研究生分子生物学工作基础新基因研究路线2
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研究生课程-分子生物学基本操作技术
线型DNA分子的 分离范围(Kb) 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
2）电泳缓冲液
• 常用三种缓冲液
– Tris-硼酸（TBE） – Tris-乙酸（TAE） – Tris-磷酸（TPE）
• TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果 好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓 度高，容易使DNA沉淀
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增
第2轮扩增 PCR的基本原理
• PC第R反3轮应条扩件增
• PCR过程 • PCR的特点
理想拷贝数=2n
重n 循复环次数30轮后
第4轮扩增第5轮2扩3增0=1,0第763轮,扩增741,824 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
PCR反应
• 基本原理：生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放 置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用 下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比， 与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度 的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过 电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。
聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩 增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极微量 的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千 百万倍。
• 一、PCR技术原理 • 二、PCR技术主要类型 • 三、PCR技术主要应用
一、PCR技术原理
PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
• 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小 分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA 分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许 多分子生物学研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、 限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学 界的高度重视。
第五章 分子生物学研究法-基因工程
3.目的基因导入受体细胞
目的基因导入受体细胞
1) 原核生物的人工转化（细菌转化） 感受态 (competence) 细菌能从周围环境中吸收DNA时的生理状态 在自然界中不是所有细菌都能够吸收DNA 也不是任何生长阶段都具有吸收DNA的能力
第五章 分子生物学研究法
研究发现：
目的基因导入受体细胞
细菌的感受态是可以诱导的，而且此时细菌摄取DNA 是非选择性，并可以利用异源启动子启动转录和蛋白 质合成。
第五章 分子生物学研究法
（1）转化方法 ① CaCl2转化法
目的基因导入受体细胞
感受态细胞的制备: 用CaCl2处理受体大肠杆菌细胞 得到感受态细胞。 操作方法: 感受态细胞 +带有目的基因的质粒载体在 42C, 处理1-2 min；然后冰浴中 2 min。
第五章 分子生物学研究法
目的基因导入受体细胞
可通过电击法或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂处理细 胞, 使细胞膜的通透性发生暂时性的改变,容易接受外界 DNA, 这类细胞被称为感受态细胞 (competent cells)。
第五章 分子生物学研究法
目的基因导入受体细胞
• 原核生物的人工转化（细菌转化） 是指细菌的感受态细胞接收外源DNA而获得了新的遗传 cDNA人工合成获得目的基因
第五章 分子生物学研究法
目的基因的获取
目的基因的获取:
DNA片段
(RT)- PC库
化学合成法
第五章 分子生物学研究法
载体构建
2. 基因表达载体的构建 1) 基因表达载体的选择 2) 目的基因与载体的连接
- 染色体DNA不会复性，常常聚集形成网状结构,与变性 的蛋白质及RNA一道被离心沉淀下去
目的基因导入受体细胞
1) 原核生物的人工转化（细菌转化） 感受态 (competence) 细菌能从周围环境中吸收DNA时的生理状态 在自然界中不是所有细菌都能够吸收DNA 也不是任何生长阶段都具有吸收DNA的能力
第五章 分子生物学研究法
研究发现：
目的基因导入受体细胞
细菌的感受态是可以诱导的，而且此时细菌摄取DNA 是非选择性，并可以利用异源启动子启动转录和蛋白 质合成。
第五章 分子生物学研究法
（1）转化方法 ① CaCl2转化法
目的基因导入受体细胞
感受态细胞的制备: 用CaCl2处理受体大肠杆菌细胞 得到感受态细胞。 操作方法: 感受态细胞 +带有目的基因的质粒载体在 42C, 处理1-2 min；然后冰浴中 2 min。
第五章 分子生物学研究法
目的基因导入受体细胞
可通过电击法或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂处理细 胞, 使细胞膜的通透性发生暂时性的改变,容易接受外界 DNA, 这类细胞被称为感受态细胞 (competent cells)。
