用清除有机自由基DPPH法评价竹叶提取物抗氧化能力
竹叶柴胡总黄酮提取及抗氧化作用研究
竹叶柴胡总黄酮提取及抗氧化作用研究
陈桐;侯林清;覃凡倚;甘鑫睿;叶峻
【期刊名称】《辽宁化工》
【年(卷),期】2023(52)2
【摘要】为探究竹叶柴胡的药效机理,采用超声辅助法提取了竹叶柴胡中总黄酮,并确定了最佳工艺如下:提取剂为40%乙醇,料液比为1∶55,超声功率为200 W,温度为70℃,时间为50 min。
所测样品中总黄酮质量分数为46.45 g·kg^(-1),且竹叶柴胡提取液对DPPH和羟基自由基均有较好的清除率。
研究表明,竹叶柴胡有较好的抗氧化活性,具有抗病毒、抗衰老、抗癌等药效作用。
【总页数】4页(P187-189)
【作者】陈桐;侯林清;覃凡倚;甘鑫睿;叶峻
【作者单位】成都师范学院化学与生命科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】R284.2
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用清除有机自由基DPPH法评价植物抗氧化能力 (2)
研究简报用清除有机自由基DPPH法评价植物抗氧化能力3彭长连 陈少薇 林植芳 林桂珠(中国科学院华南植物研究所,广州510650)摘要 几种抗氧化剂的浓度与其清除1,12二苯基苦基苯肼(DPPH)能力呈显著的线性相关.不同抗氧化剂清除DPPH能力差异明显.抗坏血酸与DPPH反应的灵敏性高于其抑制肾上腺素氧化的能力.用DPPH法和亚油酸氧化法同时测定了生长在不同光强下植物叶片抗氧化能力的变化,两种方法所得结论相一致.结果表明清除有机自由基法是一种快速、简便、灵敏的评估植物抗氧化能力的可行方法.关键词 1,12二苯基苦基苯肼(DPPH),植物,抗氧化能力,自由基学科分类号 Q946 生物的抗氧化能力与其抗病性、抗逆性及延缓衰老密切相关.因而从天然植物中寻找有效的抗氧化剂应用于医药、食品、保健品、饮料、化妆品等之中,或从氧化与抗氧化代谢的平衡来探讨生物对变化环境条件的适应性机理,都是当前的研究热点之一. 迄今用于评价植物抗氧化能力的方法虽已有诸如硫氰酸盐(thiocyanate)法[1]、硫代巴比妥酸(TBA)法[2]、ORAC法(automated oxygen radical absorbance capacity assay)[3]等.但这些方法或者手续相当繁琐费时,或者所需试剂或大型仪器的费用昂贵,尚缺乏一种灵敏、简单易行的有效方法.1, 12二苯基苦基苯肼(1,12Diphenyl222picryl2 hydrazyl,DPPH)是一种稳定的有机自由基,通过检测生物试剂对DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱.然而对自由基信号的直接检测需要使用顺磁共振仪而使其难以普及.近年来,国外已有人初步利用DPPH溶液的紫红色吸光度变化作为清除自由基能力的分光光度测定[4,5],但对其准确性、灵敏度和可行性尚未有系统的探讨.本文旨在研究DPPH分光光度法用以评价植物抗氧化能力的可行性,为抗氧化剂的筛选和抗氧化胁迫机理的研究提供新的方法和依据.1 材料与方法111 仪器和试剂 紫外可见分光光度计(Beckman DU27),二苯基苦基苯肼(1,12diphenyl222picrylhydrazyl,DPPH),肾上腺素,硫代巴比妥酸(TBA),亚油酸,外源抗氧化剂抗坏血酸(AsA)、 皮素(QCT)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丁基羟基甲苯(BHT),为Sigma公司产品,α2生育酚(α2TP)为Merck公司产品.自由基捕获剂1,22二羟基苯23,52二磺酸钠(Tiron),甲醇,乙醇为国产产品.112 植物材料 试验植物为广东省鼎湖山常绿阔叶林中的乔木黧蒴(Castanopsis f issa)和林下灌木九节(Psycot ria rubra).盆栽幼苗生长于本所试验地的自然光强(100%光)和遮阴降低光强为自然光的36%和16%条件下.012g叶片用50%乙醇浸提,研磨和离心(5000×g,15min),定容至10ml. 113 有机自由基(DPPH)消除能力的测定 参考Larrauri和Y okozawa等[4,5]的方法进行修改.利用DPPH溶液的特征紫红色团的吸收峰,以分光光度法测定加抗氧化剂或植物提取液后A525吸收的下降表示其对有机自由基消除能力.反应体积2ml,DPPH溶于少量甲醇后,以50%乙醇配制为120μmol/L.植物提取液稀释10倍,反应时加011ml稀释的提取液及119ml DPPH.室温下静置20min后测吸光度变化.样品对DPPH 的清除百分比=12[(A-B)/A0]×100%,这里A0为未加样的DPPH(119ml DPPH+011ml 50%乙醇)的吸光度,A为样品与DPPH反应后的吸光度,B为样品的空白(样品011ml+119ml 3中国科学院广州分院及广东省科学院测试基金和中国科学院“九五”重点基金(KZ9522J12105)联合资助. Tel:(020)877056262405,E2mail:pengchl@ 收稿日期:1999211220,修回日期:200020420250%乙醇)的吸光度.