李斯特菌检验
李斯特菌检验及快检技术
李斯特菌检验及快检技术一、引言1.对李斯特菌的介绍2.李斯特菌的危害性3.检测技术的重要性二、李斯特菌检验技术的基本原理1.传统的检测方法2.分子生物学的检测方法三、李斯特菌快检技术的基本原理1.免疫学快检技术2.核酸检测快检技术四、李斯特菌检验技术的应用1.食品中李斯特菌的检测2.体外环境中李斯特菌的检测五、结论1.总结李斯特菌检测技术的优缺点2.展望李斯特菌检测技术未来的发展方向附注：写论文除了需要提纲，还需要深入调研、资料整理、论文撰写等工作。
如需帮助，欢迎发起新的任务。
第一章：引言李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的革兰氏杆菌，是一种人畜共患病菌，能够引起严重的人类食源性感染（Listeriosis）。
该菌可以从土壤、水、粪便中分离出来，同时也可以从生食或未经充分加热的食物中分离出来，因此是食品安全领域中的一个相关热点。
根据世界卫生组织的数据，每年全球有超过2000万人感染李斯特菌，其中约70%的患者死亡，还有很多人因为骨髓炎、中枢神经系统炎症等病症而面临长期的治疗和严重的健康风险。
因此，对李斯特菌的检测技术具有极大的现实意义。
第二章：李斯特菌检验技术的基本原理李斯特菌的检测技术可分为传统的检测方法和现代的分子生物学检测方法两种。
1.传统的检测方法传统的李斯特菌检测方法包括了传统的培养法、浸泡法、热激法、膜过滤法、小样品快速检测等。
其中，传统培养法是最常用的方法之一，通过在特定富营养液中定期供气供养菌株，使其持续繁殖，从而可以在培养皿上观察到典型的李斯特菌菌落。
但是，传统的培养法需要数日至数周才能获得结果，无法满足急速检测的要求，此外，还有可能会因为培养条件不当而遗漏不易培养的物种，或者因污染而致假阳性结果。
2.分子生物学的检测方法分子生物学检测法包括了PCR技术、荧光原位杂交技术（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）、核酸芯片技术、蓝色荧光蛋白标记技术（Green Fluorescent Protein, GFP）和基于质谱技术的全扫描方法等。
李斯特氏菌检验
对小鼠的致病力试验： 取0.5ml的1010cfu/ml的浓缩菌液注射小 白鼠腹腔3-5只，致病株于3-5日内死亡。单 核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌 对小鼠有致病性。
研究表明，只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特 氏菌症（listeriosis）相关。
概述
单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后 主要表现为败血症、脑膜炎和流产等。易感人群主要为孕妇、 老人、新生儿和免疫缺陷人群。大多数发达国家人类李斯特 菌病发生率约为每一百万人2-15例，死亡率为13%-34%。
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鉴定-溶血试验
将羊血琼脂平板底面划分小格，从TSA-YE 上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺种一 个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特菌 和绵羊利斯特菌)和阴性对照菌(英诺克李斯 特菌)，于35℃培养24h-48h，穿刺时尽量接 近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂 破裂。 于明亮处观察，单增和斯氏在刺种 点周围产生狭小的透明溶血环，无害无溶 血环，伊氏产生大的透明溶血环。
种的生化特征见下表：
溶血 反应 硝酸 盐 还原 尿素 酶 甘露 醇 菌 种 MR/VP 鼠李糖 木糖
单核细胞增生李斯
特氏菌 绵羊李斯特氏菌 英诺克李斯特氏菌 威尔斯李斯特氏菌 西尔李斯特氏菌 格氏李斯特氏菌 默尔李斯特氏菌
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李斯特菌形态复杂性类群分离鉴定观象思
李斯特菌形态复杂性类群分离鉴定观象思李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种以革兰氏阳性菌属于分枝杆菌科的细菌，被广泛认为是一种主要致病性菌，因其在食品中引起的食物中毒而引起关注。
为了确定李斯特菌的存在和防止其对公共卫生的威胁，需要进行形态复杂性类群的分离鉴定。