第五章 分子生物学研究法
目的基因导入受体细胞
• 原核生物的人工转化（细菌转化） 是指细菌的感受态细胞接收外源DNA而获得了新的遗传 cDNA人工合成获得目的基因
第五章 分子生物学研究法
目的基因的获取
目的基因的获取:
DNA片段
(RT)- PC库
化学合成法
第五章 分子生物学研究法
载体构建
2. 基因表达载体的构建 1) 基因表达载体的选择 2) 目的基因与载体的连接
- 染色体DNA不会复性，常常聚集形成网状结构,与变性 的蛋白质及RNA一道被离心沉淀下去
分子生物学基础
精准医学
个性化治疗 精准诊断
科学项目
人类蛋白质组计划 基因功能研究
结束语
分子生物学的发展是人类智慧和努力的结晶。继 续深入研究生物分子的结构和功能，有助于解开 生命的奥秘。让我们共同努力，探索更多关于生 命的奇迹。
感谢观看
THANKS
rRNA的合成
核糖体组成部分
调控机制
rRNA是核糖体的组成部分， 参与蛋白质合成过程
rRNA的合成受核糖体 RNA聚合酶调控
效率影响
rRNA在细胞内的丰度决定 了蛋白质合成的效率
总结
RNA在细胞内扮演着重要角色，不同类型的 RNA具有特定的生物学功能。mRNA经过剪接 生成多种亚型，tRNA参与蛋白质合成，rRNA 是核糖体的组成部分，对蛋白质合成效率起关键 作用。
基因表达调控的应用
癌症治疗
利用基因调控技术研究肿 瘤发生机制 开发靶向治疗方法
遗传疾病治疗
通过基因编辑技术矫正遗 传缺陷 探索基因疾病的治疗新途 径
RNA干扰技术
通过RNA介导干扰沉默基 因表达 应用广泛且有效
CRISPR-Cas9系统
高效的基因编辑技术 革命性地改变了基因调控 领域的研究
未来基因调控技 术的展望
分子生物学基础的重要性
核心位置
生命科学的核心
科学基础
为健康、农业、 环境等领域的发
展提供支持
细胞活动
与分子水平的调 控和表达有关
未来发展趋势
01 高通量测序
推动分子生物学的发展
02 精准医学
引领医疗技术的发展
03 科学项目
人类蛋白质组计划等大型项目加速基因解读
未来发展趋势
高通量测序
大规模测序技术 加速基因研究
研究生基因分子生物学课程2,2007
•反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶〕 •末端脱氧核苷酸转移酶
2020/12/2
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
2020/12/2
12
5’
3’
3’
5’
Mg2+
DNase I
5’
3’ 5’
3’ 5’
3’
3’
5’ 3’
5’
dATP
dCTP
大肠杆菌DNA聚合酶I
dGTP
(全酶〕
dTTP
5’
3’
Hale Waihona Puke 3’5’5’
3’
3’
5’
2020/12/2
在镁离子存在下，用低限量的DNA酶 I处理双链DNA，产生的切口
可作为大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕催化DNA合成的引物。合成
使反应在接近Km（使酶活性达最大值的一半时的底物浓度〕
的条件下进行。 3〕应尽量采用最佳的反应条件，包括特定的pH值、温度及 离子浓度。
2020/12/2
1
（一〕DNA聚合酶 最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有： •大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕 •大肠杆菌DNA聚合酶 I大片段（Klenow片段〕 •T4和T7噬菌体DNA聚合酶（来源于T4和T7噬菌体感染的大肠 杆菌〕 •经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶〕 •热稳定D NA 依赖性 DNA聚合酶
9
外切核酸酶的校对工作方式就像电脑键盘上的“delete key”, 只纠正最近的一个错误。这种校对功能极大地增加了DNA 合成的准确性。 DNA聚合酶掺入错误碱基的几率≈1/105 外切核酸酶的校对功能降低了掺入错误碱基的几率≈1/107 事实上一个细胞中发生突变的几率≈1/1010
研究生分子生物学工作基础新基因研究路线2-文档资料
2. A protein that is functional as a dimer. A mutation that removes the functional domain, but retains the dimerization domain would cause a dominate negative phenotype, because some fraction of protein dimers would be missing one of the functional domains. •
Methods of RNAi knockdown in mammalian cells
siRNA vs. shRNA: Similarities and differences. Advanced Drug Delivery Reviews 61 (2009) 746–759
Schematic of the siRNA mediated RNA interference pathway. After entry into the cytoplasm, siRNA is either loaded onto RISC directly or utilize a Dicer mediated process. After RISC loading, the passenger strand departs, thereby commencing the RNA interference process via target mRNA cleavage and degradation. siRNA loaded RISCs are also found to be associated with nucleolus region and maybe shuttled in and out of nucleus through an yet unidentified process.