然后用公式:[(清除率×反应加入的DPPH 量)/样品质量(μg )]求得单位质量的外源抗氧化剂或植物样品对DPPH 的实际清除量.114 抑制亚油酸氧化能力的测定 最终浓度为0138mmol/L 的亚油酸加0133mmol/L H 2O 2加速氧化,在有或无植物提取液下置于室温放置5h ,不时摇动,随后用硫代巴比妥酸(TBA )法测定所产生的丙二醛(MDA )[6].用抑制MDA 形成的百分数表示抗氧化能力.115 抑制肾上腺素氧化 参照翁元凯等的方法[7],以碱性连二亚硫酸钠产生O ・2,用不同浓度的AsA 抑制O ・2对肾上腺素的氧化,480nm (肾上腺素红的特征吸收峰)检测吸收的下降.2 结果与讨论211 DPPH 的吸收光谱 有机自由基DPPH 溶液有两个特征吸收峰330nm 和525nm ,加入抗氧化剂抗坏血酸(AsA )和 皮素(QCT )后两个吸收峰皆降低(图1),但525nm 吸收的降低较显著,故选用可见光525nm 的吸收来表示DPPH 含量的变化,这与Larrauri 等[4]报道DPPH 吸收峰在517nm 有点差异.图1 DPPH 的吸收光谱212 抗氧化剂浓度与其清除DPPH 的关系 没食子酸(GIP )、 皮素(QCT )、还原型谷胱甘肽(GSH )和α2生育酚(α2TP )是植物体内常见的抗氧化剂,BHT 是人工合成的常用食品抗氧化剂,Tiron 则是人工合成的自由基捕获剂.图2可见这几种抗氧化剂的浓度皆与DPPH 的光吸收呈显著的线性负相关(图2),相关系数r 除BHT 为018977(图2b )外,其余都在019670～019935之间.抗氧化剂浓度越高,清除DPPH 的能力越大.结果说明无论是植物的内源抗氧化剂还是人工合成的抗氧化剂,其抗氧化性都可用DPPH 法作定量评价.图2 几种抗氧化剂与DPPH 吸收峰(A 525)下降的关系(a )■———■:QCT ,y 1=-010872x +110543,r =019904;●———●:GIA ,y 2=-012485x +110843,r =019935;(b )■———■:BHT ,y 3=-010245x +019008,r =018977;●———●:GSH ,y 4=-010149x +110715,r =019918;(C )■———■:α2TP ,y 5=-010233x +018558,r =019788;●———●:Tiron ,y 6=-010212x +017586,r =019670.213 不同抗氧化剂清除DPPH 能力的比较 表1看出计算降低DPPH 吸收50%时抗氧化剂的浓度(IC 50值)或每微克抗氧化剂实际清除DPPH 的数量皆表明,没食子酸的清除能力最强,皮素次之,而GSH 、α2TP 和两种人工合成的抗氧化剂BHT 及Tiron 则较低.这与Cao 等[8]利用ORAC 法的测定指出一些类黄酮比ASA 、α2TP 和GSH 有更强的抗氧化活性结果相一致.表1 几种抗氧化剂清除DPPH 自由基能力的变化抗氧化剂 IC 50(DPPH 吸收降低50%时抗氧化剂的量) ρ/μg c /μmol ・L -1DPPH 清除量/g ・g -1GIP2111612324122QCT 516791317170AsA 8141261535107BHT 13190351132183GSH 34136621121130α2TP 19150221631119Tiron16180381121187214 抗坏血酸清除DPPH 与抑制肾上腺素氧化的比较 抑制肾上腺素氧化也常用作测定抗氧化能力的一种方法.图3比较了肾上腺素法与DPPH 法用于评价抗坏血酸(AsA )抗氧化能力的灵敏度.结果看出AsA 含量与DPPH 吸收之间的斜率为-010638,相关系数为019986(图3b ),而AsA 含量与抑制肾上腺素氧化之间的斜率为-010011,相关系数为019775(图3a ).即DPPH 法的直线斜率和与AsA 含量的相关性皆大于肾上腺素法,表明其更为灵敏与准确.此外,肾上腺素法需在碱性条件下反应,其活性氧(O ・2)源也需通过化学反应产生,而DPPH 法则可直接检测DPPH 自由基的变化.图3 抗坏血酸抑制肾上腺素氧化(a)和清除DPPH (b)的比较(a )y 1=-010011x +011619,r =019775;(b )y 2=-010638x +110962,r =019986.215 DPPH 法和亚油酸氧化法测定植物叶片抗氧化能力的比较 亚油酸氧化法也是测定植物抗氧化能力的常用方法.用它和DPPH 法比较生长在不同光强下森林植物黧蒴和九节叶片的抗氧化能力(图4),可以看出两种方法的结果基本一致.随生长光强的增加,两种植物抗氧化能力都提高.自然光照下九节叶片的抗氧化能力大于黧蒴,而且光强对九节抗氧化能力的影响较黧蒴大,显示前者对光强的敏感性较高.由此结果进一步表证了DPPH 法研究植物抗氧化能力与植物种类及外界环境因子之间关系的可行性.图4 生长在不同光强下的植物提取物清除DPPH (a)和抑制亚油酸自动氧化(b)的变化□:黧蒴;■:九节. 