反胶团萃取蛋白质研究进展
反胶团萃取技术的研究
表 １ 响 生物 糟 ｝物 质 分配 的 因素 影 生
表面 活性 荆 种类 、浓 度 生 物 活性 物 质 物 质结 构 、 带 电情 况 、 物 质 大小 环境 溶液 ｐ Ｈ值 、离子 种 类 温度 、盐 浓 度
【 考文 献】 参
１反 胶 团 萃 取技 术 ．
等 优 良特 性 并 显 示 了 巨 大 的应 用 潜 力 。
３２技 术 前 景 ．
反 胶 团工 作 原 理 就 是 反 皎 束 的 主 要 功 能 。反 胶 束 （ ｖｒ ｄ ｒ ｅ ｅ ｅ ｓ
温度 是反 胶 团 萃取 技 术 提 取 生 物 活性 物 质 的 一 个 重 要 影 响
反胶 团萃 取 技 术 的研 究
张爽 ．
（ 吉林农 业科技学院 吉林 吉林 １２ ０ ） ３１１
【 摘要 】 反胶团萃取技术 是生物分离技术发展到现代的新型产物 ， 也是当今比较前沿的一种生物活性等物质分离的新技术， 然而由
于 种 种 因素 的限 制 ， 得 反胶 团 萃取技 术 还 没有 走向 工厂 化 ， 是 综述 了 目前 国 内外 的 反胶 团 萃取 技 术的 相 关研 究而 完 成 的 ， 使 本文 希望 能
胶 团 萃取 技 术 能 否 在 未 来 发 展 有 上 良 好 的 趋 势 已 经 成 为 一 个 热
张爽 （９ ５５ ， ， ， １８．－）男 汉 吉林 东辽人 ， 吉林农业科 技学 院学
点 问题 ； 何 萃取 分 子 量 大 的 蛋 白质 、 如 如何 最 大 限 度 的 保 持 蛋 白 生 。
质 分 离 过 程 中 ， 如 说 ： 物 产 品 的 分 离 、 化 、 及 活 性 等 方 面 其 具 有 强 大 的 生命 力 ，反 胶 团萃 取 技 术 在 农 产 品 加 工 ，食 品行 比 生 纯 以 越 来 越 受 到 重视 ， 且 急 切 的要 求 工厂 化 生 产 ， 原 因 是 常 规 的 业 ， 括 功 能 性 食 品 的 深加 工 ， 疗 卫 生 行 业 包 括 医 药 行 业 的迅 并 其 包 医
反胶束萃取技术的应用现状研究
反胶束萃取技术的应用现状研究【标题】反胶束萃取技术的应用现状研究【作者】李艳萍【关键词】反胶束??萃取??应用现状??前景【指导老师】赵小辉【专业】化学【正文】1.引言传统的液--液萃取分离技术成本低,易于运作,已广泛用于多组分物质的分离。
但是,由于缺乏相应的生化溶剂,采用该技术难以分离蛋白质、核酸等生物活性物质;液相色谱技术,特别是制备型色谱技术的应用,使大多数生物分子的批量分离成为可能。
然而由于该技术本身也存在某些局限性,例如一定的固定相,有时会引起目标物的不可逆吸附、甚至变性等现象,在一定程度上限制了其在生化工程中的应用。
近年来,以反胶束溶液为新的溶剂系统的萃取分离技术,可以选择性分离某些生物活性分子,而逐渐引起了人们的重视。
近年来,反胶束萃取技术结合其他一些技术、方法的应用正在研究和开发,显示了良好的应用前景。
该法已成功地用于胞内外酶的萃取及酶蛋白的复性。
如70年代,Ｗells等[1]首次提出反胶束中的酶蛋白仍具有活性,并在一定的pH值和离子强度等条件下,反胶束可提取酶蛋白。
其后,反胶束萃取酶蛋白的研究日新月异,发展迅速。
国内外均有大量的研究报道,如Somnuk等[2]用反胶束萃取鸡蛋中的溶菌酶,Zhang等[3]用十六烷基二甲基溴化铵?(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)反胶束提取酵母乙醇脱氢酶等。
近年来,此项技术又有了诸多的新进展,如设计新表面活性剂和添加亲和性配基、反胶团乳化液膜萃取、用反离子表面活性剂反萃取胶团中酶蛋白及设计新的萃取设备等,解决了传统方法所遇到的酶失活、萃取选择性差等问题,从而大大促进其工业应用的发展。
反胶束萃取技术之所以日益受到了广泛的重视,是因其具有甚多突出优点:①有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性;②分离、浓缩可以同时进行,过程简单;③条件温和不会引起酶蛋白的变性,并能解决酶蛋白(如细胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题;④由于构成反胶束的表面活性剂往往具有细胞破壁功效,因而可直接从完整细胞中提取有活性的酶蛋白;⑤反胶束萃取技术的成本低,溶剂和表面活性剂可反复使用。