Methods of RNAi knockdown in mammalian cells
siRNA vs. shRNA: Similarities and differences. Advanced Drug Delivery Reviews 61 (2009) 746–759
Schematic of the siRNA mediated RNA interference pathway. After entry into the cytoplasm, siRNA is either loaded onto RISC directly or utilize a Dicer mediated process. After RISC loading, the passenger strand departs, thereby commencing the RNA interference process via target mRNA cleavage and degradation. siRNA loaded RISCs are also found to be associated with nucleolus region and maybe shuttled in and out of nucleus through an yet unidentified process.
第五章分子生物学基本研究法(上)DNA、RNA及蛋白质操作技术可编辑全文
电击转化与温度有关，一般在0~4℃进行。由于 转化载体上常带有LacZ基因（大肠杆菌乳糖操 纵子中的一个基因），多用带有不同抗生素（常 用的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素 等）的选择性培养基结合蓝白斑筛选法鉴定转化 细胞。
5. 2. 3聚合酶链式反应（PCR）技术 聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用 的方法。 PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片 段，就称为genomic PCR，若是mRNA反转 录产生的cDNA，就称为RT-PCR。
基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或 其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入 原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的 繁殖和表达。
基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它 强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的 繁衍与性状表达。
事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基 因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程 技术区别于其它技术的根本特征。
50℃~60℃，退火
引物与模板DNA相 结合
DNA合成（第三步）：
将反应混合物的温度上升到72℃左右保 温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下， 从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并 沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新 生DNA互补链。
PCR扩增，72℃左右, 按 每 分钟1000个碱基对设计
5. 2. 1 核酸的凝胶电泳
自 从 琼 脂 糖 （ agarose ） 和 聚 丙 烯 酰 胺 （polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来， 按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经 发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质 与核酸相互作用的重要实验手段。
一种分子被放置到电场中，它就会以一 定的速度移向适当的电极。我们把这种 电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫 做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳 分子本身所携带的净电荷数成正比，与 片段大小成反比。
5. 2. 3聚合酶链式反应（PCR）技术 聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用 的方法。 PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片 段，就称为genomic PCR，若是mRNA反转 录产生的cDNA，就称为RT-PCR。
基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或 其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入 原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的 繁殖和表达。
基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它 强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的 繁衍与性状表达。
事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基 因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程 技术区别于其它技术的根本特征。
50℃~60℃，退火
引物与模板DNA相 结合
DNA合成（第三步）：
将反应混合物的温度上升到72℃左右保 温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下， 从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并 沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新 生DNA互补链。
