分子生物学讲义2012版

内部资料，严禁外传【】分子生物学实验‡马伟超编写2012年7月天水师范学院生命科学与化学学院分子生物学实验室‡这份文档可能包含了多人拥有的专利或版权，或者未决专利应用的相关内容和素材提供这份文档给使用者并不意味着对这些专利的任何授权。

版权所有©马伟超Copyright ©Weichao Ma《分子生物学实验》注意事项1.上实验课的学生需提前5分钟到实验室，完成穿着实验服，整理实验台面，清点实验器材，上交实验报告及预习报告等事宜。

迟到的同学取消当次实验资格！2.课前要提前预习实验内容，弄懂实验设计的原理，理清实验顺序，认真撰写预习报告。

并在每次实验前上交，没有预习报告的同学不能进入实验操作。

3.本实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。

实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，必须按时完成。

4.实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！学期内不定期核查实验记录，没有记录者本课程成绩按零分计。

5.对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作。

在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。

实验时损坏或丢失的任何物品都要及时申报，一经发现故意隐瞒的情况则按采购价赔偿！6.写作实验报告和实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻（包括操作的错误）。

7.在实验室内不能大声喧哗，嬉戏以及饮食。

8.在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。

9.实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验室。

10.值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。

值日完毕并签到后方可离开实验室。

《分子生物学实验》教学要求一、实验教学的指导思想和教学目的1.指导思想：分子生物学是生命科学的基础学科之一，其基本理论和实验技术已渗透到生命科学的各个领域，并促进了一批新学科的兴起和发展，使生命科学的各个领域发生了根本性转变。

因此，在掌握基本分子生物学理论的基础上，为培养学生在分子生物学技术方面的实际动手能力，我们开设本实验课程。

2.教学目的：通过实验原理的讲解和实验操作，使学生初步了解和熟悉现代分子生物学实验的基本原理、操作方法和实际应用，提高学生的创新思维和独立分析问题解决问题的能力。

二、实验教学的基本要求通过本课程的学习和操作，并结合理论教学，要求学生熟练掌握下列分子生物学实验技术：染色体DNA的提取，质粒DNA的分离及纯化，琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增，大肠杆菌感受态细胞的制备和转化等。

三、实验教材及参考书目：1.《生物化学与分子生物学实验技术教程》安建平，王廷璞编，2005，兰州大学出版社2.《分子生物学实验指导》魏群主编，1999，高等教育出版社3.《分子克隆实验指南》 J.萨姆布鲁克，1999，科学出版社4.《基因工程实验指导》朱旭芬编，2006，高等教育出版社四、实验考核办法:1.通过对学生的平时成绩（包括实验态度、实验室常识、出勤情况等）、预习报告、实验报告、实验操作、实验理论等几方面进行考核综合评定。

各部分所占比例如下：考核项目平时成绩预习报告实验报告（论文）实验操作实验理论2015 40 20所占比例（%） 5五、实验项目表序号实验项目名称学时1 细菌基因组DNA提取 42 碱裂解法提取质粒DNA 43 限制性核酸内切酶消化DNA及琼脂糖凝胶电泳 64 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒的转化 65 PCR基因扩增 4目录实验一细菌基因组DNA的制备 (1)实验二碱裂解法提取质粒DNA (4)实验三限制性核酸内切酶消化DNA及琼脂糖凝胶电泳 (8)实验四大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒的转化 (14)实验五 PCR基因扩增 (17)附录一如何设计PCR引物 (20)附录二实验安全及防护 (30)实验一 细菌基因组DNA的制备一、目的和要求(1)了解与掌握从细菌细胞中提取DNA 的原理和方法。

(2)学习原核细胞与真核细胞DNA 提取的异同。

二、原理要进行重组DNA 实验，就离不开外源基因的纯化，而外源基因主要来源之一就要直接从生物的染色体DNA上制备，所以制备高质量的染色体DNA样品经常为基因工程实验所需要，抽提细菌染色体DNA的方法目前已有许多种，这里所介绍的两种方法：一适用于枯杆菌染色体的抽提；另一种方法则适用于大肠杆菌染色体的制备。

基因工程实验所需要的基因组DNA 通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA 并非易事。

细菌基因组DNA通常是个很大的环状DNA，而在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必然会将DNA切断，如果要抽提到大的DNA分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程要尽可能在低温下进行。