下游技术 第八章 反胶团萃取
（3）离子强度
离子强度对蛋白质萃取的影响主要体现 在两个方面 :
离子强度增大后使蛋白质与反胶团内表面的 静电引力减弱 ,从而减小了萃取率 ; 离子强度增大后减弱了表面活性剂极性头之 间的排斥 ,使反胶团变小 ,因而蛋白质难以 进入其中。
（4）温度
温度是影响蛋白质萃取率的一个重要因 素。一般来说 ,温度的增加将使反胶团 的含水量下降 ,因而不利于蛋白质的萃 取。通过提高温度可以实现蛋白质的反 萃取。
从复杂混合体系中分离蛋白质
在实际应用中往往遇到的是复杂的混合体系 , 例如 : 其中既含多种蛋白质,又含有发酵底物、 细胞碎片、细胞组织或血液成分 , 从中分离 某种蛋白质是很困难的。不少研究者对此进行 了尝试,取得了一定的进展。 例如,用ＡＯＴ / 异辛烷体系, 从细菌发酵液 中提取了 2 种脂肪酶 ; 从大豆和向日葵中分 离了蛋白质、油脂和多酚。 利用表面活性剂可以破坏细胞壁的特点,用反 胶团体系直接提取了胞内酶。
第八章
反胶团萃取
一、概述
蛋白质类是生物技术中的重要产物 , 但是大多 数蛋白质不溶于有机溶剂 , 而且与有机溶剂接 触后会引起蛋白质的变性和失活 , 因此不能直 接应用有机溶剂液 - 液萃取过程。 近年来 , 利用表面活性剂在有机溶剂中形成一 种反向胶团 ( 简称反胶团 reversed micelles) 对 蛋白质进行萃取的技术得到了快速的发展和应 用 , 这也是表面活性剂在生物工程中成功应用 的一个范例。
反胶团的形成
2. 反胶团的制备 1）注入法：将蛋白质水溶液直接注入到含
有表面活性剂的有机溶剂中，搅拌，形
成透明的溶液 2）相转移法：将蛋白质水相与含表面活性 剂的有机相接触 3）溶解法：将含反胶团的有机相与蛋白质
蛋白质反胶束萃取
• 离子强度
离子强度过小时，表面活性剂与溶剂相无法形成反 胶束，而形成了稳定的乳液，使其无法用于蛋白质 萃取。 离子强度增大时，它会： 1. 使反胶束内的双电层变薄，减弱蛋白质与反胶束内 表面间的静电引力，从而减小蛋白质溶解度。 2. 减弱表面活性剂之间的斥力，使胶束变小，不利于 蛋白质的溶解进入。 3. 增大了离子向反胶束内的迁移，并取代蛋白质，使 蛋白质从反胶束中析出。
蛋白质的反胶束萃取
Outline
蛋白质概述
蛋白质的常见分离方法
蛋白质反胶束萃取的原理 蛋白质反胶束萃取的应用举例 蛋白质的选择性萃取
蛋白质
化学分析试剂
化工用催化剂 …… 蛋白质
蛋白质分离上的常见问题
1 2 3 4 对温度、溶剂等敏感，易变性失活 原料中目标蛋白成分浓度小 杂质含量高，成分复杂 种类繁多，批量的特异性分离比较困难
有机相 萃取，实质上是蛋白质在 水相和反胶束内微水相间 的分配过程
水相
反胶束萃取的驱动力
静电相互作用 空间相互作用 疏水性相互作用
• 表面活性剂种类和浓度
影响反胶束萃取的因素
表面活性剂的种类： 1. 阳离子表面活性剂对表富集负电荷的蛋白质有较大分配比。 2. 阴离子表面活性剂对表富集正电荷的蛋白质有较大分配比。 表面活性剂的浓度： 1. 表面活性剂浓度增大，有利于形成更多的反胶束，可以加 速蛋白质的萃取。 2. 通过调节水率 w0，即胶束内水和表面活性剂的比，可调 节反胶束的大小。反胶束体积越大，其对大分子蛋白质的 分配比越大。
水相
反胶束分离蛋白质举例
选择性反胶束萃取
向反胶束体系加入亲和配体后，可显著增强反胶束萃 取的选择性。 如对与刀豆球蛋白A的萃取，通过向反胶束中添加生 物表面活性剂octyl β-D-glycopyran（表面活性剂总量 的2-20%），作为参比的核糖核苷酸酶不受影响，而 刀豆球蛋白A与配体发生作用使其萃取效率显著提高。 对于抗生物素蛋白的反胶束萃取，同样可以通过加入 一些亲和配体，如带生物素标记的表面活性剂，使得 抗生物素蛋白更容易地进入胶束。 ……
反胶束体系在蛋白质萃取中应用的研究进展
4 反胶束体系萃取蛋白质的影响因素
蛋白质在反胶束中的增溶作用 。与蛋白质的表 面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用 、蛋白质 的疏水性以及反胶束的大小等因素有关 。任何对这 些性能产生影响的因素都将对蛋白萃取产生影响 。
411 体系组成