综上所述,应用DPPH 法来评价外源抗氧化剂和植物抗氧化能力是一种快速(反应时间仅需20min左右)、简便(操作简单,且用一般的分光光度计即可测定)、灵敏(只需要少量的植物样品)、直接(抗氧化剂直接作用于DPPH自由基,测定DPPH吸收的变化,而其他许多方法都是间接测定氧化产物的减少)可行的方法.参 考 文 献1 Osawa T,Namiki M A.Novel type of antioxidant isolated from leaf wax of Eucalypt us leaves.Agric Biol Chem,1981,45(3): 735～7392 Ottolenghi A.Interaction of ascorbic acid and mitochondrial lipides.Arch Biochem Biophys,1959,79:355～3633 Cao G,Alessio H M,Culter R G.Oxygen2radical absorbance capacity assay for antioxidants.Free Radical Biol Med,1993,14(3):303～3114 Larrauri J A,Sanchez2Moreno C,Saura2Calixto F.Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape pomace peels.J Agric Food Chem,1998,46(7):2694～26975 Y okozawa T,Dong E,Natagawa T,et al.In vit ro and i n vivo studies on the radical2scavenging activity of tea.J Agric Food Chem,1998,46(6):2143～21506 林植芳,李双顺,林桂珠,等.水稻叶片衰老与超氧歧化酶、脂质过氧化的关系,植物学报,1984,26(6):605～615Lin Z F,Li S S,Lin G Z,et al.Acta Bot Sin,1984,26(6): 605～6157 翁元凯,黄 山,翁念宇.用碱性连二硫酸钠水溶液产生超氧阴离子自由基,生物化学与生物物理进展,1989,16(3): 209Wong Y K,Huang S,Wong L Y.Prog Biochem Biophys,1989, 16(3):2098 Cao G,Sofic E,Prior R L.Antioxidant capacity of tea and common vegetables.J Agric Food Chem,1996,44(11):3426～3431Detection of Antioxidative C apacity in Plants by Scavenging Organic Free R adical DPPH.PEN G Chang2Lian,CHEN Shao2Wei,L IN Zhi2Fang,L IN Gui2Zhu(South Chi na Instit ute of Botany,The Chi nese A cademy of Sciences,Guangz hou510650, China).Abstract A very significant linear relationship was found between the capacity of scavenging DPPH free radical and concentrations of six antioxidants(r= 01898～01994)determined by spectrophotometry. There was an obvious difference in the capacity of scavenging DPPH free radical among different antioxidants.Both scavenging DPPH and inhibiting the oxidation of adrenalin were closely related with the concentration of ascorbic acid.The change of DPPH levels is more sensitive than that of adrenalin in the presence of ascorbate.The antioxidative ability in leaves extracts of two woody plants grown under different light intensities was measured by either scavenging DPPH or inhibiting the oxidation of linoleic acid.The same conclusion was drawn through these two assays.It is suggested that scavenging DPPH free radical is a rapid,simple,sensitive and practical assay for the evaluation of antioxidative capacity in plants.K ey w ords 1,12diphenyl222picrylhydrazyl(DPPH), plant,antioxidative capacity,free radical中国生物化学与分子生物学会简讯 由中国生物化学与分子生物学会承办的第十五届亚洲大洋洲生物化学家和分子生物学家联合会(FAOBMB)学术会议于10月21日至24日在北京举行。
