分子遗传学

1，植物基因克隆的方法有哪些?

1 功能克隆

其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。

2 定位克隆

根据遗传连锁分析,染色体步移将基因定位到染色体的一个具体位置上后不断缩小筛选区域进而克隆该基因,研究该基因的功能或抗性的生化机制,这样一种策略叫定位克隆。

3 转座子标记法

利用转座子克隆植物基因的操作步骤主要应是以下几方面:(1) 把已分离得到的转座子与选择标记构建成含转座子的质粒载体。(2) 把转座子导入目标植物。(3) 利用Southern 杂交等技术检测转座子是否从载体质粒中转座到目标植物基因组中,这是转座子定位和分离目标基因所不可缺少的。(4) 转座子插入突变的鉴定及其分离。

4 人工合成并克隆基因

5 表型克隆

已知植物在表型上存在差异,利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆。

6 mRNA差异显示

其基本程序是:(1)提取两种细胞的mRNA,反转录后成为2种cDNA。(2) 以一定的引物作随机聚合酶链反应。(3) 通过扩增产物的电泳分析,分离出不同样品间的差异条带。(4)将差异DNA做成探针。(5) 在cDNA文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析。

7 减法杂交

从表达特异基因的组织中提取 mRNA,反转录为cDNA,从无特异基因表达的组织中提取mRNA,两者杂交,在表达特异基因的组织和无特异基因表达的组织中均表达的基因产物形成杂交分子,而特异mRNA转录的cDNA仍保持单链状态,把这种单链cDNA分离出来即为差异表达的基因。

8 PCR扩增克隆

基本方法是根据已知基因的序列设计并合成一对引物,从植物中提取DNA进行PCR扩增,扩增的片段纯化后连接到合适的载体上,用酶切分析和序列分析检测重组子,并与已知基因序列进行比较。

9 依据序列同源性克隆基因

基本作法是在其它种属的同源基因被克隆的前提下,构建cDNA文库或基因组文库,然后以已知的基因序列为探针来筛选目的克隆。

2，如何构建转基因植物？

植物基因转化方法

①农杆菌介导法：农杆菌的Ti质粒可以作为载体。Ti质粒上有两个区域，一个是T-DNA 区，这是能够转移并整合进植物受体的区段；另一个是Vir区，它编码实现质粒转移所需的蛋白质。将待转化的外源基因先克隆在大肠杆菌质粒上，然后将此质粒转入不会引起冠瘿

瘤的农杆菌(这种菌的Ti质粒已除去了T-DNA)，使外源基因通过同源重组整合在Ti质粒上；然后用带有外源基因的这种农杆菌去转化植物细胞，将外源基因转入植物细胞的基因组。

②直接转入法：这是将裸露的DNA直接导入植物细胞，然后将这些细胞在体外培养再生出植株。裸露的DNA的转化效率较低，因而要辅之以高效率的组织培养系统。

植物细胞有一层很厚的细胞壁，因此需先去除植物细胞壁，使之成为原生质体，然后用来直接转入外源DNA。当然，也可用机械的方法将DNA直接注入植物细胞而毋须去除细胞壁，这类方法有用显微操纵仪把DNA直接注入植物细胞，也可在金属微粒上蘸涂了外源DNA，把它当作子弹，用“基因枪”轰击植物组织而进入植物细胞。

③原生质体融合：将不同物种的原生质体进行融合，可实现两种基因组的结合。也可将一种细胞的细胞器，如线粒体或叶绿体与另一种细胞融合，此时，是一种细胞的细胞核处于两种细胞来源的细胞质中，这就形成了胞质杂种(cybrid)。

④花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞中，并进一步整合到受体细胞的基因中，随受精卵的发育而成为转基因新个体。该方法是由我国学者在20世纪80年代提出的。我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是采用花粉管通道法培育出来的。

3，简述SSR的原理及应用？

SSR的原理：

简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核昔酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。

SSR标记的应用：

目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建〔11，12，18，19，33〕、目标基因的标定〔8，9，21，22，26〕、指纹图〔22〕的绘制等研究中。

（一）、基因组作图和基因定位研究

长期以来，各种生物的遗传图谱几乎都是根据诸如形态、生理和生化等常规标记来构建的，所建成的遗传图谱仅限少数种类的生物，而且图谱分辨率大多很低，图距大，饱和度低，因而应用价值有限。分子标记用于遗传图谱构建是遗传学领域的重大进展之一。随着新的标记技术的发展，生物遗传图谱名单上的新成员将不断增加，图谱上标记的密度也将越来越高。建立起完整的高密度的分子图谱，就可以定位感兴趣的基因。

（二）、基于图谱克隆基因

图位克隆(Map—bascd cloning))是近几年随着分子标记遗传图谱的相继建立和基因分子定位而发展起来的一种新的基因克隆技术。利用分子标记辅助的图位克隆无需事先知道

基因的序列，也不必了解基因的表达产物，就可以直接克隆基因。图位克隆是最为通用的基因识别途径，至少在理论上适用于一切基因。基因组研究提供的高密度遗传图谱、大尺寸物理图谱、大片段基因组文库和基因组全序列，已为图位克隆的广泛应用铺平了道路。

（三）、物种亲缘关系和系统分类中的应用

分子标记广泛存在于基因组的各个区域，通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多态性进行比较，就能够全面评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。利用遗传多样性的结果可以对物种进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系。分子标记的发展为研究物种亲缘关系和系统分类提供了有力的手段。

（四）、用于疾病诊断和遗传病连锁分析

1980年，Bostein等成功的将PFLP技术用于镰刀型贫血症的诊断分析，开创了基因诊断的先河。PFLP是以孟德尔方式遗传，因此可以作为染色体上致病基因座位的遗传标志。目前，许多与相连锁的致病基因得以定位。小卫星和微卫星因其高度多态性而被广泛用于疾病诊断和遗传病的连锁分析。随着高通量SNP检测技术方法的出现，作为数量最多且易于批量检测的多态标记，SNP在连锁分析与基因定位，包括复杂疾病的基因定位、关联分析、个体和群体对环境致病因子与药物的易感性研究中将发挥愈来愈重要的作用。

4.简述植物分子遗传学的新进展。

植物分子遗传学的最新进展主要体现在植物的远缘杂交上。

植物的远缘杂交是指种以上分类单位的生物类型之间的杂交，包括同属植物的种间杂交和不同属植物的属间杂交，是高等植物基因组进化和新物种形成的主要动力之一。高等植物杂交与进化的关系一直是进化生物学上有争议的热点问题之一。一种观点认为，由于种间杂种在适合度(fitness)上的普遍劣势，杂交阻碍了进化；另一种观点则认为，杂交可以综合亲本种的适应性或创造出新的适应性，丰富基因库、拓宽生境，进而促进基因组进化和新种形成。可成活远缘杂种有3种主要命运：形成多倍体，二倍体重组或与亲本种之一回交（又称渐渗杂交）。近年来基因组学的巨大进展，解释了高等植物多倍体普遍性的原因，在二倍体重组途径导致新种形成的研究领域，也取得突破性进展，但关于第3种途径，即渐渗杂交在进化上的意义，实验性研究不多。