李斯特菌的形态复杂性类群分离鉴定主要包括以下几个步骤：1. 样品采集：首先，需要采集可能含有李斯特菌的样品。
常见的样品包括生鲜食品、家禽肉类和乳制品等。
采集样品时，需要使用无菌容器，并避免与外界环境污染。
2. 样品预处理：样品预处理是为了去除潜在的抑制因素，以提高李斯特菌的分离效率。
预处理包括样品的去外壳、灭菌、稀释等步骤。
3. 李斯特菌的分离：将经过预处理的样品进行分离。
常用的方法有平板法和富集法。
平板法是将稀释后的样品均匀涂在含有偏光鲁巴通（PALCAM）选择性培养基的平板上，培养在37°C下进行。
富集法则是将样品在选择性富集培养基中进行不同时间的富集培养，以达到李斯特菌的富集目的。
4. 形态特征观察：分离出的李斯特菌经过纯化后，可以进行形态特征观察。
李斯特菌为革兰氏阳性菌，其形态为短杆状，有时呈分枝状。
此外，李斯特菌在PALCAM平板上有一种典型的蓝色菌落形成，可以作为初步鉴定的依据。
5. 生化试验：为了进一步确定分离菌株是否为李斯特菌，可以进行一系列的生化试验。
常用的生化试验包括氧化/发酵代谢试验、酪蛋白降解试验、柠檬酸利用试验等。
这些试验可以通过观察细菌在不同培养基上的代谢特性来确定菌株的身份。
6. 分子生物学鉴定：在生化特性鉴定的基础上，还可以使用分子生物学技术进一步确定菌株的身份。
常用的分子生物学方法包括PCR（聚合酶链反应）和16S rRNA基因测序。
这些方法可以通过检测李斯特菌特有的基因序列或比对菌株序列与数据库的相似性来确诊。
总结一下，李斯特菌的形态复杂性类群分离鉴定是一个多步骤的过程，需要进行样品采集、预处理、分离、形态观察、生化试验和分子生物学鉴定。
医院微生物室李斯特菌属检验操作规程
XXXX医院微生物室李斯特菌属检验操作规程1 目的2 标本类型3 鉴定检验3.1 形态染色3.2 培养特征3.3 生化反应3.4 鉴别要点3.5 操作步骤4 药敏试验5 质量控制6 检验结果解释与分析7 临床意义8 鉴定流程9 相关文件1 目的规范李斯特菌属检验操作规程，确保检验结果准确可靠。
李斯特菌属包括产单核细胞李斯特菌、伊氏李斯特菌、斯氏李斯特菌等菌种，其中只有产单核细胞李斯特菌对人和动物致病。
2 标本类型血液、尿液、痰、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。
3 鉴定检验3.1 形态染色：革兰阳性小杆菌。
3.2 培养特征：在血琼脂平板上35℃培养18~24小时，形成较小、圆形、光滑而有狭窄β-溶血环的菌落。
3.3 生化反应：触酶试验阳性，分解葡萄糖，不分解蔗糖、木糖、甘露醇，甲基红、VP和CAMP试验阳性，吲哚、脲酶和硝酸盐还原试验阴性。
3.4 鉴别要点3.4.1 本菌属特征：革兰阳性短杆菌，菌落较小，有狭窄的β-溶血环，25℃时有动力，37℃时无动力，触酶、CAMP试验阳性，分解葡萄糖。
3.4.2 产单核细胞李斯特菌与粪肠球菌的鉴别：两者均具有耐盐、耐碱耐胆汁等特点，但可通过触酶试验加以鉴别。
3.4.3 产单核细胞李斯特菌与无乳链球菌的鉴别：两者CAMP试验均为阳性，但产单核细胞李斯特菌触酶试验阳性，无乳链球链触酶试验阴性。
3.5 操作步骤3.5.1 涂片染色：观察菌落特征，挑取可疑菌落，涂片染色镜检。
3.5.2 触酶试验：参见《触酶试验操作规程》。
3.5.3 鉴定：从血琼脂平板上挑取纯菌落，用细菌鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。
4 药敏试验参见《药敏试验标准操作规程》及CLSI M100-S19最新版本文件。
5 质量控制见《质量管理程序》。
6 检验结果解释与分析。
单核细胞增生李斯特菌检验
血清学分型:
Lm是根据O抗原和H抗原的差异进行血清 学分型.虽然Lm有16种血清型,1/2a、1/2b 、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、 4d、4e、5、6a、6b和7,但只有3种血清型 <1/2a、1/2b、4b>可引起疾病.从食品和患 者中分离的菌株95％以上是1/2a,1/2b,1/2c 和4b等血清型,而3a、3b、3c、4a、4c、4e 、4d和7等血清型在食品中非常少见,也没 有引起李斯特菌病的报道.
溶血反应 ＋ － ＋ － ＋ －
协同溶血
葡萄糖
麦芽糖
MR-VP
甘露醇
鼠李糖
木糖
七叶苷
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动力试验
将TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接种到SIM培 养基中,于30℃培养24h-48h,李斯特菌有动力, 呈伞状生长.