用于蛋白质分离的反胶束体系 可以 是离 子型 的 ,也 可 以 是 非 离 子 型 的 。其 中 研 究 最 多 的 是 以 AOT为代表的阴离子微乳体系 ,主要是因为 AOT形成 反胶束时不需加助表面活性剂 。但由于它不能萃取分 子量较大的蛋白质 ,其应用受到一定的限制 ,需进行改 性或加入某些表面活性剂进行复配 。如加入具有亲和 作用的生物表面活性剂 (磷脂等 )来改善萃取性能 。
312 纯化
D ekker[18 ]等用 TOMAC /异辛烷 +非离子型表面 活性剂反胶束体系 , 使 α- 淀粉酶的浓度提高了 l7 倍 ,收率达 85 % ;王金枝 [19 ]等用十六烷基三甲基溴化 铵 ( CTAB ) /正己醇 /正辛烷反胶束体系纯化胰蛋白
酶 ,商业用酶的纯化倍数最高为 1197 倍 ,粗酶为 7115 倍 ,且粗酶纯化后比活在 200U /m g以上 。
另外 ,许多反胶束萃取的实验研究表明 ,随着表征 水池大小的参数 w0 (反胶束中水与表面活性剂摩尔浓 度之比 )的降低 ,蛋白质的萃取率也减少 ,这充分说明了 位阻效应的存在。目前常用的阴离子表面活性剂 AOT 形成的反胶束 ,由于其胶束尺寸不够大 ,直接用于相对 分子质量较大的蛋白质的萃取时 ,萃取率不高 [15] 。
反胶束萃取分离生物分子及相关领域的研究进展
反胶束萃取分离生物分子及相关领域的研究进展段金友 方积年3(中国科学院上海药物研究所,上海200031)摘 要 综述了反胶束有关的概念、理论;反胶束萃取蛋白质的传质机制、选择性分离过程及工艺流程;反胶束对氨基酸、抗生素及核酸的萃取分离;反胶束与其他方法、技术相结合的应用状况。
关键词 反胶束,萃取,分离,评述 2001202223收稿;2001206211接受1 引 言传统的液2液萃取分离技术成本低,易于运作,已广泛用于多组分物质的分离。
但是,由于缺乏相应的生化溶剂,采用该技术难以分离蛋白质、核酸等大分子生物活性物质;液相色谱技术,特别是制备型色谱技术的应用,使大多数生物分子的批量分离成为可能,然而由于该技术本身也存在某些局限性,例如一定的固定相,有时会引起目标物的不可逆吸附、甚至变性等现象,在一定程度上限制了其在生化工程中的应用。
近年来,以反胶束溶液为新的溶剂系统的萃取分离技术,可以选择性分离某些生物活性分子,而逐渐引起了人们的重视。
1977年Luisi 等1首先发现胰凝乳蛋白酶可以溶解于含双亲物质(表面活性剂)的有机溶剂中,超离心数据显示有机相中有反胶束的存在,同时,光谱分析(紫外2可见光谱、荧光光谱、旋光光谱)表明这一过程未引起酶的变性;1979年Luisi 等2考察了蛋白质溶液的pH 值、蛋白质和双亲物质的浓度对蛋白质萃取率的影响及蛋白质在反胶束溶液中的光谱特性;1979年Menger 和Y amada 3对反胶束溶液中酶的性质进行了研究。
随后的20多年里,反胶束萃取技术已广泛应用于蛋白质的分离和纯化,并逐渐延伸至其他生物分子(氨基酸、抗生素、核酸)的分离研究;近年来,该技术结合其他一些技术、方法的应用正在研究和开发,显示了良好的应用前景。
2 反胶束的定义、形成条件、特征和研究方法反胶束(reversed micelle )是双亲物质在非极性有机溶剂中自发聚集体,又称为反胶团、逆胶束(inverse micelle )4,5。
反胶团萃取分离技术综述Microsoft Word 文档
反胶团萃取分离技术综述Microsoft Word 文档反胶团萃取分离技术综述物理系 sc13002015 刘俊涛摘要:简要介绍了反胶团萃取技术理论研究及反胶团萃取体系开发工作，重点综述了反胶团萃取技术在蛋白质、日化和药物等分离分析中的应用研究进展。
提出了反胶团萃取技术目前存在的问题、发展方向和应用前景等。
关键词:反胶团;萃取;分离传统的分离方法，如液-液萃取技术，具有操作连续、多级分离、放大容易和便于控制等优点，在化学、化工、石化等领域得到广泛应用。
但很难用于具有某些特殊性质的生化产品(如蛋白质、氨基酸等)的提取与分离，原因在于这类物质多数不溶于非极性有机溶剂，或与有机溶剂接触后会引起变性和失活。
20世纪80年代中期发展起来的反胶团萃取技术解决了这一难题。
所谓反胶团，是指当油相中表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度后，其分子在非极性溶剂中自发形成的亲水基向内、疏水基向外的具有极性内核(polar core)的多分子聚集体(aggregates)。
