超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定猪尿中金刚烷胺与金刚乙胺的残留量
液相色谱串联质谱法同时测定动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺残留量
◎陈
鑫
福州 ３ ５ ０ ０ ２ ５）
（ 福 州 市 产 品质 量检 验 所 ，福 建 ｕ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ Ｑｕ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ Ｍ ｏ ｎ ｉ ｔ ｏ ｒ ｉ ｎ ｇ Ｂ ｕ ｒ ｅ ａ ｕ ， Ｆ ｕ ｚ ｈ ｏ ｕ ３ ５ ０ ０ ２ ５ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
Ｅ ＳＩ ＭＳ／ ＭＳ ｕ ｎ ｄ ｅ ｒ ｍｕ ｌ ｔ ｉ ｐ ｌ ｅ ｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｏ ｎ ｉ ｔ ｏｒ ｉ ｎ ｇ ｍｏ ｄ ｅ， ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｌ ｉ ｍｉ ｔ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ０． ５￣ ． ｇ ／ ｋ ｇ ， ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｖ ｅ ｒ ｉ ｅ ｓ ｒ ａ ｎ ｇ ｅ ｄ ７ ６ － ７ ％ ～ １ １ ８ ． ７ ％， ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ ａ ｒ ｄ ｄ ｅ ｖ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｒ ａ ｎ ｇ ｅ ｄ １ ＿ ７ ％ ～ ６ ． ８ ％． Ｔ ｈ ｉ ｓ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｈ ａ ｓ ｔ ｈ ｅ ｍｅ ｒ ｉ ｔ ｓ ｏ ｆ ｌ ｏ ｗ ｌ ｉ ｍｉ ｔ ｏ ｆ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ，ａ ｎ ｄ ｉ ｔ ｗｉ ｌ ｌ ｈ ａ ｖ ｅ ａ ｐ ｒ ｏ ｍｉ ｓ ｉ ｎ ｇ ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ｏ ｒ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｉ ｎ ｇ ｒ ｅ ａ ｌ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ．
Ａｂｓ ｔ ｒ ａｃ ｔ：Ａ ｍｅ ｔ ｈ ｏｄ ｆ ｏｒ ｓ ｉ ｍｕ ｌ ｔ ａｎ ｅｏｕ ｓ ｄｅ ｔ ｅｒ ｍｉ ｎ ａｔ ｉ ｏｎ Ｏ ｆ ａｍａｎ ｔ ａｄｉ ｎ ｅ ａ ｎｄ ｒ ｉ ｍａｎ ｔ ａｄｉ ｎ ｅ ｉ ｎ Ｆ ｏｏ ｄ Ｏ ｆ ａｎ ｉ ｍａＩ
超高效液相色谱-串联质谱法检测猪尿中20种β-受体激动剂残留
［ 收稿 日 期］ ２ ０ １ ３ — ０ ８ — ２ ６ ［ 文献标识码 ］ Ａ ［ 文章编号 ］ １ ０ ０ ２ — １ ２ ８ ０（ ２ ０ １ ３ ） １ ２－ ０ ０ ５ ０ 一 ｏ ７ ［ 中图分类号］ ￥ ８ ５ ９ ． ８ ４
ｒ ａ ｃ ｔ ｏ ｐａ ｍｉ ｎ ｅ ｅ ｌ ｅ ｎｈ ｅ ｘ ｅ ｒ ｏ ｌ ｃ ｌ ｅ ｎ ｂ ｕ ｔ ｅ ｒ ｏ ｌ ｔ ｕ ｌ ｏ ｂ ｕ ｔ ｅ ｒ ｏ ｌ ｆ ｏ ｒ ｍｏ ｔ ｅ ｒ ｏ ｌ 、 ｂ ｒ ｏ ｍｂ ｕ ｔ ｅ ｒ ｏ ｌ ｃ ｌ ｅ ｎ ｐ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｌ 、 ｂ ａ ｍｂ ｕ ｔ ｅ ｒ ｏ ｌ 、 ｍａ ｂｕ ｔ ｅ ｒ ｏ ｌ ａ ｎ ｄ
・
５ Ｏ・
中 国 兽 药 杂 志
２ ０ １ ３ ， ４ ７ （ １ ２ ） ： ５ ０— ５ ６ ／ 李 丹， 等
超 高效 液 相 色 谱 一串联 质 谱 法 检 测 猪尿 中 ２ Ｏ种 ｐ一受 体 激 动 剂 残 留