竹叶多糖提取分离及体外抗氧化自由基的研究
第49卷第6期2021年3月广州化工Guangzhou Chemical IndustryVol.49No.6Mar.2021竹叶多糖提取分离及体外抗氧化自由基的研究周先泰陈蓉1,齐娜▽(1桂林医学院药学院，广西桂林541000；2南方医科大学中西医结合医院，广东广州510315)摘要:探讨竹叶多糖含量及体外抗氧化能力。
水提醇沉法得到竹叶粗多糖。
Sevag法脱蛋白和D101大孔树脂分离纯化, DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯脐)法和邻苯三酚法对粗多糖抗氧化性进行研究。
研究发现粗多糖收率0.525%,蛋白含量占粗多糖37.71%。
0.66mg/mL对DPPH自由基清除效果最大，清除率55.23%。
多糖浓度0.107-0.301mg/mL范围，对超氧自由基的清除效果逐渐提升。
结果表明水提醇沉法提取竹叶粗多糖产率较好，具有较好的体外抗氧化活性。
关键词：竹叶多糖；水提醇沉法；抗氧化；DPPH法；邻苯三酚法中图分类号：R285.5文献标志码：B文章编号：1001-9677(2021)06-0080-05Extraction and Separation of Polysaccharides from Bamboo andStudy on Antioxidant Free Radicals in Vitro*ZHOU Xian-tai1,CHEN Rong1,QI Na12(1College of Pharmacy,Guilin Medical University,Guangxi Guilin541000；2Integrated Hospital ofTraditional Chinese Medicine,Southern Medical University,Guangdong Guangzhou510315,China)Abstract:The content of polysaccharide and antioxidant capacity in vitro were studied.The crude polysaccharide of bamboo was obtained by water extraction and alcohol precipitation.Sevag method was used to take off the protein and D101 macroporous resin to purification,the antioxidant activity of crude polysaccharides was studied by DPPH(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine)and o-phenylene three phenol method.The yield of bamboo polysaccharide by water extraction and alcohol precipitation was0.525%,and protein content accounted for37.71%of crude polysaccharide.When the solubility of crude polysaccharide was0.66mg/mL,the scavenging effect of DPPH radical was the highest,which was55.23%. When the solubility of crude polysaccharide was in the range of0.107~0.301mg/mL,the scavenging effect on superoxide radical was gradually improved.The results showed that the yield of crude polysaccharide from bamboo leaves was better by water extraction and alcohol precipitation,and crude polysaccharides had good antioxidant activity in vitro.Key words：Lophatherum Gracile Brongn polysaccharide;water extraction and alcohol precipitation；antioxidant; DPPH method；0-phenylene three phenol method竹子为禾本科(Gramineae)植物B,广泛分布于亚非大陆、南北美洲及太平诸岛地区，我国竹林资源占世界竹林资源的3%⑵。
