多酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶的测定
植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定
植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定作者:《果蔬贮藏加工学实来源:华南农大浏览数:2949 录入:2007-6-16 14:53:40 验指导》植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定一、原理抗坏血酸氧化酶能利用空气中的氧氧化抗坏血酸成为脱氢抗坏血酸；多酚氧化酶可催化空气中的氧氧化多酚，成为相应的醌，形成的醌能被抗坏血酸还原。
因此，在酶提取液中加入抗坏血酸，可测定抗坏血酸氧化酶的活性，加入抗坏血酸及焦儿茶酚，可测定抗坏血酸及多酚氧化酶两者的活性，相减即可求出多酚氧化酶的活性。
抗坏血酸的消耗量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸。
碘酸钾在酸性条件下与碘化钾反应放出碘，放出的碘与抗坏血酸作用，将之氧化成脱氢抗坏血酸，多余的碘能使淀粉变为蓝色。
二、材料与设备材料：马铃薯块茎设备：水浴锅、台秤、离心机试剂：pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液、0.1％抗坏血酸、0.02mol/L焦儿茶酚、10％三氯乙酸、1％淀粉。
0.05mol/L碘液：碘化钾2.5g溶于200ml蒸馏水，加冰醋酸1ml，再加0.1mol/L碘酸钾12.5ml，定容至250ml。
三、试验步骤（一）酶液制备：称取马铃薯块茎10.0g，用预冷pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液，研磨匀浆，定容至50ml，在18-20℃水浴浸提30分钟，中间摇动数次，再于3000×g离心10分钟，取上清液，4℃保存备用。
（二）酶活性测定：１. 取6个三角瓶(50-100ml)，标上号码，分别加入下列试剂(ml)：┌──┬────┬───────┬─────────┬──┬─────┐│瓶号│ 蒸馏水│0.1％抗坏血酸│0.02mol/L焦儿茶酚│ 酶│煮5分钟酶│├──┼────┼───────┼─────────┼──┼─────┤│ 1 │ 4 │ 2 │ │ 2 │ ││ 1' │ 4 │ 2 │ │ 2 │ ││ 2 │ 4 │ 2 │ │ │ 2 ││ 3 │ 3 │ 2 │ 1 │ 2 │ ││ 3' │ 3 │ 2 │ 1 │ 2 │ ││ 4 │ 3 │ 2 │ 1 │ │ 2 │└──┴────┴───────┴─────────┴──┴─────┘1、3瓶各作一次重复，2、4瓶作空白将6个三角瓶放入18-20℃水浴反应5分钟,立即分别加入10％三氯乙酸1ml，摇匀，终止酶反应。
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。
2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。
二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。
酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。
其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。
多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。
多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。
植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。
研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。
因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。
多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O2——————→邻醌＋H2O三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。
2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。
多酚氧化酶活性测定
多酚氧化酶活性测定一、引言食品的褐变主要分为酶促褐变和非酶褐变，多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要酶之一，学习它的活性测定对于果蔬加工采取合理的护色措施具有指导意义。
多酚氧化酶的活性测定有多种方法，出于一般实验室的条件相对不是很先进，本试验选用了一种较简单的方法,但这种方法仍然可以训练学生掌握测定酶活性的基本要点和技能。
二、原理邻苯二酚在多酚氧化酶催化下受O2作用生成邻苯二醌，邻苯二醌能够被抗坏血酸还原，如抗坏血酸充足，少量邻苯二酚可反复不断地发生氧化还原。
由于该酶最适pH为6，因此这一过程在pH6时最快。