反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质，而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质，即所谓二次加溶原理。
例如，反胶团的极性内核在溶解了水后，在内核中形成“水池”(water poo1)，可以进一步溶解蛋白质、核酸和氨基酸等生物活性物质。
胶团的屏蔽作用，使这些生物物质不与有机溶剂直接接触，而水池的微环境又保护了生物物质的活性，从而达到了溶解和分离生物物质的目的。
这种技术既利用了溶剂萃取的优点，又实现了生物物质的有效分离，作为一种新型的生物分离技术应用于蛋白质、氨基酸及药物、农药等物质的分离分析中，显示了巨大的应用潜力。
1 反胶团及其萃取原理反胶团是表面活性剂溶解在有机溶剂中形成的纳米级聚集体，是一种透明、稳定的热力学体系。
反胶团中表面活性剂非极性头向外与有机溶剂接触，极性头向内形成极性核，极性核溶入水后形成微“水池”。
反胶团的一个重要参数是它的含水量(“水池” 中溶入的水与表面活性剂的摩尔比，W)，它决定反胶团的0[1]尺寸。
反胶团萃取蛋白质技术的反萃过程研究进展
Ｈ （ ｐ Ｈ＝ １ ２ ） 和离子强度（ ２ ． ５ ｍ ｏ ｌ ／ ＬＫ Ｃ ｌ ） 很 单纯升高 ｐ 难实现反萃， 而向反萃水相中添加 １ ５ ％ 的异丙醇后可 以很好地实现反萃， １ ０ ｍ ｉ ｎ即达到反萃平衡， 反萃率和
摘要 反胶团萃取分离技术是一种新型的生物产品分离技术。简要介绍了反胶团萃取蛋白质技 术的反萃过程的动力学， 重点综述了在提高蛋白质反萃效率方面的研究进展， 并对目前存在的问 题、 发展方向等进行了评述。 关键词 反胶团 蛋白质 分离 反萃
中图分类号 Ｔ Ｑ ４ ２ ３ 目前所采用的蛋白质分离纯化方法主要有盐析沉 淀、 凝胶过滤层析、 离子交换层析、 疏水作用层析、 亲和 层析和电泳等， 这些方法存在的共同问题是连续操作 ０年 和规模放大都比较困难。反胶团萃取是上世纪 ８ 代出现的一种新的生物产品分离技术， 具有选择性高、 正萃与反萃可同时进行、 分离与浓缩同步进行、 操作简 单易于放大等优点， 并能有效防止生物分子失活变性， 特别适宜于蛋白质的浓缩、 分离与纯化。这一领域的 研究一直相当活跃， 目前已经有伴刀豆蛋白、 细胞色素 ｃ 、 胰凝乳蛋白酶、 溶菌酶、 牛血清蛋白、 胃蛋白酶等多 种蛋白质的反胶团萃取分离见于文献报道。 反胶团是表面活性剂溶于有机溶剂中形成的纳米 级聚集体， 是一种透明、 稳定的热力学体系。反胶团中 表面活性剂非极性尾基向外与有机溶剂接触， 极性头 基向内形成极性核， 极性核溶入水后形成微“ 水池” ， 当 反胶团相与含蛋白质的水相接触时， 蛋白质在表面活 性剂和蛋白质所带电荷间的静电相互作用以及疏水作 用等作用力下进入微“ 水池” 中， 使蛋白质避免和有机 溶剂接触， 不致失活。 反胶团萃取蛋白质技术包含两个过程： 一个过程是 蛋白质从水相转移到反胶团中（ 正萃取过程） ， 第二个过 程是目标蛋白质从反胶团相转移到一个新的水相（ 反萃 取过程） ， 从而实现蛋白质的分离与纯化。要连续地实现 蛋白质的分离、 浓缩与纯化， 将这一技术发展到工业过
反胶团法提取葡萄籽蛋白质的工艺研究
反胶团法提取葡萄籽蛋白质的工艺研究黄晓辉;茹晶晶;罗五魁;郭彩云【摘要】以葡萄籽为原料,利用反胶团法提取葡萄籽蛋白质,探讨提取水相的pH、KCl离子浓度、原料量、提取时间对葡萄籽蛋白萃取率的影响.通过正交实验表明最佳工艺条件为:KCl浓度0.07 mol/L、pH为6.00、萃取时间为50 min、原料加入量为0.4000 g,此条件下葡萄籽蛋白质萃取率为68.32％.【期刊名称】《哈尔滨师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2015(031)005【总页数】3页(P82-84)【关键词】葡萄籽;蛋白质;反胶团法【作者】黄晓辉;茹晶晶;罗五魁;郭彩云【作者单位】宁德师范学院;宁德师范学院;宁德师范学院;宁德师范学院【正文语种】中文【中图分类】O629.730 引言据统计，我国年产葡萄约100万吨，其中80%的葡萄用于酿酒.在酿酒的同时将产生大量的葡萄籽［1］，葡萄籽中含有大量的脂肪、蛋白质、碳水化合物及其他营养保健物质［2］.