PCR检测方法：〔1取1ml被检样李斯特氏 菌增菌肉汤用于提取DNA的,模板DNA的 制备, 根据试剂盒说明书进行；〔2PCR反 应体系：20μl .
H2O<二馏灭菌水>12.8μl,
10×buffer2.0μl,
Mg2+<25mol/l> 2.0μl,4×dNTP<10mmol/ml> 1.6μl,Primer<30pmol/μl>各0.25μl,
食品中单增李斯特菌检测
食品中单增李斯特菌检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测实验目的1）了解单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性。
2）熟悉单核细胞增生李斯特氏菌的分离鉴定方法。
基本原理单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)归属于李斯特菌属(Listeria)。
单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌。
李斯特菌是一种细胞内寄生菌，它不仅可能存在于肉类产品中，也可能存在于乳制品、蔬菜、沙拉及海产品等日常食物里面。
此菌广泛分布于自然界中，在土壤、排污下水、地表水、青贮饲料、烂菜中均可分离到。
人也可作为无症状携带者。
据报道，健康人粪便中该菌的携带率为0.6％～16％，4％～8％的水产品、5％～10％的奶及其制品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被该菌污染。
李斯特菌能在1～45℃的温度下生存，能在家用电冰箱的冷藏室内较长时间生长、繁殖。
该菌为革兰氏阳性短杆菌，有的菌体略弯曲，两端钝圆，大小约为0.4～0.5μm ′0.5～2.0μm。
多单在，有时是V字型排列。
无芽孢，不产生荚膜。
在陈旧培养物中或粗糙型菌落的菌体长度可达6～20μm 或更长的丝状。
在20～25℃培养时可产生2～4根鞭毛而运动，但在37℃培养时鞭毛发育不良，无运动性。
本菌需氧或兼性厌氧，生长温度为1～45℃，最适温度为30～37℃。
对营养要求不高，可在普通琼脂培养基中生长，但在血琼脂培养基或胰酪胴琼脂上生长更好。
加入0.2％～1％(W/V)的葡萄糖及2％～3％(V/V)的甘油生长更佳。
在含1%(W/V)NaCl的复合培养基中能生长。
在4℃可缓慢增殖，形成菌落约需7d。
在液体培养基中培养18～24h后，肉汤呈轻度均匀混浊，数天后形成粘稠沉淀附着于管底，摇动时沉淀呈螺旋状，继续培养可形成颗粒状沉淀。
不形成菌环、菌膜。
在营养琼脂上，光滑(S)型可形成直径0.5～1.5mm、圆形、露滴状半透明、低隆起、边缘整齐、表面有细致纹理的蓝灰色菌落，斜射光照射时，菌落呈特征性蓝绿光泽。
李斯特菌国标
李斯特菌国标李斯特菌是一种常见的致病菌，也是人类感染的重要病原体之一。
它广泛存在于自然界中，可以在土壤、水体、动物体内等多种环境中找到。
李斯特菌感染会引起利斯特菌病，这是一种由于食物中摄入李斯特菌而引起的食源性感染病。
为了保障公众的食品安全，许多国家都制定了李斯特菌的国家标准。
李斯特菌国标是对食品中李斯特菌的检测和控制要求的规范。
它主要包括了李斯特菌的检测方法、限量标准和控制措施等内容。
李斯特菌国标的制定是为了保护公众的健康和食品安全，防止李斯特菌感染的发生和传播。
李斯特菌国标规定了李斯特菌的检测方法。
常用的检测方法包括传统培养法、分子生物学方法和免疫学方法等。
传统培养法是通过将食品样品进行培养，然后观察菌落形态和生化特性来鉴定李斯特菌的存在与否。
分子生物学方法则是利用PCR技术，通过检测李斯特菌的特异基因序列来进行检测。
免疫学方法则是利用抗原抗体反应，通过检测李斯特菌的抗原或抗体来进行检测。
这些方法各有优缺点，可以根据实际情况选择合适的方法进行检测。
李斯特菌国标还规定了李斯特菌在食品中的限量标准。
根据国际上的标准，食品中李斯特菌的限量标准通常为每克不得超过100 CFU （菌落形成单位）。
这是因为李斯特菌在较低温度下仍能生长繁殖，并且只需要摄入极少量的李斯特菌就可能导致感染。
因此，对于易受污染的食品，如生食海鲜、生食肉类等，限量标准通常更为严格。
李斯特菌国标还规定了食品生产过程中的控制措施。
这些措施主要包括原料控制、加工控制、卫生控制和贮存运输控制等。
在原料控制方面，要求食品生产企业选择符合卫生标准的原料，并对原料进行适当的处理。
在加工控制方面，要求企业严格执行卫生操作规程，确保生产过程中的卫生条件。
在卫生控制方面，要求企业定期进行卫生检查和消毒，保持生产环境的清洁和卫生。
在贮存运输控制方面，要求企业对成品进行适当的贮存和运输，确保成品的卫生安全。
李斯特菌国标的制定和执行对于保障食品安全和公众健康意义重大。
单增李斯特菌的检验方法
单增李斯特菌的检验方法
一.增菌：
1.EB肉汤
2.LB肉汤（根据我的实验结果和请教其他老师的说法，LB增菌
效果优于EB）
LB分为LB1和LB2，两者基础培养基相同，区别在于添加辅助试剂丫啶黄、萘啶酮酸的量（基础培养基--杭州天河生物试剂公司；丫、萘—上海疾控中心。
上海的辅助试剂已按一定浓度配置成溶液，使用起来比较方便）
25g样品加入到225mlLB1增菌液中，30℃培养24h，吸0.1mlLB1增菌液到LB2增菌液中，30℃培养24h。
二.选择分离
挑一环LB2增菌液划线接种到科玛嘉选择性培养基上，37℃培养24h，观察现象，可疑菌落在此培养基上为兰色，周围有白晕的菌落。
（国标上使用的选择性培养基是MMA，但是其选择性不强，科玛嘉选择性培养基是法国制造，选择性比MMA强的多，而且现象明显，许多发达国家使用。
此培养基是国标编委白萍女士向我推荐的）三.生化实验
