转白介素2基因促使S180细胞的贴壁生长

参 考 文 献
1 T aga T , K ish imot o T. S ignal ing mech anis ms t h rough cytok ine recept ors t hat share signal t ransd ucing recept or comp on ent s . C urr O pin Immun o, 1995, 7: 17
白 介 素 2 活 性测 定: 选用 T CL L 细胞作为效应细 胞, 计 T CL L 细胞数, 加入转白介素 2 基因的 S-180 细胞的上清液, 与加白介素 2 标准样品培养 T CL L 细胞组比较, 计算出转白介素 2 基因的 S-180 细胞 分泌白介素 2 蛋白的产量。
NeoR 基因 以及白介素 2 基因的 PCR 检测: 将原始 S180 经转白介素 2 基因后悬浮和贴壁生长的两组 S180, 共三组细胞分别进行培养, 收集细胞, 提取大分 子 DNA, 以这三组 DNA 作为模板, 分别作 NeoR, 白介素 2 基因的 PCR 扩增。PCR 条件为: 94℃5 分 钟, 然后 72℃、94℃、57℃各 1 分钟。35 个循环反应, 最后 72℃延长 10 分钟。反应系统为 50Ll、5Ll、10× 缓 冲 液, 两 对 引 物 分 别 是 50pm ol, dNT P 为 2. 5mmo l, DNA 模板 1Lg , 加双蒸水到 50Ll, 加石腊 油 50Ll 封闭反应系统。反应结束后, 经 6% 聚丙烯酰 胺凝胶电泳鉴定。
扫描 电镜 型号: JEOL 840 细胞 培 液 RPM I 1640 等。
方法 转基 因法: 原始 S-180 细胞 取自小鼠 腹 水, 经体外培养数代后, 复注入小鼠腹腔以及皮下, 均可长出肿瘤。继续细胞培养 30 代以上, 细胞保持 悬浮生长的特性。当 S-180 细胞长到 1. 2×106 细胞 数/ 10ml 培液, 加入含白介素 2 基因的逆转录病毒 200Ll ( 病 毒 滴 度 为 3 × 105CF U/ m l ) , 加 入 Po lyberene 终浓 度为 8Lg/ ml , 加入 1640 培液 ( 含 20% 小牛血清) 5ml。37℃, 5% CO 2 培养, 过 6 小时后再补 加 1640 培液 5ml , 总体积 10ml 。24 小时后, 每培养 瓶中加入 G418 0. 8m l 浓度为 15m g/ m l。每次做 2 个培养瓶, 每 3 天换 1 次培液, 观察细胞生 长。加 G418 之后, 细胞开始大量死亡, 经过 12 天只见少数
转 IL-2 基因的 S180 细 胞为扁平 状, 并有伪 足伸出, 微 绒 毛丰富明显变细变长, 并可稳定传代。其余株仍为悬浮生长, 细胞呈椭圆 球状。 结论 原为 悬浮生长的 S-180 细胞, 经 转入 IL-2 基因后, 部分细 胞伸出伪足及发生 微绒毛变化, 是 细胞贴壁生长的形态基础。
图 2 转白介 素 2 基因后, 部分 S 180 细胞贴壁生 长( 箭头所 指) , 其 微绒毛变细长, 细胞扁平, 有伪足伸出。
扫描电镜观察结果: 原 S-180 细胞, 呈椭圆形, 表面
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关键词 白介素-2 小鼠肉瘤 S180 转基因
INFLUENCE ON GROWTH FORM OF S180 CELLS TRANSDUCED WITH IL-2 GENE Shen Zhaoz hong, Zheng Songguo, L uo J ianmin et al. Cancer H osp ital , Shanghai Univer si ty of Medical Sci ences, S hanghai 200032
少皱襞或指状突起。转基因后, 部分贴壁生长的 S180 细胞呈扁平, 有伪足伸出, 微绒毛变细变长的特 征明显( 见图 2) 。转基因后, 偶尔发现一些细胞呈椭 圆, 表面有大小不一圆球状突起, 可能为凋亡细胞形 态。
图 3 转白介素 2 基因 后状 突起, 可能是凋亡细胞( 箭头所指) 。
作者单位: 1. 上海医科大学附属肿瘤医院 ( 上海 200032) 2. 上海市肿瘤研究所 3. 华东医院
录因子, 并可能改变细胞的骨架系统结构而影响细 胞的各种功能和性状[ 1] 。本实验观察到小鼠 S-180 悬浮生长细胞, 经转入人的白介素 2 基因后, 部分细 胞可获得贴壁生长的特性, 该特性可稳定地传代, 我 们用扫描电镜进行观察, 分析其贴壁生长的形态基 础。
图 1 PCR 电泳结果 M : 123bp D N A Ladd er marker 1～4: 转白介素 2 基因之 S180 细胞, 其中 1, 2 为悬浮生长的细胞, 3, 4 为贴壁生长的 细胞。1, 3 在 790bp 处 显示有 N eoR 基因条 带, 2, 4 在 457bp 处出现白介素 2 基因条带。 5, 6: 原始 S 180 细胞, 未转基因, 未见 N eoR 或白介素 2 基因条带。