PCR扩增，72℃左右, 按 每 分钟1000个碱基对设计
5. 2. 1 核酸的凝胶电泳
自 从 琼 脂 糖 （ agarose ） 和 聚 丙 烯 酰 胺 （polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来， 按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经 发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质 与核酸相互作用的重要实验手段。
一种分子被放置到电场中，它就会以一 定的速度移向适当的电极。我们把这种 电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫 做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳 分子本身所携带的净电荷数成正比，与 片段大小成反比。
分子生物学第二章基因与基因组新
2、单链DNA 动物病毒中仅微小病毒为单 链病毒；噬菌体中仅含单链DNA。
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分子生物学第二章基因与基因组新
RNA病毒基因组所携带的遗传信息一般 在同一条链上，序列与mRNA相同的为正 股（+），与mRNA互补的为负股（—）
3、双链RNA 以负链RNA为模板转录出 mRNA如呼肠孤病毒及噬真菌体。
• 例 如 ， 基 因 unc-86 ， ced-9 ； 蛋 白 UNC-86；CED-9。
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分子生物学第二章基因与基因组新
果蝇
• 来自突变表型的描述可以用1-4个字 母表示。
• 例 如 ， 基 因 white(w) ， tailless(tll)，hedgehog(hh)；而蛋白
为White，Tailless，Hedgehog。
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分子生物学第二章基因与基因组新
植物 虽然没有适用于所有植物的惯用法，
但大多数用1-3个小写字母表示。
Arabidopsis基因用果蝇的方法命名， 但使用大写字母，例如，基因 AGAMOUS(AG)，蛋白AGAMOUS。
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分子生物学第二章基因与基因组新
脊椎动物 一般以描述基因功能的1-4个小写字
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分子生物学第二章基因与基因组新
基因的分子生物学定义
一个基因不仅是编码有功能的蛋白 质多肽链或RNA所必需的核酸序列（通 常指DNA序列），而且还包括为保证转 录所必需的调控序列、5’端非翻译序列、 内含子以及3’非翻译序列等核酸序列。
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分子生物学第二章基因与基因组新
根据基因是否具有表达功能可以将其分为三类
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分子生物学第二章基因与基因组新
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分子生物学第二章基因与基因组新
RNA病毒基因组所携带的遗传信息一般 在同一条链上，序列与mRNA相同的为正 股（+），与mRNA互补的为负股（—）
3、双链RNA 以负链RNA为模板转录出 mRNA如呼肠孤病毒及噬真菌体。
• 例 如 ， 基 因 unc-86 ， ced-9 ； 蛋 白 UNC-86；CED-9。
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分子生物学第二章基因与基因组新
果蝇
• 来自突变表型的描述可以用1-4个字 母表示。
• 例 如 ， 基 因 white(w) ， tailless(tll)，hedgehog(hh)；而蛋白
为White，Tailless，Hedgehog。
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分子生物学第二章基因与基因组新
植物 虽然没有适用于所有植物的惯用法，
但大多数用1-3个小写字母表示。
Arabidopsis基因用果蝇的方法命名， 但使用大写字母，例如，基因 AGAMOUS(AG)，蛋白AGAMOUS。
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分子生物学第二章基因与基因组新
脊椎动物 一般以描述基因功能的1-4个小写字
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分子生物学第二章基因与基因组新
基因的分子生物学定义
一个基因不仅是编码有功能的蛋白 质多肽链或RNA所必需的核酸序列（通 常指DNA序列），而且还包括为保证转 录所必需的调控序列、5’端非翻译序列、 内含子以及3’非翻译序列等核酸序列。
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分子生物学第二章基因与基因组新
根据基因是否具有表达功能可以将其分为三类
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分子生物学第二章基因与基因组新
基因工程的分子生物学基础
基本原理
利用CRISPR-Cas9系统中的RNA引导和Cas9酶的剪切功能，实现精确的基因编辑。
医学应用
CRISPR-Cas9在治疗疾病和基因疾病的研究中显示了巨大的潜力。
农业应用
CRISPR-Cas9可用于改良农作物，提高抗病性、耐旱性等方面。
基因突变和突变的影响
基因突变
突变的影响
突变的原因
突变是DNA序列的改变，这可能 会导致蛋白质结构或功能的改变。
1
选
2
剪切DNA
使用限制性内切酶剪切目标DNA，以获得所需的DNA片段。
3
连接DNA片段
使用DNA连接酶将目标基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA。