另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。

另外制备的细菌染色体DNA必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要。

制备的样品必须没有蛋白污染，没有RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都应考虑到。

大肠杆菌染色体DNA 抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）破裂细胞。

SDS的主要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；（2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体DNA上的蛋白质；（3）SDS 能与蛋白质结合成为R1—O—SO3R2—蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净，以免影响下一步RNase的作用。

破细胞后RNA经RNase消化除去，蛋白质经苯酚：氯仿：异戊醇抽提除去经乙醇沉淀回收DNA。

枯草杆菌染色体制备与上类似，但略加修改的方法要适合教学要求。

枯草杆菌是革兰氏阳性菌，所以在SDS处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁。

溶菌酶是一种糖苷水解酶，它能水解菌体细胞壁的主要化学成份肽聚糖中的β—1,4糖苷键，有助于细胞壁破裂。

破裂的细胞壁在SDS的作用下溶菌，同时用蛋白酶K消化蛋白质，能解离缠绕在染色体DNA上的蛋白质。

然后加入一定量的醋酸钾，使蛋白质变性，通常离心除去，在这期间可加入核糖酸酶消化RNA，最后用乙醇回收DNA。

这两种方法抽提的细菌染色体DNA，无RNA和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子再克隆等。

在本实验中还使用了CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。

通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

但在下一步实验前，必须测定其DNA的纯度、含量以及相对分子质量的大小。

测定核酸通常采用两种方法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法（详见实验五）。

DNA或RNA定量时，应在260nm和280nm两个波长下读数。

根据计算在260nm波长下，每lµg/mL DNA钠盐溶液的A值为0.20，即在A260＝1时，双链DNA含量为50µg/mL，单链DNA与RNA含量为40µg/mL，单链寡核苷酸的含量为33µg/mL。

双链DNA含量＝A260×50×稀释倍数(µg/mL)RNA含量＝A260×40×稀释倍数(µg/mL)单链DNA含量＝A260×33×稀释倍数(µg/mL)此外还可根据在260nm和在280nm的读数间的比值(A260/A280)估计核酸的纯度。

根据经验数据，纯核酸溶液A260/A280为2，即当样品DNA及RNA的A260/A280为1.8—2.0时，认为已达到所要求的纯度。

在样品中含有蛋白质或苯酚等杂质时，会使A260/A280的比值下降，明显低于上述值，此时无法对样品中的核酸进行精确定量。

三、试剂与器材1.菌株：大肠杆菌（DH5α）。

2.试剂：[1]LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL ddH2O搅拌完全溶解，用约200μL 5M NaOH调pH至7.0，加ddH2O至1L，121℃ 20min 灭菌[2]CTAB/NaCl 溶液4.1g NaCl 溶解于80ml H2O，缓慢加入10g CTAB，加水至100ml[3]氯仿：异戊醇(24∶1，v/v)∶∶，v/v)[4]苯酚：氯仿：异戊醇(25241[5]异丙醇[6]70% 乙醇(v/v)[7]TE：10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0。

【1mol/L Tris-HCl（pH8.0）1ml，0.5mol/LEDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。

】[8]10% SDS：称取100g SDS 慢慢转移到约含900ml 水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解，用水定容至1L。

[9]蛋白酶K (20mg/ml 或粉剂)：将200mg 的蛋白酶K加入到9.5ml 水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解（不要涡旋混合），加水定容至10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。

[10]5mol/L NaCl：溶解29.2g NaCl 于足量的水中，定容至100ml。

3.器材微量移液器、旋涡混合器、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅四、操作方法(1)从平板培养基上挑选单菌落接种至5mL的液体LB培养基中，37℃振荡培养过夜至饱和状态（OD600≈1）(2)取1mL的培养物于Eppendorf管中，5000 rpm离心2min，尽可能弃去上清液。

重复本操作一次。

(3)沉淀物中加入567µL的TE缓冲液，使其重新充分悬浮（注意不要残留细小菌块）。

(4)加入30µL的10%的SDS和3µL 20mg/ml的蛋白酶K，混匀。

于37℃温育1h。

(5)加入100µL的5mol/L NaCl，充分混匀（见注意事项1）。

(6)再加入80µL CTAB/NaCl溶液，缓慢上下颠倒混合10次左右，于65℃温育10min。

(7)加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）(见注意事项2)，缓慢颠倒混匀20次左右。

12000 rpm离心5min。