李 丹， 孙 雷， 毕言锋 ， 苏 富琴 ， 徐秉 恩 ， 王鹤佳 ， 徐 士新
［ 摘 要］ 建立 了猪尿 中吡布特 罗、 西马特罗、 特步他林等 ２ Ｏ种 Ｂ一受体激动剂残 留检测 的超高 效液相 色谱 一串联质 谱方 法。猪 尿样 品经酶解 后， 调节 ｐ Ｈ值 至碱 性， 用叔 丁醇和叔 丁基 甲醚 （ ６＋ ４ ， Ｖ ／ Ｖ） 萃取， ＭＣ Ｘ柱 净化 ， 以０ ． １ ％ 甲酸 乙腈 溶 液 和 ０ ． １ ％ 甲酸 水 溶 液 为 流 动 相进 行 梯 度 洗 脱， 同位素 内标法和外标法定量。２ ０种 Ｂ一受体激动剂在系列浓度 范围内呈现 良好 线性关系， 相关
液相色谱串联质谱法同时测定动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺残留量
液相色谱串联质谱法同时测定动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺残留量作者：陈鑫来源：《现代食品·下》2017年第04期摘要：建立了液相色谱串联质谱法测定动物源性食品中金刚烷胺、金刚乙胺残留的分析方法，以甲醇-1%三氮乙酸（50+50，v/v）作提取溶剂，用MCX固相萃取柱进行净化浓缩，内标法定量。
结果表明，在ESI正离子模式下，采用多反应监测模式进行测定时，金刚烷胺和金刚乙胺的检出限为0.5 µg/kg，回收率为76.7%～118.7%，相对标准偏差为1.7%～6.8%。
该方法检出限低，可用于实际样品的测定。
关键词：液相色谱串联质谱；金刚烷胺；金刚乙胺；动物源性食品Abstract：A method for simultaneous determination of amantadine and rimantadine in Food of animal origin by High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry （HPLC-MS/MS）was studied in this paper.Samples were extracted by a mixed solvent of methanol-1% trichloroacetic acid（50+50， v/v）， then purification and concentration were performed by solid-phase extraction with MCX column， and an internal standard calibration method was used. The results demonstrated that， When the analytes were detected by ESI+_MS/MS under multiple reaction monitoring mode，the detection limits were 0.5 µg/kg， the recoveries ranged 76.7%～118.7%， the relative standard deviations ranged 1.7%～6.8%. This method has the merits of low limit of detection，and it will have a promising application for analyzing real samples.Key words：HPLC-MS/MS； Amantadine； Rimantadine； Food of animal origin中图分类号：S859.84金刚烷胺（Amantadine，AMT）是饱和三环癸烷的氨基衍生物，又称金刚胺、三环癸胺等，合成于1960年，首先作为抗病毒药使用，是第一个获得FDA批准的抗流感病毒药物。
液相色谱-质谱联用法测定猪肉中16种磺胺类药物的残留