目前对葡萄籽蛋白质的提取利用报道极少［3］.传统的蛋白质分离方法，有等电点沉淀和pH调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法等方法.但这些方法很难用于具有某些特殊性质的生化产品的提取与分离，原因在于这类物质多数不溶于非极性有机溶剂［4－6］.20世纪80年代发展起来的反胶团萃取技术解决了这难题，反胶团法萃取蛋白质的优点主要是萃取率高并具有选择性;过程简单;能解决蛋白质在非细胞环境中迅速失活的问题;溶剂可反复使用、成本低廉［7］.该课题拟用十六烷基三甲基溴化铵(CATB)/异辛烷/正丁醇反胶团体系萃取葡萄籽蛋白质，并探讨了反胶团葡萄籽蛋白的萃取工艺条件，为进一步开发葡萄籽植物蛋白新资源提供实验依据.1 材料与试剂十六烷基三甲基溴化铵(CATB)、异辛烷、正辛醇、氯化钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、乙醇、磷酸85%、牛血清蛋白标准品、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红指示剂、氢氧化钠、95%乙醇(以上均为分析纯天津市福辰化学试剂厂)，VIS－7220型分光光度计(北京瑞丽分析仪器公司)，DHG－9001A型电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，pHS－25W数显pH计(上海雷磁创益仪表有限公司)，电子天平 AR124CN(奥豪斯仪器(上海)有限公司)，KQ－250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司).2 实验内容2.1 测定葡萄籽中总蛋白质含量用凯氏定氮法［8］测定葡萄籽中总蛋白质含量.2.2 反胶团法萃取葡萄籽中的蛋白质称取适量CATB将其置于250 mL锥形瓶中，加入一定体积的异辛烷与正辛醇(体积比为4∶1)的混合溶剂、一定浓度KCl和一定pH的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液［8］.向上述反胶团溶液中加入一定量葡萄籽粉(精确到0.0001 g)将锥形瓶置于超声波清洗器超声一段时间，超声波清洗后所得混合物倒入离心管中进行离心分离出去残渣［9］，所得清液用考马斯亮蓝G－250法测定溶液中的蛋白质含量.3 结果与分析3.1 考马斯亮蓝标准曲线［10］按文献［10］方法测定考马斯亮蓝标准曲线，曲线的线性方程为y=0.0006x+0.0192，其中x为蛋白质质量浓度，y为吸光度，R2=0.9924，说明该曲线符合线性相关，且线性关系良好.3.2 单因素试验3.2.1 pH对蛋白质萃取率的影响按照2.2步骤，分别调节水相不同的pH，计算不同pH下的葡萄籽蛋白质萃取率，结果如图1所示:图1 pH对蛋白质提取率的影响由图1可以看出，pH在3～6之间，蛋白质的萃取率随着pH的升高而升高.而pH在7～9之间，蛋白质萃取率随着pH的升高而降低.所以选取pH为6.00.3.2.2 KCl浓度对蛋白质萃取率的影响按照2.2步骤调节水相pH为6.00，调节不同KCl的浓度;计算在不同KCl盐浓度下的葡萄籽蛋白质萃取率;结果如图2所示.图2 KCl浓度对蛋白质萃取率的影响由图2可以看出，在KCl浓度范围为0.02～0.06 mol/L时，葡萄籽蛋白质萃取率随着KCl浓度的升高而升高.当 KCl浓度范围为0.06～0.18 mol/L时，葡萄籽蛋白质萃取率随着KCl浓度的升高反而降低.当 KCl浓度为0.06 mol/L时葡萄籽蛋白质的萃取率达到最高.3.2.3 葡萄籽加入量对蛋白质萃取率的影响按照2.2步骤加入不同的葡萄籽原料量，计算各原料量下的葡萄籽蛋白质萃取率;葡萄籽原料量从0.6000 g增加到1.4000 g，葡萄籽蛋白质萃取率随着原料量的增加而减少.综合考虑有效利用反胶团溶液，所以选取加入原料量为0.6000 g.3.2.4 萃取时间对蛋白质萃取率的影响按照2.2步骤在不同的时间萃取;计算各萃取时间下的萃取率;当时间为20～60 min，随着时间的增加蛋白质萃取率也在提高，60 min以后蛋白质萃取率的变化变为平缓.综合考虑选取萃取时间为60 min.3.3 正交试验结果3.3.1 因素水平的选取根据单因素试验结果，选取4个因素做正交试验，见表1.