把分析对象配成pH6左右的样液，在抗坏血酸和邻苯二酚存在时，于20℃下振荡2min，这时抗坏血酸被氧化。
精确的经过2min后加入偏磷酸以终止反应。
用碘量法（以碘酸钾为基准试剂）进行滴定，测得剩余的抗坏血酸。
由得到的数据求出被氧化的抗坏血酸量，并计算出酶活性，并以1g分析物质1min内氧化抗坏血酸的微克分子数表示之。
所有上述过程的主要反应式如下：酶邻苯二酚邻苯二醌邻苯二醌+抗坏血酸邻苯二酚+脱氢抗坏血酸KIO3+5KI+6HCl→6KCl+3H2O+3I23I2+3Vc→3-脱氢Vc+6HI三、材料和设备苹果；马铃薯。
研钵；烧杯；50毫升量瓶；250毫升三角瓶；秒表；滴定管；温度计。
四、试剂1．0.2邻苯二酚溶液：用粗天平称0.2克邻苯二酚，溶解于蒸馏水，稀释到100 毫升，（准备用的前1-2天配制）。
贮于棕色玻璃瓶中，放在冷凉处。
2．0.01N碘酸钾溶液：用分析天平精确称取0.3566克KIO2（预先在102℃烘2 小时，在干燥皿中冷却备用），用蒸馏水溶解于1升的容量瓶中，加5毫升1N 的NaOH溶液（此时加碱是为了使KIO3和KI在该试剂中暂不反应）和2克KI，溶解，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，保存于棕色瓶中。
3．pH6.4的磷酸缓冲液，称取KH2PO4盐5.44克溶解到无碳酸的水中，加10毫升1N的NaOH溶液，用无碳酸的水稀释至200毫升，保存于磨口玻璃瓶中。
抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定(精)
六、思考题
1.多酚氧化酶活性测定实验中计算多酚氧化酶活性
时为什么要减去抗坏血酸氧化酶活性？
2.测定多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶活性时加入偏
磷酸的作用是什么？
抗坏血酸 焦儿茶酚 偏磷酸 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1
酶溶液 2 2 2 2 2 2
偏磷酸 (保温一定时间后) 1 1 1 1 1 1
五、试验结果
(1)抗坏血酸氧化酶活性按下式计算： 抗坏血酸氧化酶活性[氧化抗坏血酸毫克数/(克鲜重· 分)] =[ V′-( V 1- V 2)] ×0.44 (V/a)/(w×a) 式中：V′=滴定3号空白所用去的碘液毫升数； V1=滴定1号瓶所用去的碘液毫升数； V2=滴定2号瓶所用去的碘液毫升数； 0.44=每毫升5/6mmol碘液氧化抗坏血酸毫克数； V=提取液总体积（ml）； a=测定时所用提取液的ml数 w＝样品鲜重(g) t＝测定时间(分)。
利用单位时间内单位植物材料抗坏血酸的氧化量 利 用 间接表示多酚氧化酶的活性：
多酚氧化酶
儿茶酚＋O2
儿茶醌＋H2O
儿茶醌+抗坏血酸→儿茶酚＋脱氢抗坏血酸
三、实验材料
梨果肉
四、实验步骤
1．酶液提取 2．酶活性的测定（按下表配制反应体系）
瓶 号 1 2 3 4 5 6
缓冲液 4 4 4 3 3 3
+
1 2
抗坏血酸氧化酶
O2
O O H
C C C C H O
+
H2O
H
HO
C
C H
HO
CH2OH
抗坏血酸
CH2OH
脱氢抗坏血酸
利用碘液滴定剩余抗坏血酸
O
C HO HO H HO C C C C H O + C O C C C C H O O
植物体内抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定
抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定
【原理】
O C
O C
HO C HO C
O
1
抗坏血酸氧化酶
2 O2
OC OC
O
H2O
HC
HC
HO C H CH2OH
HO C H CH2OH
抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定
【原理】O
C
HO C HO C
O I2
HC
HO C H CH2OH
O C
OC O 2HI
因此，多酚氧化酶的测定与抗坏血酸氧化酶的测 定类似，除了向反应体系中加入多酚氧化酶的底 物-多元酚类，还要加入抗坏血酸。多酚氧化酶 的活性，可以间接由抗坏血酸的消耗量求得。
抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定
【仪器设备】 1．研钵：1个； 2．50 mL量瓶：1个； 3．50 mL三角瓶：9个； 4．微量滴定管：1支； 5．5 mL移液管1支、2 mL 2支、1 mL 6．恒温水浴。
抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定
【方法步骤】
瓶号
试剂（mL）
备注
缓冲液 抗坏血酸 焦儿茶酚 酶溶液 偏磷酸
1
4
2
0
2
测定抗坏血酸氧化酶
2
4
2
0
2
同上
3
4
2
0
2
同上
4
4
2
0
2
1
空白测定
5
3
2
1
2
测定多酚氧化酶
6
3
2
1
2
同上
7
3
2
1
2
同上
8
某农业大学《植物生理学》考试试卷(1213)
某农业大学《植物生理学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（10分，每题5分）1. 蛋白质的可逆磷酸化是生物体内一种普遍的翻译后修饰方式。