液相色谱-质谱联用法测定猪肉中16种磺胺类药物的残留蒋丽娜;柏旭【摘要】采用液相色谱-质谱联用仪建立了同时测定16种磺胺类药物残留的分析方法.样品中的残留经乙腈提取,离心提取,上清液用旋转蒸发仪蒸发浓缩至近干,残渣用流动相溶解,并用正己烷脱脂净化后,采用色谱柱分离,以0.1%甲酸-水溶液作为流动相,进行梯度洗脱,目标分析物在多反应监测模式下包留时间和离子对进行定向分析,外标法测定.12min完成分析.16种化合物在测定范围内线性关系良好(R>0.99),在两个加标水平下,回收率为80.8%~98.7%,相对标准差(RSD<10%),该分析方法时间短、选择性好、灵敏度高,可以满足猪肉中16种磺胺的测定.【期刊名称】《肉类工业》【年(卷),期】2018(000)001【总页数】4页(P45-47,52)【关键词】猪肉;磺胺类药物;液相色谱-质谱联用【作者】蒋丽娜;柏旭【作者单位】陕西省畜禽屠宰加工质量管理站陕西西安 710001;陕西省畜禽屠宰加工质量管理站陕西西安 710001【正文语种】中文随着全球经济一体化和食品贸易国际化，食品安全已成为一个世界性的挑战和全球重要的公共卫生问题。
其中动物性食品中的兽药残留问题已成为关注焦点［1］。
磺胺类兽药是畜禽抗感染治疗中的重要药物，是畜牧养殖业中应用最广泛的药物之一。
磺胺类药物主要通过输液、口服、创伤外用等用药方式或作为饲料添加剂而残留在动物源食品中。
研究已经表明磺胺类药物在动物源食品中的残留超标可极大危害人类健康。
残留在猪体内的磺胺类药物通过食物链进入人体，可分布于全身各组织中，以血、肝、肾含量最高。
且与血浆蛋白结合率高，所以在体内维持时间长。
还能透入脑膜积液和其他积液，以及通过胎盘进入胎循环，对孕妇及婴儿极其不利，还易在尿中析出结晶，导致结石而损害肾脏［2］。
因此，我国在猪肉中对磺胺类药物残留进行了严格管控。
目前测定方法主要有高效液相色谱法、酶联免疫测定法、放射免疫测定法、液相色谱－质谱联用仪测定法等［2～4］。
畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的测定
畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的测定液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于猪、牛、羊、鸡、鸭毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的测定。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样经清洗后消解，用2.0%三氯乙酸水溶液+乙腈溶液超声提取消解液中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍，提取液过MCX固相萃取小柱净化，浓缩定容后，用液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。
4试剂和材料除非另有规定，以下试剂均为分析纯。
水应符合GB/T6682规定的一级水要求。
4.1甲醇：色谱纯。
4.2氯化钠。
4.31%十二烷基磺酸钠（SDS）：取1g十二烷基磺酸钠，用水溶解并稀释至100mL。
4.45%吐温80：0.5g吐温80溶解在100mL水中。
4.50.2mol／L HCL溶液：取18.2mL浓盐酸定容至1000mL水中。
4.62%三氯乙酸水溶液：取三氯乙酸2mL用水溶解并稀释至100mL。
4.72%甲酸水溶液：2mL甲酸溶解在98mL水中。
4.85%的氨水甲醇溶液：5mL浓氨水溶解在95mL甲醇中。
4.9标准品：D15-金刚烷胺、金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍，含量均≥98%。
4.10标准贮备液（1.0mg/mL）：准确称取金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍标准品各约10.0mg于10mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。
置于棕色干燥器中，于-18℃下避光储存，有效期3个月。
4.12标准混合工作液（1.0mg/L）：取上述标准中间液各各0.1mL于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，置于棕色干燥器中，4 C冰箱中避光保存，有效期2周。
5仪器和设备5.1高效液相色谱-电喷雾串联质谱（配电喷雾离子源）。
高效液相色谱-串联质谱法同时测定供港生猪尿液中29种限用兽药残留