表1 正交试验因素水平A pH B离子强度/mol·L －1 C葡萄籽量/g D萃取时间/min 1 5.00 0.03 0.4 50 2 6.00 0.05 0.6 60 3 7.00 0.07 0.8 70在进行反胶团法萃取葡萄籽蛋白质的单因素分析的基础上，进行了L9(34)正交实验，对最佳提取工艺参数进行探讨，正交实验见表2.表2 正交试验结果实验号 A B C D 萃取率/%1 1 1 1 1 50.47 2 1 2 2 2 40.32 3 1 3 3 3 39.77 4 2 1 2 3 68.32 5 2 2 3 1 58.79 6 2 3 1 2 69.33 7 3 1 3 2 65.72 8 3 2 1 3 31.29 9 3 3 2 1 35.45 K1 130.56 184.51 151.09 144.71 K2 196.44 130.40 144.09 175.37 K3 132.46 144.55 164.28 139.38 k1 43.52 61.50 50.36 48.23 k2 65.48 43.46 48.03 58.45 k3 44.15 48.18 54.76 46.46 R 21.96 18.03 6.73 11.99对上述正交试验结果进行分析，影响蛋白质萃取率的各因素主次关系是:pH＞离子强度＞萃取时间＞原料量;最佳萃取条件为:离子强度0.07 mol/L，pH 为 6.00，温度为50℃时，原料量为0.4000 g.在最佳工艺条件下，萃取率可达68.32%.4 结论通过单因素实验，发现葡萄籽蛋白质萃取受离子强度、萃取时间、pH、原料量的影响突出.通过正交实验可得:最优的工艺参数为:离子强度0.07 mol/L，pH 为6.00，温度为50 ℃时，原料量为0.4000 g，萃取率可达到 68.32%.这说明以CTAB/异辛烷/正辛醇反胶团体系萃取葡萄籽蛋白质可行的.参考文献［1］吉宏武.葡萄酒厂下脚料的综合开发利用途径［J］.食品研究与开发，2000(1):29－31.［2］周建华.葡萄籽中提取油和蛋白质的研究［J］.粮食与饲料工业，2000(10):48－49.［3］何秀珍，张慧祥，罗玉洁，等.山葡萄籽蛋白的提取和分析［J］.食品科学，1989(8):20–21.［4］李殿宝.从葵花脱脂粕中提取分离蛋白质工艺的研究［J］.辽宁师专学报:自然科学版，2005(1):13–15.［5］李凤英，权英.碱溶法提取葡萄籽中蛋白质的工艺［J］.河北职业技术师范学院学报，2003(3):5－6.［6］沈忠耀.表面活性剂在生物工程中的应用之一反胶团萃取［J］.日用化学工业，2001(1):24–27.［7］徐宝财，王媛.反胶团萃取分离技术研究进展［J］.日用化学工业，2004，34(6):390–393.［8］王家政，范明.蛋白质技术手册［M］.北京:科学出版社，2003.193–194. ［9］李润霞，陈复生，赵俊廷.CAB/正庚烷/正己醇反胶束体系前萃大豆蛋白的研究［J］.食品研究与开发，2007，28(7):8－11.［10］杭州大学化学系分析化学教研室.分析化学手册:第二分册［M］.北京:化学工业出版社，1982.45–48.。
反胶团萃取
反胶团萃取1．研究背景传统的分离方法，如液-液萃取技术，具有操作连续、多级分离、放大容易和便于控制等优点，在化学、化工、石化等领域得到广泛应用。
但很难用于具有某些特殊性质的生化产品(如蛋白质、氨基酸等)的提取与分离，原因在于这类物质多数不溶于非极性有机溶剂，或与有机溶剂接触后会引起变性和失活。
20世纪80年代中期发展起来的反胶团萃取技术解决了这一难题。
所谓反胶团，是指当油相中表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度后，其分子在非极性溶剂中自发形成的亲水基向内、疏水基向外的具有极性内核(polar core)的多分子聚集体(aggregates)。
反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质，而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质，即所谓二次加溶原理。
例如，反胶团的极性内核在溶解了水后，在内核中形成“水池”(water poo1)，可以进一步溶解蛋白质、核酸和氨基酸等生物活性物质。