用清除有机自由基DPPH法评价茶叶多糖的抗氧化活性
※基础研究
食品科学
2006, Vol. 27, No. 03 35
公司；其它试剂为国产分析纯。 １．２ 仪器
扫描型紫外可见分光光度计（ＵＶ－８５００ＰＣ） 天美科学 仪器有限公司；ＵＶ２０００ 紫外分光光度计 上海尤尼柯仪 器有限公司；ＤＫ－Ｓ２４ 型电热恒温水浴锅 上海精宏实验 设备有限公司；ＴＤＬ－５Ａ 离心沉淀机 上海安亭分析仪 器有限责任公司；ＲＥ－５２旋转蒸发仪 上海亚荣生化有限 公司；ＷＤ７００ＡＴＬ１７－３ 电脑型烧烤微波炉 Ｇａｌａｎｚ； ＳＹ３２００型超声波清洗器 上海声源超声波仪器设备有限 公司。 １．３ 茶叶多糖的提取精制
表 １ 不同产地、不同等级精制茶叶多糖的抗氧化活性 Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅａ
竹叶黄酮的提取、检测、分离、抗氧化活性及构-效关系的研究
摘要
竹叶黄酮是我国新开发的一种植物类黄酮制剂，由于其具有优良的抗自由基、 抗氧化、抗衰老、及保护心血管等方面的生物学功效，目前已受到国内外市场的 广泛关注。为了全面考察竹叶黄酮的性质，本论文采用天然的刚竹属毛竹叶为原 料，对竹叶黄酮的提取、含量检测、分离纯化、抗氧化活性及构-效关系等方面作 了较系统的研究，主要研究内容和实验结果如下：
II
英文摘要
the antioxidant activity-structure relationship of flavonoids. From the above series experiments, it was proved that the bamboo leaves
flavonoids was a excellent flavonoids prepration. The research provided important theoretical and pratical guidances for exploiting and using of bamboo resource. Key words: bamboo leaves flavonoids, extraction, enrichment, antioxidant,
近年来，自由基生命科学的进展，使具有强抗氧化和清除自由基作用的类黄 酮受到空前的重视。二十世纪 80 年代以来，有研究报导[4-5]从竹叶中提取食品防腐 剂、杀菌剂和叶绿素等；90 年代以来，人们开始关注竹叶中黄酮类化合物的存在 及其生物学活性[6-9]。1998 年，我国研究人员在借鉴国内外植物黄酮提取方面的各 种专利技术的基础上，结合竹叶中黄酮类化合物存在的特点，创造了经济、适用、 独特的提取工艺，获得了国家发明专利，并率先在浙江实现了产业化生产，至此， 竹叶黄酮提取物正式面世。同年，(淡)竹叶被卫生部正式批准列入了“药食两用的 天然植物名单”[10]。1999 年竹叶黄酮获国家级新产品证书，其衍生产品---竹康宁 胶囊获卫生部保健食品批文，竹叶啤酒和竹叶饮料等也纷纷上市[11]。
DPPH法评价抗氧化活性研究进展_韦献雅
DPPH法评价抗氧化活性研究进展韦献雅1，殷丽琴1，钟 成2，章明海1，牛应泽1,*（1.四川农业大学油菜研究中心，四川 成都611130；2.四川农业大学玉米研究所，四川 成都611130）摘 要：植物化合物或植物提取物的抗氧化活性的体外评价是研究功能因子的一个重要方面。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ，DPPH ）法常用于评价化合物或植物提取物的抗氧化活性，但由于没有一个标准化的方法，因而不同实验的结果难于相互比较。
本文从DPPH 法的原理、测定方法、检测波长、DPPH 初浓度、反应时间、清除率计算公式、结果表达、评价指标等几个方面对DPPH 法做归纳总结，分析几种外界因素对DPPH 法的影响，有助于研究者提高认识，从而准确的开展研究工作。
关键词：DPPH 法；自由基；抗氧化剂；抗氧化活性Advances in the DPPH Radical Scavenging Assay for Antioxidant Activity EvaluationWEI Xian-ya 1, YIN Li-qin 1, ZHONG Cheng 2, ZHANG Ming-hai 1, NIU Ying-ze 1,*(1. Rapeseed Research Center, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;2. Maize Research Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)Abstract: in vitro evaluation of the antioxidant activity of plant compounds or plant extracts