高效液相色谱-串联质谱法同时测定供港生猪尿液中29种限用兽药残留伍华雯;郭平;张远芳;曾赞;万建春;占春瑞【摘要】建立了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)同时测定生猪尿液中喹诺酮类、磺胺类、磺胺增效剂、四环素类、林可胺类、大环内脂共29种限用兽药残留量的检测方法.试样经乙酸铵和EDTA-Na缓冲液提取,HLB固相萃取小柱净化后,HPLC-MS/MS进行测定,其中β-受体激动剂类用内标法定量,其余兽药用外标法定量.在电喷雾电离正离子模式下,以多反应监测(MRM)方式采集数据进行定性与定量分析.29种兽药在猪尿基质中标准曲线的线性系数(r)均大于0.99,3个不同加标水平下的平均回收率为58％～108％,日内相对标准偏差(RSD)为1.9％～ 18.9％,日间RSD为3.4％～ 20.9％;定量下限(LOQ,S/N≥10)为1.0～10.0 μg/L.该方法经济、高效、可靠,可用于生猪屠宰前兽药多残留的快速检测.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2016(035)010【总页数】6页(P1261-1266)【关键词】高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS);生猪尿液;限用兽药;多残留【作者】伍华雯;郭平;张远芳;曾赞;万建春;占春瑞【作者单位】江西出入境检验检疫局综合技术中心,江西南昌330035;江西出入境检验检疫局综合技术中心,江西南昌330035;江西出入境检验检疫局综合技术中心,江西南昌330035;东北林业大学野生动物资源学院,黑龙江哈尔滨150040;江西出入境检验检疫局综合技术中心,江西南昌330035;江西出入境检验检疫局综合技术中心,江西南昌330035【正文语种】中文【中图分类】O657.63;TQ460.72随着赣港经贸的快速发展，江西对港出口呈连续增长趋势，供港生猪尤为明显，目前年供应量已居全国前列，香港市场约30%猪肉来自江西。
香港对进口农副产品有严格质量要求，《食物内有害物质规例》中规定了生猪的46种兽药限量标准，在一定程度上给江西供港生猪企业带来障碍。
畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的测定 编制说明
《畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的测定液相色谱-串联质谱法》地方标准编制说明一、工作简况(一)任务来源2019年11月10日，由江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所申请地方标准的立项，根据江西省市场监督管理局下达的2019年度江西省第七批地方标准制修订项目计划，批准《畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的测定液相色谱-串联质谱法》地方标准的制定。
(二)起草单位起草单位：江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所(三)主要起草人二、制定（修订）标准的必要性和意义金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍均属于人用抗病毒药物，但由于其价格低廉、效果良好，有不法分子大量使用金刚烷胺等抗病毒药物用于动物疾病的预防和治疗。
我国于2005年 12月发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，禁止金刚烷胺等人药兽用。
滥用抗病毒药物会使病毒产生不同程度的耐药性，严重影响人民身体健康和国家动物疫病防控工作。
动物毛发易运输，保存，可活体采集，药物代谢缓慢，尤其对于半衰期较短的药物，如金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍等，在经过一定时间的休药期后，从食用组织或血、尿中已无法检出药物残留证明是否使用过此禁用药物，而毛发因药物在其中代谢缓慢，在较长一段时间内仍可作为检测样本，提供违禁药物使用证明依据。
我国至今为止未见畜禽毛发中抗病毒类药物残留量检测方法的报道。
江西是畜禽生产和消费大省，畜禽产品的安全直接影响人民的身心健康。
目前国内无相关国家、行业标准，我省也无相关地方标准，制定《畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的测定液相色谱-串联质谱法》，可有效填补空白。