CRISPR-Cas9技术及其应用
CRISPR-Cas9是一种革命性的基因编辑技术，能够精确地修改生物体的基因序列。它利用一种天然 存在的基因编辑系统，允许科学家精确地剪切、插入和编辑基因。
基因工程的分子生物学基 础
DNA和基因的基本概念及结构，是基因工程的起点和核心。了解DNA复制和遗 传信息传递，以及基因表达和蛋白质合成的过程，是理解基因工程的关键。
重组DNA技术和基因工程的原理
通过重组DNA技术，科学家可以将不同种类的基因和DNA片段组合到一起，创造出新的基因并将其导入其他生 物体中。这种技术的原理是通过DNA剪切酶切割DNA，然后通过DNA连接酶将DNA片段连接在一起。
突变可以是有害、有益或中性的， 不同的突变类型对生物体有不同 的影响。
突变可以由各种因素引起，包括 自然突变、环境因素和基因工程 技术。
基因工程的应用领域和前景
1 医药领域
基因工程在治疗遗传性疾病、癌症治疗和个性化药物方面具有巨大的潜力。
利用CRISPR-Cas9系统中的RNA引导和Cas9酶的剪切功能，实现精确的基因编辑。
医学应用
CRISPR-Cas9在治疗疾病和基因疾病的研究中显示了巨大的潜力。
农业应用
CRISPR-Cas9可用于改良农作物，提高抗病性、耐旱性等方面。
基因突变和突变的影响
基因突变
突变的影响
突变的原因
突变是DNA序列的改变，这可能 会导致蛋白质结构或功能的改变。
1
选
2
剪切DNA
使用限制性内切酶剪切目标DNA，以获得所需的DNA片段。
3
连接DNA片段
使用DNA连接酶将目标基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA。
CRISPR-Cas9技术及其应用
CRISPR-Cas9是一种革命性的基因编辑技术，能够精确地修改生物体的基因序列。它利用一种天然 存在的基因编辑系统，允许科学家精确地剪切、插入和编辑基因。
基因工程的分子生物学基 础
DNA和基因的基本概念及结构，是基因工程的起点和核心。了解DNA复制和遗 传信息传递，以及基因表达和蛋白质合成的过程，是理解基因工程的关键。
重组DNA技术和基因工程的原理
通过重组DNA技术，科学家可以将不同种类的基因和DNA片段组合到一起，创造出新的基因并将其导入其他生 物体中。这种技术的原理是通过DNA剪切酶切割DNA，然后通过DNA连接酶将DNA片段连接在一起。
突变可以是有害、有益或中性的， 不同的突变类型对生物体有不同 的影响。
突变可以由各种因素引起，包括 自然突变、环境因素和基因工程 技术。
基因工程的应用领域和前景
1 医药领域
基因工程在治疗遗传性疾病、癌症治疗和个性化药物方面具有巨大的潜力。
现代分子生物学-第九章 分子生物学基本研究法(下)-基因功能研究技术
转录组测序分析和RNA-Seq
转录组(transcriptome)，广义上指在某一特定生理 条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所 有RNA的总和，包括信使RNA (mRNA)、核糖体 RNA (rRNA)、转运RNA (tRNA)及非编码 RNA(non-coding RNA或sRNA); 狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。
转录因子与顺式作用元件结合，激活最基本启动子Pmin， 使报告基因表达。若接入3个以上顺式作用元件，可增强 转录因子的识别和结合效率。
结构域
二者融合 导入酵母 细胞
上游
启动子 下游
酵母单杂交体系主要用于：
确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用；
分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功
胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定 了哺乳动物基因敲除的技术基础。
6. 2. 3 植物基因敲除技术
T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广 泛的基因敲除手段。
利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基 因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段 DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基 因的表达，从而使该基因“失活”。
关于基因敲除技术，噬菌体的Cre/Loxp系统、 Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和 R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统， 尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
1、完全基因敲除：
Neo基因有双重作用：①形成靶位点的插入突变；②作为
正向筛选标记。
取代型
插入型
由于基因转移的同源重组自然发生率极低， 动物的 重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5， 即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞 中筛选出真正发生 了同源重组的胚胎干细胞。
研究生分子生物学工作基础 新基因研究路线
Q Q Q S
K K K K N N N N L L L L G G G G G G G A S S S G L L L L
E E E D
V V V V C C C C L L L L W W W W K Q Q I K K K K R R R K
D D D T
S N N C R R R R L L L L E E E E A A T A S S S S A A A A
K K K Q
E E E Q
L L L L
I I I I
E E E E
L L L L
T T T T
E E E E
A A A S
S S S S
L L L L
V L L V
S S S S
V V V V
R R R K
K K K K
S S S S
homo sapiens mus musculus Rattus norvegicus Danio rerio
L L L L
A A A A
L L L L
G G G S