is an important aspect of functional factor research. The DPPH (1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical scavenging assay is widely used for antioxidant activity evaluation of plant compounds and extracts. However, this method lacks a standardized program so that results from different experiments may be difficult to compare with each other. The present review presents a comprehensive overview of the principle, measurement procedure and wavelength, initial DPPH f ree radical concentration, reaction time, calculation of the scavenging rate, expression of results and evaluation indices. Several external factors influencing the DPPH assay are also discussed.Key words: DPPH method; free radical; antioxidant; antioxidant activity 中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）09-0317-06doi:10.7506/spkx1002-6630-201409062收稿日期：2013-06-25基金项目：四川省科技计划项目（12CGZHZX0712）；四川省教育厅重点科技项目（11LD018）作者简介：韦献雅（1980—），女，博士研究生，研究方向为作物遗传育种。
天然产物抗氧化活性的筛选方法及应用
天然产物抗氧化活性的筛选方法及应用
一、筛选方法
1、DPPH自由基清除试验：DPPH自由基清除试验是用来检
测天然产物的抗氧化活性的一种常用方法，它可以测量天然产物抗氧化活性的强弱。
该方法的原理是利用天然产物中的抗氧化剂将DPPH自由基进行清除，从而检测天然产物的抗氧化
活性。
2、FRAP试验：FRAP试验也是一种检测天然产物抗氧化活性的常用方法，它可以测量天然产物抗氧化活性的强弱。
该方法的原理是利用天然产物中的抗氧化剂将Fe3+还原为Fe2+，从
而检测天然产物的抗氧化活性。
3、ABTS自由基清除试验：ABTS自由基清除试验也是一种
检测天然产物抗氧化活性的常用方法，它可以测量天然产物抗氧化活性的强弱。
该方法的原理是利用天然产物中的抗氧化剂将ABTS自由基进行清除，从而检测天然产物的抗氧化活性。
二、应用
1、食品抗氧化剂：天然产物的抗氧化活性可以用来制备食品
抗氧化剂，以延缓食品的氧化变质，延长食品的保质期。
2、医药抗氧化剂：天然产物的抗氧化活性可以用来制备医药
抗氧化剂，以防止药物氧化变质，延长药物的保质期。
3、保健品抗氧化剂：天然产物的抗氧化活性可以用来制备保
健品抗氧化剂，以防止保健品氧化变质，延长保健品的保质期。
DPPH法分析测定生地和熟地清除自由基的能力_桂语歌
辽宁中医杂志 2011 年第 38 卷第 9 期
·1867·
超声提取 2 次，提取时间为 30min，过滤，合并滤液，减 压回收溶剂至干，用 4mL 甲醇溶解，得样品。 1. 2. 2 不同提取方法 精密称取生地和熟地药材粉 末 4 份，每份约 2g，80% 乙醇 50mL 为提取溶剂，分别 采用回流、常温超声，冷浸 3 种提取方法提取 2 次，提 取时 间 为 30min，过 滤，合 并 滤 液； 另 一 份 样 品 采 用 ASE 快速溶剂萃取方法提取，以 80% 乙醇作为提取溶 剂，提取温度 40℃ ，提取时间 5min，静态提取 2 次，过 滤，合并滤液。将过滤后的样品减压回收溶剂至干，分 别用 4mL 甲醇溶解，得样品。 1. 3 样品总多酚含量测定
生地和熟地药材购于长春仁德医药； Folin － Ciocalteu 试剂，没食子酸标准品，2，2 － diphenyl － 1 － picrylhydrazyl （ DPPH ·） 试 剂 购 自 Sigma Chemical Co. 公司 （ St. Louis，Mo） ； 实验所用试剂均为分析纯，购于 北京北化精细化学品有限责任公司； 水为超纯水 18. 2 ΩPa。 1. 2 样品制备 1. 2. 1 不同溶剂提取 精密称取生地和熟地药材粉 末 5 份，每份约 2g，置于具塞锥形瓶中，分别加入乙酸 乙酯、正丁醇、丙酮、无水乙醇、80% 乙醇 50mL，常温下