三、主要起草过程本标准根据江西省市场监督管理局下达我所研究制定的《畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的测定液相色谱-串联质谱法》江西省地方标准任务，江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所成立了标准起草项目组，讨论起草方案和分工。
标准起草小组根据工作实际需要，查询相关资料后发现，国内无畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量测定的国家、行业标准和地方标准，在实验室进行多次方法认证后，确定了提取、净化、浓缩过程中所用试剂及用量，具体的操作步骤。
液相色谱-串联质谱法测定动物组织中金刚烷胺和金刚乙胺的残留量
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超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定猪尿中金刚烷胺与金刚乙胺的残留量胡丽芳;张金艳;罗林广【摘要】采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)在多反应监测(MRM)模式下建立了猪尿中金刚烷胺和金刚乙胺残留量的检测方法.尿样经乙腈超声提取,Oasis MCX固相萃取柱净化后,使用Eclipse Plus C18柱(RRHD1.8μm,2.1 mm× 100 mm)进行分离,以甲醇-0.19％甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱,电喷雾正离子(ESI+)模式电离,多反应监测(MRM)模式进行定性定量测定.色谱保留时间和质谱碎片的离子丰度比定性,内标法定量.结果表明,2种待测物在0.2～20.0 μg/L范围内线性关系良好,相关系数(r2)均大于0.999,该方法测得在猪尿样液中,金刚烷胺和金刚乙胺的检出限(LOD)均为0.05 μg/L,定量下限(LOQ)均为0.2 μg/L;平均加标回收率为89.7％～ 102.8％,日内相对标准偏差为2.8％～4.2％.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2014(033)006【总页数】5页(P678-682)【关键词】超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(UPLC-ESI-MS/MS);金刚烷胺;金刚乙胺;猪尿【作者】胡丽芳;张金艳;罗林广【作者单位】江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所农产品质量安全重点实验室,江西南昌330200;江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所农产品质量安全重点实验室,江西南昌330200;江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所农产品质量安全重点实验室,江西南昌330200【正文语种】中文【中图分类】O657.63;TQ460.72金刚烷胺是人工合成饱和三环癸烷的氨基衍生物，用于亚洲A型流感病毒的预防和早期治疗，也可用于治疗帕金森病引起的神经障碍和预防动物常见的病毒类疾病如禽流感等［1－2］。
金刚乙胺是金刚烷胺类似物，也用于预防和治疗A型流感病毒感染，临床疗效优于金刚烷胺，且不良反应小于金刚烷胺［3－4］，金刚烷胺和金刚乙胺的结构式见图1。
我国于2005年12月发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，禁止金刚烷胺等抗病毒药作为兽用药，但由于其价格低廉、效果良好，仍有不法分子大量使用金刚烷胺和金刚乙胺用于动物疾病的预防和治疗。
滥用金刚烷胺类药物会导致动物中毒，使病毒产生不同程度的耐药性，并诱发病毒产生变异［5－7］，严重影响了国家动物疫病防控工作。
目前，金刚烷胺的检测方法主要有气相色谱法(GC)［8－9］、液相色谱法(LC)［10－11］及液相色谱－串联质谱法(LC－MS/MS)［12－16］。
但这些方法多应用于血液、医药和动物组织中金刚烷胺类药物的测定，而针对动物尿液中金刚烷胺类药物残留的检测方法未见报道。
由于大部分药物是通过尿液排出体外，且猪尿样品可以活体采样，在生猪屠宰前即可快速检测生猪中是否含有金刚烷胺类药物残留，从而达到从养殖源头控制禁用药物使用的目的。