胶团的屏蔽作用，使这些生物物质不与有机溶剂直接接触，而水池的微环境又保护了生物物质的活性，从而达到了溶解和分离生物物质的目的。
这种技术既利用了溶剂萃取的优点，又实现了生物物质的有效分离，作为一种新型的生物分离技术应用于蛋白质、氨基酸及药物、农药等物质的分离分析中，显示了巨大的应用潜力。
[1]2．文献综述2.1反胶团的形成[2]正向胶团(normal micelle)是表面活性剂分子在极性溶剂，如水中形成的一种亲水基团(头)朝外，而疏水基团(尾)朝内的具有非极性内核的多分子聚集体。
洗涤剂中的表面活性剂分子在水中形成的就是这种胶团，其非极性内棱可以溶解各种油污。
从而达到去污的效果。
与此相反，表面活性剂在非极性溶剂如某些有机溶剂中就会形成亲水头向内和疏水尾向外的具有极性内核(polar core)的多分子聚集体(aggregates)，由于其表面活性剂的排列方向与一般的正向胶团相反，因此，称为反胶团。
示意图如图（2－1）。
图2－1 表面活性荆分子在非极性溶荆中形成的反胶目反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质，而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质，即所谓二次加溶原理。
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四、反胶团萃取蛋白质的发展方向
反胶团萃取具有普通溶剂萃取易于放大和 实现连续操作等优点,其开发利用前景是不言 而喻的。目前,反胶团萃取技术在理论和应用 方面都取得了一定的进展,但仍有许多问题尚 待解决。主要包括以下三点： （1）反胶团的微结构与蛋白质萃取的选择 性之间的规律、蛋白质与表面活性剂的相互作 用、萃取机理等尚需进一步的探讨。普通离子 型表面活性剂对产品有一定的污染,易造成蛋 白的变性,且表面活性剂合成费用高。因此开 发无毒、生物相容性、廉价高效的生物表面活 性剂是未来发展的趋势。
5.
亲和胶团体系的研究应用
亲和反胶团萃取是指在反胶团相中除通常的 表面活性剂以外添加另一种亲水头部为目标分子 的亲和配基的助表面活性剂,通过亲和配与目标 分子的亲和结合作用,促进目标产物在反胶团相 的分配,提高目标物的分配系数和反胶团萃取分 离的选择性。采用这种体系,可使蛋白质萃取率 和选择性大大提高,并可使操作范围(如pH、离子 强度)变宽。这些优点使亲和反胶团体系已成为 目前研究的一个热点。
反胶团结构大小的一个重要参数是其含水率 (W0 ) ,即“水池”中溶入的水与表面活性剂的摩 尔比。在通常的离子型表面活性剂形成的反胶团 中,W0 < 10时,水分子被束缚在反胶团的壁上,它 的凝固点下降、共价键参数改变、氢键破坏;只有 W0 较大时,才存在自由水。含反胶团的有机溶剂 与蛋白质水溶液接触时,反胶团依靠静电相互作用 或疏水相互作用使蛋白质进入“水池”中,水和表 面活性剂分子在蛋白质周围形成一个保护层,避免 蛋白质和有机溶剂接触导致的失活。
（2）为了提高萃取率和选择性,将亲和助表面活性 剂引入反胶团萃取是非常必要的。因此,对非离子型或 弱离子型亲和反胶团萃取进行系统的理论和应用研究, 对于该技术在不久的将来,广泛应用于生物产物的分离 和提纯具有重要意义。 （3）是反胶团萃取蛋白质的热力学、动力学规律有 待进一步研究深化,找出和各种因素的关联式对蛋白质 萃取有着重要意义。四是现有的可用于反胶团萃取的 设备还存在着操作容量小,体系易乳化,易出现轴向返 混等问题, 特别是各种分塔萃取设备的研究刚刚起步。 因此,急待开发新型高效反胶团萃取设备以促进反胶团 萃取技术的实用化。
3.反胶团在纳米材料中的应用 反胶团体系中形成的纳米级微“水池”,为 纳米材料的制备提供一个反应空间,在反胶团 的极性内核中进行粒子合成,可以控制粒子的 聚集和长大,制得纳米级的超细微粒。反胶团 法制备纳米材料的应用范围很广,目前利用反 胶团微乳反应器已经合成出许多材质的纳米 微粒,如Fe、Ag、Cu、Ni、Pt等金属, FeNi、 FeCu、Fezn、Cdse等合金; FeB、N IB、 PbTiO3 、BaTiO3 、SrTiO3 、BaWO4 等 复合氧化物; Al (OH ) 3 、Zr (OH) 4等氢 氧化物。
2.