（）[扬州大学2019研]答案：正确解析：蛋白质磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）上的过程，或者在信号作用下结合GTP，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。
蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。
2. 高等植物如果较长时间进行无氧呼吸，由于底物的过度消耗，能量供应不足，加上有毒物质的积累，因而对植物是不利的。
（）[扬州大学2019研]答案：正确解析：高等植物如果较长时间进行无氧呼吸，产生的能量不足且可能会造成酒精中毒。
2、名词解释（55分，每题5分）1. 临界日长答案：临界日长是指昼夜周期中，引起长日植物成花的最短日照长度或引起短日植物成花的最长日照长度。
解析：空2. 长日植物[沈阳农业大学2019研]答案：长日照植物是指在一定的发育时期内，每天的光照时间只有大于某一时数（临界日长），并经过一定的天数才能开花的植物。
例如大麦、小麦、菠菜、向日葵等。
这类植物生长在小于临界日长的光照下，就会保持营养生长状态。
用人工方法延长光照时间，可提早开花。
解析：空3. enzymelinked receptor答案：enzymelinked receptor的中文名称是酶联受体，是指与酶连接的细胞表面受体，又称催化性受体，目前已知的酶联受体都是跨膜蛋白，当胞外信号（配体）与受体结合即激活受体胞内段的酶活性。
其类型主要包括：①受体酪氨酸激酶；②受体酪氨酸磷酸酯酶；③受体丝氨酸苏氨酸激酶；④酪氨酸蛋白激酶偶联的受体；⑤受体鸟苷酸环化酶。
多酚氧化酶活性测定
A值变化均匀的三组数 值求平均值。
多酚氧化酶活性测定多酚氧化酶多酚氧化酶的测定多酚氧化酶活性多酚氧化酶的测定方法多酚氧化酶活力的测定nadph氧化酶活性测定单胺氧化酶活性测定黄嘌呤氧化酶活性测定酶促褐变
实验一
多酚氧化酶（PPO）活性测定
末端氧化酶：处于生物氧化一系列反应的最末端， 把电子传递给O2的酶。 1、细胞色素氧化酶 2、交替氧化酶 3、酚氧化酶: 分为单酚氧化酶和多酚氧化酶。 4、乙醇酸氧化酶 5、抗坏血酸氧化酶
四、实验步骤： 1．称取马铃薯0.5克，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，少许 PVP，研磨匀浆，转移到离心管，再用2.5mL pH 7.2磷酸缓 冲液冲洗研钵，合并提取液。4℃ 5000rpm离心15分钟，上 清液即为粗酶液。 2．在试管中，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，1.5mL 儿茶酚 以及1mL 粗酶液，空白调零以1mL磷酸缓冲液代替粗酶液。 3．A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，立刻于525nm下测定 反应体系的A值，每隔30秒记录一次，共记录5次。 4．计算酶活力。按下式计算 PPO活性＝U/min gFW A值增加0.001定义为一个酶活力单位。
一、实验目的： 掌握测定多酚氧化酶活性的方法；了解多酚氧化酶的特性 二、实验原理： 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化 生成醌。醌有颜色，在525nm下有最大光吸收，通过分光光 度法测定反应体系颜色变化可测定酶活性。 三、器材与试剂 1、仪器：低温离心机、s22pc分光光度计 2、试剂：儿茶酚、pH 7.2磷酸缓冲液 3、材料：马铃薯
食品中氧化酶活性检测方法的比较与应用研究
食品中氧化酶活性检测方法的比较与应用研究随着人们对食品安全和食品质量的不断关注，食品中氧化酶活性的检测方法逐渐成为了重要的研究方向。
氧化酶在食品中的高活性可能导致食品的品质下降、变质甚至对人体健康造成危害。
因此，准确测定氧化酶活性对于食品质量控制和食品安全具有重要意义。
在食品中，常见的氧化酶包括过氧化氢酶、多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶等。
这些氧化酶在食品生产和加工过程中，特别是在果蔬加工和果汁饮料生产中起着重要作用。
然而，高活性的氧化酶容易导致食品的品质下降，例如在果汁中引起褐变和味道的变化。
因此，准确测定氧化酶活性对于保证食品的品质具有重要意义。
目前，常用的食品中氧化酶活性检测方法主要包括光度法、电位差法、荧光法和电化学法等。
这些方法各有优缺点，适用于不同类型的食品样品，并在食品质量监控和研究中得到了广泛应用。
在光度法中，常用的方法包括酶促反应的速率测定和底物消耗的测定。
速率测定通常通过测量酶促反应体系中产生的产物或底物的浓度变化来反映酶的活性。
光度法简单、快速，但缺点是无法对复杂微量物质进行测定，且易受样品成分和干扰因素的影响。
电位差法是测定酶活性的一种常用方法，它通过测量酶催化反应过程中产生的电位差变化来评估酶的活性。
这种方法适用于测定具有电化学反应的酶活性，如过氧化氢酶和蔗糖酶。
电位差法准确度高，但操作复杂、耗时较长，并且对仪器设备要求较高。
荧光法是一种敏感且快速的检测方法。
通过在酶促反应中引入荧光染料，如二苯丙酮，通过测量荧光强度的变化来评估酶的活性。
荧光法适用于大多数氧化酶的测定，并且具有很高的选择性和灵敏度。