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第28卷,第7期 光谱学与光谱分析Vol 128,No 17,pp1578215822008年7月 Spectroscopy and Spectral Analysis J uly ,2008 用清除有机自由基DPPH 法评价竹叶提取物抗氧化能力郭雪峰,岳永德3,汤 锋,王 进,姚 曦国际竹藤网络中心,国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室,北京 100102摘 要 通过对1,12二苯基苦基苯肼(DPP H )溶液吸收光谱、DPP H 溶液反应体系的研究,得出以下结论,分光光度法测定DPP H 溶液反应体系的测定波长为51814nm ,反应体系为4100mL 25717mg ・L -1的DP 2P H 溶液中加1mL 不同浓度的抗氧化剂,反应体系加入抗氧化剂后反应时间为40min ;用上述方法研究评价合成抗氧化剂叔丁基对苯二酚(TB HQ )和2,62二叔丁基对甲酚(B H T )对DPP H 自由基清除率和浓度的关系,以IC 50值(清除率为50%时,抗氧化剂的浓度值)作为评价指标,测得合成抗氧化剂和效果最好竹叶提取物样品IC 50值分别为,TB HQ (21114mg ・L -1),B H T (42109mg ・L -1),M40(108140mg ・L -1),M40等竹叶提取物可以作为天然抗氧化剂进行开发。
关键词 竹叶提取物;1,12二苯基苦基苯肼;清除率;IC 50值中图分类号:TS20112 文献标识码:A 文章编号:100020593(2008)0721578205 收稿日期:2007209208,修订日期:2007212218 基金项目:国家“十一五”科技支撑项目(2006BAD19B08)和国际竹藤网络中心基本科研业务费专项资金(06/072B14)资助 作者简介:郭雪峰,1972年生,国际竹藤网络中心讲师 3通讯联系人 e 2mail :yueyd @引 言 竹叶作为一种“药食两用的天然植物”已被广大消费者所接受,竹叶提取物主要功能性成分为竹叶黄酮糖苷,具有抗氧化和抑菌活性,可以作为一种生物黄酮类保健营养素进行开发,前景广阔。
迄今为止,国内外用于评价植物抗氧化能力的方法已有很多,如硫氰酸盐(thiocyanate )法[1]、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid ,TBA )法[2]、抗氧化能力指数法(oxygen radicalabsorbance capacity ,ORAC )[3]、化学发光法[4]等,还有很多清除自由基的检测评价方法[528],这些方法都有各自的不足之处。
1,12二苯基苦基苯肼(1,12Diphenyl 222picrylhydrazyl ,DPP H )检测法是通过分子中1个稳定的DPP H 自由基与抗氧化剂提供的1个电子配对结合,使DP 2P H 的特征紫色消失,因此可用于抗氧化剂清除自由基能力的评价。
近年来,国内外已有人初步利用DPP H 溶液的紫红色吸光度变化作为清除自由基能力的分光光度测定[9212],但其准确性、灵敏度和可行性还需进一步系统的探讨。
1 材料和方法111 仪器和试剂Ultrospec 3300pro 分光光度计,英国Biochrom 公司;1,12二苯基苦基苯肼(DPP H ),Fluka 公司;叔丁基对苯二酚(TB HQ ),北京科华特种试剂朕合开发中心;2,62二叔丁基对甲酚(B H T ),国药集团化学试剂有限公司;乙醇、AB 28大孔树脂等均为国产分析纯试剂。
112 竹叶材料及前处理方法毛竹(phy llostachys edulis )叶于2006年9月采自江苏南京林业大学竹种园。
取6000g 毛竹叶粉,95%乙醇,温度60℃,回流提取4次,提取液过滤浓缩得竹叶提取物浸膏。
竹叶提取物浸膏溶解于95%乙醇后过AB 28大孔树脂柱,分别用纯水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、丙酮洗脱,水洗脱组分弃用,其他洗脱组分浓缩得干膏,备用。
各洗脱组分分别简称如下:M20,毛竹叶提取物浸膏过AB 28大孔树脂柱,水洗脱后,20%乙醇洗脱下组分;M40,20%乙醇洗脱后,40%乙醇洗脱下组分;M60,40%乙醇洗脱后,60%乙醇洗脱下组分;M80,60%乙醇洗脱后,80%乙醇洗脱下组分;MA ,80%乙醇洗脱后,丙酮洗脱下组分。
113 溶液配制11311 样品试液的配制分别称取合成抗氧化剂叔丁基对苯二酚(TB HQ )012669g ,2,62二叔丁基对甲酚(B H T )013186g ;再分别称取样品M20013207g ,M40013073g ,M60013200g ,M80012952g ,MA 012974g ,用95%乙醇定容到100mL ,得到溶液质量浓度值分别为,TB HQ 21669mg ・mL -1,B H T 31186mg ・mL -1,M2031207mg ・mL -1,M4031073mg ・mL -1,M6031200mg ・mL -1,M8021952mg ・mL -1,MA 21974mg ・mL -1,待测。