因此，建立猪尿中金刚烷胺类药物残留的检测方法，对于有效监控该类药物的使用、保障我国动物性食品安全具有重要意义。
本文采用乙腈提取，MCX小柱净化，Plus C18色谱柱分离后，以超高效液相色谱－质谱联用仪对金刚烷胺和金刚乙胺进行检测，同位素内标法定量。
该方法快速、科学、可靠、灵敏，用于实际样品的检测，结果满意。
图1 金刚烷胺(A)和金刚乙胺(B)的结构式Fig.1 Structures of amantadine(A)and rimantadine(B)1 实验部分1.1 仪器、试剂与材料Agilent 1290高效液相色谱仪、Agilent 6460三重四极杆串联质谱仪、Eclipse Plus C18(RRHD 1.8 μm，2.1 mm×100 mm)(美国Agilent公司);CR22GⅢ型高速冷冻离心机(日本日立公司);Organomation N－EVAP－24型氮吹浓缩仪(美国Organomation公司);KQ－400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);GL－88B型旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造公司);固相萃取真空装置(美国Agilent公司);Milli-Q纯水系统(Millipore公司);Waters Oasis MCX固相萃取柱(Waters公司，3 mL/60 mg)。
甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，美国Fisher Scientific公司);氨水:含量为25%～28%(质量分数);金刚烷胺、金刚乙胺和金刚烷胺-D15(纯度≥98.0%，Sigma公司)。
实验用水为Milli-Q超纯水系统制备的二次水。
1.2 标准溶液的配制标准储备液:称取适量上述标准品，用甲醇分别配制成1.0 g/L的标准储备液，于－18℃避光储存。
金刚烷胺和金刚乙胺混合标准中间液:取上述标准储备液各1 mL，用甲醇稀释成质量浓度为10 mg/L的混合标准中间液，于－4℃下避光储存。
金刚烷胺-D15标准工作液:取金刚烷胺-D15标准储备液1 mL，用甲醇稀释成质量浓度为10 mg/L的标准中间液，再用甲醇－水(1∶1)溶液稀释成质量浓度为200.0 μg/L的标准工作液，于－4℃下避光储存。
1.3 仪器条件1.3.1 液相色谱条件色谱柱:Eclipse Plus C18(RRHD 1.8 μm，2.1 mm×100 mm)。
流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇。
梯度洗脱程序:0～3.0 min，10%～60%B;3.0～4.5 min，60%～100%B;4.5～4.6 min，100%～10%B;4.6～6.0 min，10%B。
流速0.25 mL/min;柱温30℃;进样体积5.0 μL。
1.3.2 质谱条件电离模式:电喷雾电离正离子模式(ESI+);检测方式:多反应监测(MRM);毛细管电压:4 000 V;离子源温度(TEM):325℃;干燥气温度:300℃;干燥气流量:15 L/min;雾化气压力:50 psi;鞘气温度:400℃;鞘气流量:12 L/min。
1.4 样品前处理准确量取5 mL猪尿样品于50 mL离心管中，加入金刚烷胺-D15标准工作液20 μL、乙腈10 mL，涡旋混匀2 min，置于超声波清洗器中超声提取20 min后加入氯化钠2.0 g，涡旋混匀2 min，以8 000 r/min离心5 min，吸取上清液于另一50 mL离心管中，重复提取1次，合并两次上清液加载至已依次用3 mL甲醇、3 mL水活化过的MCX柱中，再依次用3 mL 2%的甲酸水溶液、3 mL甲醇淋洗，减压抽干，用5 mL 5%的氨水甲醇溶液(体积比)洗脱;洗脱液在60℃下用氮气吹干后，用1 mL 0.1%甲酸水溶液－甲醇溶液(90∶10，体积比)溶解残渣，涡旋30 s，经0.22 μm滤膜过滤后，上机测定。
2 结果与讨论2.1 前处理条件的优化参考文献［10－16］，比较了甲醇、乙腈、1.0%三氯乙酸－乙腈(50∶50)和1.0%三氯乙酸－甲醇(50∶50)作提取液的提取效率，并对提取方法、提取时间等条件进行了研究。
