)(d)的步骤，缺口 沿5’-3‘方向移动，形成32P标记 的核苷酸合成的DNA链
HindⅢ Bacillus amyloliquefaciens H
BamHⅠ
Escherichia coli R质粒
EcoRⅠ
六、限制内切酶的反应体系
DNA 1μ l(1μ g)
buffer(10×)
ddH2O 限制性内切酶 总体积
2μ l
16μ l 1μ l(1u) 20μ l
A）确定酶切DNA的量
100～200 units
up to 20 μl
70℃保温15分钟后冰上冷却，得到第一链cDNA。
4个 6个
44 =256
λDNA 49Kb
46=4096
48 =65536
12位点。 Bgl II 6个；BamH I 5个；Sal I 2个。
三、II型限制性内切酶切割类型
1、平齐末端（Blunt end）
Hind II 切割反应
Sma I 切割反应
2、粘性末端（Sticky end） 2.1 产生5’粘性末端
(b) (c)
3’
5‘ 3’ 5‘
5’
3‘ 5’ 3‘ 5’
(d)
3’
* *** ****
5‘ (e) 3’
3‘ 5’
五、DNA聚合酶的应用
2.制备DNA分子杂交探针(随机引物法)
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
基因工程第二章基因工程的工具酶
TCT----5’
T4 DNA ligase
5’----AAGCTAGA----3’
3’----TTCGATCT----5’
图 Hind III, Xba I 酶切粘端的补平和连接
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3) DNA片段5’端脱磷酸化后连接 基本原理：碱性磷酸酶催化去除DNA的5’磷酸根，防止
（优选）基因工程第二章基 因工程的工具酶
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限制性内切酶作为细 菌体内保护自身、避 免被噬菌体入侵的作 用机制。
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一、限制性内切酶的命名和种 类
1.命名： 生物的属名的第一个字母和 种名的第一、二个字母命名 ，菌株的代号的一个字母， 和罗马数字表示。
基本原理：用 DNA连接酶连接 具有互补粘性末 端DNA片段。
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2.4 具平末端DNA片段之间的连接
基本原理：直接用T4DNA连接酶连接.
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2.5 DNA片段末端修饰后进行连接
1) DNA末端同聚物加尾后进行连接 基本原理：利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的 特殊功能在DNA的末端加尾。
两种同裂酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，能否被原来
的限制酶所识别和切割？
MunI： 5` - C A A T T G - 3`
3` - G T T A A C - 5`
5` - C
A A T T G - 3`
3` - G T T A A
C - 5`
EcoRI： 5` - G A A T T C - 3`
BamHI + BglII A/G GATCT/C
基因工程常用的工具酶
农作物的产量和质量。
医学领域
基因工程被用于治疗遗传性疾 病、癌症、感染性疾病等，以 及制备疫苗和单克隆抗体。
工业领域
基因工程被用于生产高价值的化 学品、生物燃料和生物材料等， 降低生产成本和提高产品质量。
基础研究
基因工程被用于研究基因的结构 和功能、蛋白质的表达和调控等
常见的限制性核酸内切酶包括EcoRI、BamHI、HindIII等。
DNA聚合酶
DNA聚合酶是催化DNA复制过程中 DNA聚合反应的酶。
常见的DNA聚合酶包括Taq酶和T7噬 菌体DNA聚合酶等。
DNA聚合酶具有合成DNA的功能，可以在 模板DNA的指导下，将脱氧单核苷酸逐个加 到引物RNA的3'-OH末端，形成新的互补链 。
，促进生命科学领域的发展。
02 基因工程常用的工具酶概 述
工具酶的定义与分类
定义
工具酶是指用于基因工程操作的一类 酶，能够催化DNA或RNA的切割、连 接、修饰等反应，是基因工程实验中 必不可少的工具。
分类
根据功能的不同，工具酶可以分为限 制性核酸内切酶、DNA聚合酶、反转 录酶、T4核酸连接酶等。
工具酶在生物制药和农业生产中应用广泛，如基因工程的抗体药物、疫
苗、农作物改良等领域，能够提高产品的产量和质量。
工具酶的来源与生产
来源
工具酶主要来源于微生物、植物和动 物等生物体，其中微生物来源的酶是 最常用的。
生产
工具酶的生产通常采用基因工程技术 ，通过克隆和表达酶的基因来获得相 应的酶蛋白，再经过纯化和复性等步 骤得到高活性的工具酶。
VS
转录激活因子
激活特定基因的表达，实现基因治疗。
第三章基因工程的工具酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶作用的特点： （1）要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA； （2）接受模板指导； （3）需要有引物（3’羟基）的存在； （4）不能起始合成新的DNA链； （5）催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端； （6）催化DNA的合成方向是5’—3’。
DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）
33‘’ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’ EcoRⅠ 37 ℃ 5‘ … G-C-T-G-OH
P-A-A-T-T-C-G-A-G …
33’‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 33‘’ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
5’
Klenow
P-A-A-T-T-C-G-A-G … OH-G-C-T-C …
dATP dTTP
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 33’‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子， 通常是Mg2+ 。
缓冲液Tris—HCl的作用在于使反应混合物的 pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围之内 。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.5的条件下 ，其功能最佳。
巯基试剂对于保持某些内切酶的稳定性是有 用的，但它同样也可能有利于潜在污染杂质的 稳定性。
基因工程常用工具酶及应用
DNA 连接酶
36
DNA连接酶