反胶团在超临界CO2 萃取中的应用
反胶团萃取本质上仍属于溶剂萃取,后处理消耗大、 溶剂损耗多、对环境也有一定的污染。而将反胶团应 用于超临界CO2 萃取中,不但可以避免反胶团萃取过 程中存在的后处理问题,还可以克服超临界CO2 不能 溶解相对分子质量较大的强极性或离子型化合物的问 题,为分离、反应、微粒化等领域提供了新途径。 Hutton等[ 16 ]用乙醇或戊醇作为助表面活性剂, 使AOT成功溶于超临界CO2 形成反胶团乳液,该乳液 可以萃取甲基橙。用戊醇作助表面活性剂,水/AOT/超 临界CO2 反胶团乳液在175 ×105 Pa、40℃可以萃 取核黄素。超临界CO2 反胶团体系也可以用作纳米材 料的微反应器及各种化学反应的反应器。
二、反胶团萃取蛋白质的主要影响因素
1.表面活性剂的种类和组成 在反胶团萃取过程中,通常希望所选择的表 面活性剂能形成体积较大的反胶团,以利于 萃取分子量大的蛋白质,且蛋白质与反胶团 间的相作用不应太强,以减少蛋白质的失活。 2.离子强度 增大离子强度将减弱与反胶团内表面间的 静电引力,使蛋白质的溶解度减小。
通常用于形成反胶团系统的表面活性剂主 要有阴离子型、阳离子型和非离子型三种,最 常用的是阴离子型表面活性剂二(2-乙基己基) 琥珀酸酯磺酸钠(AOT) ,它在异辛烷中形成反 胶团时不需助表面活性剂,而且含水率较大,可 达50～60,适用于小分子蛋白质的萃取(分子 量< 30kDa) ,但不能萃取分子较大的蛋白质, 并且往往在两相界面上形成不溶性凝胶状物质。
三、反胶团萃取蛋白质的研究进展
1.
反胶团在蛋白复性中的应用 反胶团复性法是目前国内外最为新颖的蛋白质复 性方法之一,可见报道有限。利用新型的反胶团—色 素亲和反胶团辅助溶菌酶复性,色素亲和反胶团是一 种修饰了亲和配基的非离子型反胶团,是由亲和配 基—活性色素辛巴蓝(CB ) 、非离子型表面活性剂— 失水山梨醇三油酸酯( Span 85) 、有机溶剂正己烷 ( n- hexane)等在一定条件下反应得到的。实现了 较高浓度( 3～315mg/mL )溶菌酶的完全复性,体现 出反胶团法较直接稀释法的巨大优势,以及非离子型 亲和反胶团较单纯非离子型反胶团在复性效果方面的 较大优势,同时保证95%以上的溶菌酶能够被 015mol /LMgCl2 溶液反萃回收,且圆二色光谱分析 证明了最终所得溶菌酶二级结构的正确性,体现出非 离子型亲和反胶团较离子型反胶团在蛋白质回收方面 的较大优势。
4.反胶团在酶膜反应器中的应用 利用反胶团的酶膜反应器,能够实现产物的 浓缩、分离,且不用补充助表面活性剂和水,这是 一种被认为是最有应用前途的分离方法。应用 酶膜反应器,能够水解橄榄油、卵磷脂、合成酯、 多肽,生产L -色氨酸,降解农药。反胶团的酶膜 反应器有望实现连续生产。但是,反胶团界面的 复杂性,表面活性剂的自聚性等都成为制约其发 展的因素。
3.反胶团的含水率(W0 ) 反胶团的大小依赖W0 ,随W0 的增大,反胶 团尺寸变大。 4.助表面活性剂 助表面活性剂能提高生物催化反应的活性 和稳定性。助表面活性剂的化学结构能增 大或减小微乳液的液滴尺寸。
5.
水相的pH 在离子强度一定时,当pH大于蛋白质的 等电点时,蛋白质表面带负电荷,反胶团内表 面的净电荷为负,这样就因异性电荷相吸而 使蛋白质由水相转入到反胶团相。 6. 温度 当温度升高到一定时,反应活性达到最大。 同时,较高温度和高液滴浓度导致渗透,从而 引起电导性和双交联结构的形成。
反胶团萃取蛋白质研究进展
钟永刚 s0910057
一、反胶团萃取蛋白质的特点和基本原理 二、反胶团萃取蛋白质的主要影响因素
三、反胶团萃取蛋白质的研究进展 四、反胶团萃取蛋白质的发展方向
一、反胶团萃取蛋白质的特点和基本 原理
反胶团是表面活性剂分子在非极性溶剂中自发 形成的聚集体。其中,表面活性剂分子的亲水基向 内、非极性的疏水基朝外,形成球状的极性核,核内 溶解一定数量的水后,形成了宏观上透明均一的热 力学稳定的微乳状液,微观上恰似纳米级大小的微 型“水池”。这些“水池”可溶解某些蛋白质,使其与 周围的有机溶剂隔离,从而避免蛋白质的失活。通 过改变操作条件,又可使溶解于“水池”中的蛋白质 转移到水相中,这样就实现了不同性质蛋白质间的 分离或浓缩。