然而，荧光法对实验条件和仪器设备要求较高，且对荧光物质的稳定性有一定要求。
电化学法是一种常见的氧化酶活性检测方法，它通过测量酶催化反应中所产生的电流或电位来评估酶的活性。
电化学法具有灵敏度高、快速、准确度高的特点，并且适用于多种氧化酶的测定。
但是，电化学法对实验条件和仪器设备的要求较高，且需要一定的操作经验和技术。
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多酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶的测定方法
（一）
试剂：1、0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22克焦儿茶酚溶于100毫升蒸馏水中，现用现配。
2、0.1mol/l碘酸钾：0.3567克碘酸钾溶于蒸馏水，定容至100毫升。
3、0.005mol/l碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1mol/l 碘酸钾12.5毫升，最后加蒸馏水定容至250毫升。
4、pH6.0磷酸缓冲液：87.7毫升A+12.3毫升B，用蒸馏水稀释至200毫升。
贮备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6g NaH2PO4·H2O用蒸馏水配成1000ml）。
贮备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O用蒸馏水配成1000毫升）
5、其它：1%淀粉；10%偏磷酸；0.1%抗坏血酸（现用现配）
方法：
1、粗酶提取：称取新鲜样品2克，剪碎，置于研钵中，加入少量pH6.0磷酸缓冲液和少许石英砂，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用缓冲液冲洗入50毫升容量瓶中，并定容至刻度。
在18~20度下每隔3分钟摇动1次，共5次，然后再静置15~20分钟，其上清液即为粗酶提取液（可倾入干洁的三角瓶中备用）。
2、活性测定：取干洁50毫升三角瓶6只（编号），按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸缓冲液、0.1%抗坏血酸、0.02mol/l焦儿茶酚，并向③号瓶及⑥号瓶各加10%偏磷酸。
然后将三角瓶置于18~20度水浴或放在室温下使内外温度达到平衡之后，每隔1分钟向各瓶中依次加入酶液2毫升，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然间隔1分钟向①、②、④、⑤号各瓶加入偏磷酸1毫升（注意：加完2号瓶后应间隔2分钟再加4号瓶），用于终止酶的活性。
最后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作为指示剂，摇匀后用微量滴定管以0.005mol/l碘液滴定，当溶液呈现淡蓝色为止，记录碘液消耗量。
3、结果计算：A多酚=0.44{[⑥-(④+⑤)/2]-[③-(①+②)/2]}*V1/V2/W/t
V1：提取时酶液总量（毫升）V2：测定时酶液用量（毫升）
①、②、③、④、⑤、⑥：测定时消耗碘液量（毫升） t：酶反应时间（分）
2 4 2 2 同上
3 4 2 2 1 空白测定
4 4 2 1 2 测多酚氧化酶
5 4 2 1 2 同上
6 4 2 1 2 1 空白测定
分光光度计法测定多酚氧化酶（二）
试剂：
①0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22g焦儿茶酚溶于100ml蒸馏水中，现用现配。
②pH6.0磷酸缓冲液：87.7ml A+12.3ml B,用蒸馏水稀释至200ml。
储备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6gNaH2PO4·H2O用蒸馏水配成1000ml）。
储备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65gNa2HPO4·7H2O或
71.7gNa2HPO4·12H2O用蒸馏水配成1000ml）。
③10%偏磷酸：称1g偏磷酸溶于100ml蒸馏水中。
方法：
1．称取新鲜样品1g，剪碎，置于研钵中，加入少量的磷酸缓冲液，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用磷酸缓冲液定容25ml于离心管中。
在30度下静置30分钟，中间摇动3-4次；放入离心机于4000r/min离心20分钟。
其上清液即为粗酶提取液。
2．取干洁试管3支（编号），分别加入4ml蒸馏水，1ml焦儿茶酚，其中一支作为对照，在加入酶液之前加入1ml偏磷酸以终止酶活性。
然后每隔1分钟向各试管依次加入酶液1ml，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然依次间隔1分钟向（除对照外）试管中加入1ml偏磷酸，用于终止酶活性。
（反应时间为10min）3．最后在420nm处比色，记录吸光度。
4．活性计算：以单位质量烟叶每分钟内OD420值变化0.01为一个酶活力单位，按下式计算
多酚氧化酶的活性（0.01OD420/g.min）=OD420*D/0.01t*W。