连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手）， 不是氢键（梯子的踏板）。
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三.RNA酶
主要功能 降解RNA 由于RNA酶分布广泛，如唾液、 皮肤分泌物中都含此酶，在涉及RNA 的实验中谨防RNA酶污染。
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四.核酸酶SI
• 降解单链 DNA 或 RNA，形成5’-P的单核苷 酸或寡核苷酸片段
5'粘末端
PstI
3' sticky end
3'粘末端
HpaI
blunt end
平末端
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四.识别位点与切割方式
• 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如
EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。 也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、 或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核 苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。 如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。
某些碱基被甲基化所保护。这种细菌
内部的限制与修饰作用分别由核酸内
切酶和甲基化酶完成，构成了类似免
疫的防御系统。
6
解释 何谓内切酶
-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o红色为外切酶的作用位点， 蓝色为内切酶的作用位点
7
限制性核酸内切酶的分类
目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可 分为三大类。 Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程；
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• 一般说来，在DNA分子中，识别序列短的 出现概率大，识别序列长的出现概率小。 有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。 如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256 （4×4×4×4）个核苷酸就有一次机会出 现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则 需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识 别位点。
基因工程常用工具酶及应用
01
该酶称为Klenow酶。也称为 Klenow 片段（Klenow fragment）。
02
*
3.T4噬菌体DNA聚合酶
来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，具有
5’→3’ DNA聚合酶活性
3’→5’ 外切酶活性
01
02
03
*
4.TaqDNA聚合酶
01
耐热的 DNA聚合酶。最适反应温度75
02
～80oC，主要用于聚合酶链反应。
第二节 其他工具酶
DNA聚合酶 作用: 依据模版,连接游离的单核苷酸,形成与 模版互补的新链。
1
2
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 该酶具有三种酶活性 5’→3’ DNA聚合活性 3’→5’ 外切酶活性 识别切除错配的核苷酸 5’→3’ DNA外切酶活性
DNA聚合酶Ⅰ
5′CCGATA-OH 3′ 3′GGCTATCGGA 5′CCGATAGCCT 3′ 3′GGCTATCGGA 5’→3’ DNA聚合酶活性
切除DNA或RNA的5‘-P 防止DNA自身环化
*
解释
01
何谓内切酶
02
o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-
03
红色为外切酶的作用位点，
04
蓝色为内切酶的作用位点
05
限制性核酸内切酶的分类
目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可分为三大类。
类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程；
特点：识别切割位点比较专一，只有切割作用。无甲基化修饰作用。
02
是由细菌自己产生的一种能识别双链
03
DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。
04
*
基因工程的工具酶
T
T
A
G
C
C
G
怎样切？ • 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）
例：大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
限制酶
限制酶
几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I
Provindencia stuartii 164
Haemophilus influenzae Rd
4363 pBR322物理图谱
练习题
为了绘制长为3.0kb BamH Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ、 EcoR Ⅰ+Hpa Ⅱ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观 察DNA带型。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ识别位点间的 相对位置，以及它们之间的距离（kb）。
现非特异性的DNA片段的现象。 易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I*
造成星活性参数 甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基
亚枫，二价阳离子，12%
限制性内切酶的应用
1、重组DNA前的切割 2、构建新质粒 3、构建物理图谱 4、DNA分子杂交 5、制备DNA探针 6、亚克隆以用作序列分析 7、基因定位，DNA同源性研究。
A. 连接的两条链必须分别具有 3′端自由羟基（-OH）和5 ′端磷酸基团（-P），而且只有这两 个基团彼此相邻时才能进行连接反应；
B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与， 通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。
是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。