挑可疑菌落穿刺接种到SIM，25℃培养3---5d，观察伞状生长情况、TSI（三糖铁）斜面30℃培养24h—48h，观察，单增李斯特菌在TSI上应该是底面、斜面均产酸，不产H2S，不产气的培养物.
这是单增李斯特菌落在SIM动力培养基上的伞状情形再挑取TSI上培养物接种其他生化管。
七叶苷鼠李糖木糖甘露醇尿
素
硝
酸
盐
还
原
VP MR H2O2
++----+++。
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李斯特氏菌李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。
感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
李斯特氏菌 - 概况李斯特菌李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。
李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。
单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。
李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。
肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。
李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。
其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。
单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
李斯特氏菌 - 特点李斯特菌快速检测试剂盒1、分布广：存在于土壤、水域(地表水、污水、废水)、昆虫、植物、蔬菜、鱼、鸟、野生动物、家禽。
2、生存环境可塑性大：能在2-42℃下生存(也有报道0℃能缓慢生长)能在冰箱冷藏室内较长时间生长繁殖。
3、适应范围大：酸性、碱性条件下都适应。
4、带菌较高的食品有：牛奶和乳制品；肉类(特别是牛肉)；蔬菜；沙拉；海产品；冰淇凌等。
李斯特氏菌 - 生存环境单核细胞李斯特菌在半固体培养基上生长情况李斯特菌具有较强的反抗力，秋冬时期在土壤中能存活5个月以上，在冰块内也可存活3～5个月，许多冷冻肉类都是它的“温床”。
这种细菌对高温的反抗力也比较强，能在100℃下挺15～30分钟，在70℃下可存活30分钟以上。
单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。
据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%,有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。
人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。
该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。
李斯特氏菌 - 生物学特性1、形态与染色单核细胞增多性李斯特菌鞭毛染色该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。
2、培养特性该菌营养要求不高，在20--25℃培养有动力，穿刺培养2�5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。
该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8�4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。
在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。
在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。
在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用450角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
3、生化反应电子显微镜下的单核细胞增多性李斯特菌该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。
4、血清型根据菌体（O）抗原和鞭毛(H)抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”13 个血清型。
致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。
5、抵抗力该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活，对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌。
该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。
李斯特氏菌 - 致病性澳洲食物中毒引发高度关注单增李斯特菌进入人体是否得病与菌量和宿主的年龄免疫状态有关，因为该菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能，因此，易感者为新生儿、孕妇、40岁以上的成人，免疫功能缺陷者。