Key words Interleukine-2 Mouse sarcoma S180 Transduced gene
TUMOR ( Shanghai) 1997, 17: 142
由于分子生物学的发展, 运用转基因方法研究 细胞功能的报道大量涌现。白介素 2 可以通过细胞 表面受体结合, 经过细胞信号传递系统, 激活细胞转
2 张腾飞, 孙 欲晓, 陈诗书. IL -2 基因修 饰鼠肝癌 细胞引起 的凋亡 之研究。中国肿瘤生物治疗杂志, 1995, 2( 1) : 44
3 Triozz i PL, Eicher DM , Rinehart JJ et al. M odul at ion of adhes ion molecules on hum an large gran ular lymphocytes by IL-2 in vivo and in vit ro. Cel l-Immunol , 1992, 140( 2) : 295
结果与讨论
PCR 测定结果: ( 见图 1) 悬浮细胞( 1, 2 电泳道) 和 贴 壁细胞( 3, 4 电泳道) , 均出现 NeoR 和白介 素 2 基因条带, 而原始 S-180 则未见此两条带, 说明本次 实验细胞株具有转入的基因。
测 定细胞分泌 的白介素 2 活性: 以白介素 2 依赖细 胞 T CLL 为效应细胞, 在 T CL L 中加入转白介素 2
倒置显微镜观察结果: 因转白介素 2 基因引起贴壁 生长的细胞已牢牢地贴壁, 只有经 0. 25% 胰蛋白酶 消化才能使细胞脱壁。细胞是以重叠方式生长, 重叠 到一定程度, 某些细胞会脱离而漂浮在培液中; 但这 些暂时悬浮起来的细胞如移入新的培养皿中, 又会 贴壁生长; 原始 S-180, 以及转基因后仍悬浮生长的 S-180 细胞不具有这种特征。
基因 S-180 的培养上清液, T CL L 便能维持生长, 若 只加 1640 培液, T CL L 过夜便死亡。因此, 经 P CR 和白介素 2 活性测定表明, 转基因后的 S-180 不论 贴壁生长或悬浮生长, 白介素 2 基因已被整合入 S180 细胞, 且具有该基因表达产物。与标准样品比 较, 测得本次分泌白介素 2 活性为 24 小时, 10m l, 150U / 107 细胞数。
材料与方法
细胞 株 小鼠肉瘤模型 S-180 由中科 院药物所 提供。S180 细胞经腹水或皮下接种传代, 小鼠白介 素-2 依赖细胞( T CL L ) 细胞购自细胞所。
试剂及仪器 含人源白介素 2 基因的逆转录病毒 质粒 pL ( IL 2) SN ( 待发表) 。G418( Sig ma 公司) 。测 白介素 2 基因的 P CR 引物序列为:
转白介素 2 基因会引起细胞微绒毛变细、变长 已见张腾飞[ 2] 等报道, 但细胞变得扁平, 并有伪足伸 出, 由悬浮变成贴壁生长, 则未见正式报道。美国耶
鲁大学秦樾教授在个人通讯中提到他们在悬浮细胞 中, 加入白介素类蛋白, 观察到细胞有贴壁现象。因 此, 白介素可通过不同的途径, 影响细胞的生长特性 并不是偶然现象。作者考虑, 转白介素 2 基因后, 可 能触发了细胞信号传递系统, 从而引起一系列细胞 结构改变[ 3] , 诸如, 细胞骨架, 粘附分子[ 4] , 选择素等 等的变化。本实验结果为深入研究肿瘤细胞信号传 递特征提供极好的研究材料。也可能为揭示一些未 知的细胞现象打下基础。
5′A T G T A C A G G A TG C A A CT C CT G T CTT 5′CG A TT T CG T A G T A G A GT T G TG A CT G
测新霉素抗性基因( N eoR) P CR 引物序列为:
5′CA A G A T G GA T TG C A C G CA G G3′ 5′CTG CT C A A G A A G A CT C GCC C3′
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转白介素 2 基因促使 S180 细胞的贴壁生长
沈兆忠1 郑颂国1 罗建民1 章月星2 陆孝禹3 曹世龙1
目 的 研 究转 IL-2 基 因对 S-180 细 胞 贴壁 生长 的 影 响。 方法 光镜及扫描电镜观察细胞生长 的特征。 结果
肿瘤 1997 年 5 月( 第 17 卷第 3 期)
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存活细胞。将这些细胞再培养 10 天, 经有限稀释法, 将上述细胞种入 96 孔板, 仍然用含 G418 的 1640, 37℃, 5% CO2 条件培养。经过 1 周后, 将形成克隆的 细胞挑出, 保留 4 株长得较好 的细胞, 继续进行培 养。在培养过程中发现有 1 株细胞贴壁生长。倒置 显微镜下每天观察细胞, 可观察到细胞是重叠方式 生长。而其他三株无贴壁生长现象。作为对照研究, 液氮冻存贴壁与不贴壁的两株细胞。