11312 DPP H 溶液的配制准确称取DPP H 试剂011288g ,用95%乙醇溶解定容至500mL 容量瓶中,得浓度为25717mg ・L -1DPP H 贮备液(615×10-4mol ・L -1),摇匀置于冰箱中冷藏备用。
114 清除DPPH 自由基能力的测定步骤(1)在10mL 比色管中依次加入410mL 25717mg ・L -1DPP H 溶液和110mL 95%乙醇,混匀反应稳定后,以95%乙醇液为参比,在λmax 处测吸光值,记为A 0。
(2)在10mL 比色管中依次加入410mL 25717mg ・L -1DPP H 溶液的溶剂(95%的乙醇溶液)和110mL 待测试样溶液,混匀反应稳定后,以95%乙醇液为参比,在λmax 处测吸光值,记为A r 。
(3)在10mL 比色管中依次加入410mL 25717mg ・L -1DPP H 溶液和110mL 待测试液,混匀反应稳定后,以95%乙醇液为参比,在λmax 处测吸光值,记为A s 。
(4)计算自由基清除率(Y ),按式(1)计算。
Y (%)=1-As -A rA 0×100(1)2 结果与分析211 DPPH 的吸收光谱与测定波长的确定每个DPP H 分子在溶液中可生成一个稳定的含氮自由基,具有典型紫色,当它与提供1个电子的自由基清除剂作用时,生成无色产物,使溶液的典型紫色变浅。
对有机自由基DPP H 溶液在200～700nm 处进行全波长扫描。
从图1可以看出,有机自由基DPP H 溶液有两个特征吸收峰32719和51814nm ,加入抗氧化剂叔丁基对苯二酚(TB HQ )、2,62二叔丁基对甲酚(B H T )后两个吸收峰皆降低,加入M40后32719nm 吸收峰被M40成分吸收峰履盖,但51814nm 吸收的降低较显著,故51814nm 处吸收峰的变化可以反应抗氧化剂清除自由基的情况,选用可见光51814nm 的吸收峰的变化来表示DPP H 含量的变化,用以评价竹叶提取物的抗氧化能力,这与Larrauri [9]等和陈丛瑾[13]等报道DPP H 吸收峰在517nm 基本一致,与彭长连等[14]报道的525nm 略有差异。
Fig 11 Absorb ancy spectra of DPPH212 DPPH 溶液吸光值与浓度关系分别取25717mg ・L -1DPP H 贮备液4,2,1mL ,稀释5倍的DPP H 贮备液4,2和1mL ,用95%乙醇稀释定容至5mL ,配成浓度梯度为206116,103108,51154,41123,20162和10131mg ・L -1的DPP H 溶液,测吸光值(A )。
以A 对DPP H 浓度(c )作图,得A 与c 线性关系方程A =010243c -010574,r 2=019953。
由图2可以看出,DPP H 的吸光值和它的浓度有很好线性相关,吸光值可以反应其浓度的变化。
Fig 12 Linearity correlation betw een DPPHconcentration and absorb ancy213 DPPH 溶液稳定性试验为了解DPP H 反应体系在加入抗氧化剂和M40后吸光值(A 51814)随时间的变化规律,用高浓度和低浓度DPP H 反应体系进行测定。
高浓度体系是在3个410mL DPP H (25717mg ・L -1)溶液中分别加入110mL TB HQ (11335mg ・mL -1),B H T (11593mg ・mL -1),M40(11537mg ・mL -1),A 51814值随时间变化规律(图3);低浓度体系是在3个410mL DPP H (51154mg ・L -1)溶液中分别加入110mL TB HQ (012669mg ・mL -1),B H T (013186mg ・mL -1),M40(013073mg ・mL -1),A 51814值随时间变化规律(图4)。
从图3和图4可以看出,加入TB HQ 后,DPP H 反应体系的A 51814很快达到稳定状态;加入B H T 或M40后,DPP H 反应体系A 51814值在最初20min 内下降较快,在20～30min 内A 51814值变化缓慢,40min 后A 51814值达到稳定状态,说明无Fig 13 Curves of high concentration DPPH absorb ancy withrespect to time after addition of antioxid ant1:TB HQ ;2:B H T ;3:M409751第7期 光谱学与光谱分析Fig 14 Curves of low concentration DPPH absorb ancy withrespect to time after addition of antioxid ant1:TB HQ ;2:B H T ;3:M40论加入哪种抗氧化剂,40min 后反应体系的A 51814值都趋于稳定,所以选择DPP H 与抗氧化剂反应的时间为40min ,由于DPP H 反应体系在加入抗氧化剂后,吸光值降低,所以选浓度高的反应体系。
214 两种合成抗氧化剂的抗氧化能力及其评价方法分别对合成抗氧化剂叔丁基对苯二酚(TB HQ )、2,62二叔丁基对甲酚(B H T ),逐级稀释,按114节方法进行测定,计算抗氧化剂对DPP H 的清除率,以清除率Y 对抗氧化剂浓度c 作图。