潜伏期在感染后3-70天出现症状，健康成人可出现轻微类似流感症状，易感者突然发热，剧烈头痛、恶心、呕吐、腹泻、败血症、脑膜炎、孕妇出现流产。
病性机理单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下：1、寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；2、抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解；3、溶血素，即李斯特杆菌溶血素O，可以从培养物上清液中获得，为SH活化的细胞溶素，有α和β两种，为毒力因子。
临床表现单核细胞增多性李斯特菌健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。
控制单增李斯特氏菌在一般热加工处理中能存活，热处理已杀灭了竞争性细菌群，使单增李斯特氏菌在没有竞争的环境条件下易于存活，所以在食品加工中，中心温度必须达到70℃持续2分钟以上。
单增李斯特氏菌在自然界中广泛存在，所以即使产品已经过热加工处理充分灭活了单增李斯特氏菌，但有可能造成产品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是极为重要的。
由于单增李斯特氏菌在4℃下仍然能生长繁殖，所以未加热的冰箱食品增加了食物中毒的危险。
冰箱食品需加热后再食用。
李斯特氏菌 - 检验1、增菌培养1. 将未开封的测试片贮藏在<= 8 oC (46 oF)的环境下，并在包装上标示的有效期内使用。
在高湿度的地方，最好在使用前将测试片回复到室温。
取回的样品应在4℃下处理、存放和运送，如果是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。
取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培养4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养20h和44h.。
2、分离共培养24h和48h后，取EB培养物分别在OXA和LPM或加七叶苷/Fe3 LPM琼脂平板上划线。
PALCAM琼脂可替代LPM琼脂。
将OXA和PALCAM平板置于35℃培养24-48h，LPM平板在30℃培养24-48h。
然后，把LPM平板放于解剖镜载物台上，以450角入射光从平板下面照射平板，通过目镜垂直向下观察寻找可疑菌落。
李斯特氏菌在LPM平板上呈有光泽的兰色或灰色。
用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对照。
2. 已开封的测试片，将开口反折，用胶带封好。
加入七叶苷和Fe3 的LPM平板不用斜射光系统，选择可疑菌落的方法与在OXA上选择可疑菌落的方法相同。
在OXA平板上李斯特氏菌菌落周围有一个黑色环，其它菌也可形成黑色环，但形成时间要在两天以上。
李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。
在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5个或更多的典型菌落，分别划线于TSAYE平板上以得到更纯、更典型的单个菌落。
食品检验中在TSAYE平板上纯化是必须的，因为在PALCAM和OXA或LPM平板上分离菌落时可能沾有不可见的受抑微生物。
挑取5个典型菌落的原因是一个样品中可能分离到一种以上的李斯特氏菌。
30℃TSAYE平板培养24-48h，如果不用于动力观察，也可在35℃培养。
3、鉴定步骤3. 为防止暴露于潮湿的环境中，请不要冷藏已开封的测试片。
将胶带封好的测试片贮藏在低温干燥的地方，保持时间不超过1个月。
请勿将测试片放在温度> 25 oC (77 oF)和(或)相对湿度> 50%的环境中。
（1）观察TSAYE平板通过斜射光观察，寻找呈兰灰至兰色菌落。
在TSAYE上用已知菌作对照。
（2）、从30℃或更低温度下培养的TSAYE平板上挑取典型菌落做成湿玻片在油镜下观察。
湿玻片用0.85%生理盐水菌悬液制成。
如果菌量太少，菌体黏附于载玻片上而呈现非运动性。
李斯特氏菌是细短杆菌，可见轻微的旋转及翻滚。
与已知的李斯特氏菌的对照相比，球形、大的杆状且快速泳动的都不是李斯特氏菌。
（3）挑取典型菌落进行过氧化氢酶实验，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。
（4）取16-24h的培养物进行革兰氏染色，李斯特氏菌呈革兰氏阳性杆菌。
但是陈旧培养物革兰氏染色会发生变化，而且菌体可成球形。
在染色过重的玻片上菌体有呈栅状排列的趋势，易误认为白喉菌而错判。
4. 用涂抹棒、海棉或其它采样设备收集环境样本。
湿润采样设备的液体应<= 10 mL。
湿润剂可以是无菌水、缓冲蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW)，或中和缓冲液，如Letheen 肉汤或Dey/Engley (DE)中和肉汤。
（5）挑取典型菌落接种于TSBYE肉汤管中，35℃培养24h用做糖类发酵和其它生化项目实验。
TSBYE肉汤管在4℃下可存放几天，也可反复接种。
（6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺种到5%的绵羊血或马血琼脂平板上，刺种时避免触到平板底部和使琼脂破裂，同时设阳性对照（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对照（英诺克李斯特氏菌），35℃培养48h。