结果表明，采用纯乙腈作为提取液时，金刚烷胺和金刚乙胺的提取平均回收率均大于97.9%，而甲醇、1.0%三氯乙酸－乙腈(50∶50)和1.0%三氯乙酸－甲醇(50∶50)3种溶剂的提取平均回收率分别为83.5%，91.1%，86.8%。
因此，纯乙腈对猪尿中金刚烷胺和金刚乙胺的提取效果总体最佳，这可能是因为尿液样品的基质较简单，无需沉淀蛋白。
比较了Waters Oasis HLB(3 mL/60 mg)、Waters Oasis MCX(3 mL/60 mg)、Waters Oasis MAX(3 mL/60 mg)和Supelco LC－18(3 mL/60 mg)4种固相萃取柱的净化效果，结果表明，在0.5，2.0，20.0 μg/kg 3个加标水平下，Waters Oasis HLB、Waters Oasis MAX和Supelco LC－18小柱的平均回收率分别为67.7%，75.9%和69.8%，而Oasis MCX的平均回收率均在97.9%以上。
最终实验选择采用Waters Oasis MCX(3 mL/60 mg)固相萃取小柱净化样品。
2.2 定量方法的比较按照“1.3”和“1.4”实验条件，分别使用内标法和外标法对猪尿中金刚烷胺和金刚乙胺进行回收率比较。
结果表明，使用外标法时金刚烷胺和金刚乙胺的平均回收率分别为75.5%和70.2%;而用内标法进行定量时，金刚烷胺和金刚乙胺的平均回收率分别为100.4%和99.4%;由此可见，内标法的定量回收率明显高于外标法。
使用外标法时，金刚烷胺和金刚乙胺的检出限为0.08 μg/L，与内标法的检出限0.05 μg/L相比，稍有差别，这主要是因为内标法能校正由于样品前处理过程中目标化合物造成的损失以及质谱离子化过程中干扰物对待测离子的抑制或增强作用;外标法的线性范围为0.4～20.0 μg/L，而内标法为0.2～20.0 μg/L。
总体而言，同位素内标法比外标法具有更好的准确性。
2.3 色谱条件的优化以甲醇－0.1%甲酸水溶液为流动相，采用通用型色谱柱 Eclipse Plus C18(RRHD 1.8 μm，2.1 mm×100 mm)对样品进行色谱分离，优化了色谱流动相梯度。
结果显示，在“1.3.1”色谱条件下，两种目标化合物在6 min内得到满意分离。
图2为金刚烷胺和金刚乙胺标准溶液(浓度均为5.0 μg/L)的总离子流图。
2.4 质谱条件的优化图2 金刚烷胺和金刚乙胺标准溶液(浓度均为5.0 μg/L)的总离子流图Fig.2 TICchromatogram of amantadine and rimantadine standardsolution1．amantadine and amantadine-D15，2．rimantadine分别配制1.0 mg/L的金刚烷胺、金刚乙胺和金刚烷胺-D15标准溶液，不通过色谱柱直接进入离子源，在ESI+模式下进行质谱条件的优化。
先进行一级质谱图全扫描，确定各目标化合物的母离子，并优化得到源内碎裂电压，然后在选定的源内碎裂电压条件下，对选定的母离子进行子离子扫描，选取丰度相对最强的1对碎片离子作为定量离子，次强的1对或2对碎片离子作为定性离子，并分别对子离子的碰撞能进行优化。
最后在MRM模式下分别对雾化气压力、干燥气温度和流量等参数进行优化。
优化后的质谱条件见表1。
表1 MRM监测模式下金刚烷胺、金刚乙胺及金刚烷胺-D15的质谱优化条件Table 1 MRM optimization conditions of amantadine，rimantadine and amantadine-D15*quantitative ion/V Amantadine 2.980 152.0 135.0*，93.0 115，100 15，Analyte Retention time t/min Parent ion(m/z) Daughterion(m/z) Fragmentor voltage E/V Collision energy U 24 35 Amantadine-D15 2.980 167.3 150.3* 120 35 Rimantadine 3.539 180.1 163.1* ，107.0，121.0 120，110，110 14，28，2.5 线性范围、检出限及定量下限配制金刚烷胺和金刚乙胺的质量浓度为0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0μg/L的系列混合标准溶液，分别加入金刚烷胺-D15标准工作液20 μL进行测定，以待测物定量离子峰面积(y)对其浓度(x，μg/L)作标准曲线。