A A A A
G G G G
L L L L
D D D G
S A A S
S S S A
E E E E
Q Q Q Q
A A A D
D D D D
L L L L
R R R L
Q Q Q K
L L L L
Q Q Q K
G G G E
D D D D
L L L L
61 61 61 61
121 119 115 110 180 179 175 170 240 239 235 230 296 296 292 290 355 355 351 350 415 415 411 410 475 475 471 468
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• the siRNAs designed against different target genes would be expected to show different gene expression signatures
Loss of Function
• Inhibition of activity • Inhibition of expression
Inhibition of Activity
Specific inhibitors Dominant negatives Specific antibodies
RNAi in Mammalian cells
> 30 base pair double-stranded RNA
Short interfering RNAs <ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ30 base pairs
PKRinactive
Cleavage
2’, 5’-ASinactive
RNAi
PKRactive
2’, 5’-ASactive
Methods of RNAi knockdown in mammalian cells
siRNA vs. shRNA: Similarities and differences. Advanced Drug Delivery Reviews 61 (2009) 746–759
Schematic of the siRNA mediated RNA interference pathway. After entry into the cytoplasm, siRNA is either loaded onto RISC directly or utilize a Dicer mediated process. After RISC loading, the passenger strand departs, thereby commencing the RNA interference process via target mRNA cleavage and degradation. siRNA loaded RISCs are also found to be associated with nucleolus region and maybe shuttled in and out of nucleus through an yet unidentified process.
• Analysis of the Drosophila and C. elegans genomes reveals 3 types of RNase III enzymes.
1. the canonical RNase III, which contains a single RNase III signature motif and a dsRNA-binding domain (dsRBD; for example RNC_CAEEL ).
• Cleavage into precisely sized fragments is determined by the fact that one of the active sites in each Dicer protein is defective, shifting the periodicity of cleavage from 9–11 nucleotides for bacterial RNase III to 22 nucleotides for Dicer family members.
b-gal
Shang, Y., and Brown, M. Science 295: 2465-2468, 2019
-+ + +
Mechanisms Involved in RNAi
The Discovery of Dicer
• RNase III family members are among the few nucleases that show specificity for dsRNA.
Schematic of the shRNA mediated RNA interference pathway. After delivery of the shRNA expression vector into the cytoplasm, the vector needs to be transported into the nucleus for transcription. The primary transcripts (pre-shRNA) follow a similar route as discovered for the primary transcripts of microRNA. The primary transcripts are processed by the Drosha/DGCR8 complex and form pre shRNAs. Pre-shRNAs are transported to the cytoplasm via exportin 5, to be loaded onto the Dicer/TRBP/PACT complex where they are further processed to mature shRNA. Mature shRNA in the Dicer/TRBP/PACT complex are associated with Argonaute protein containing RISC and provide RNA interference function either through mRNA cleavage and degradation, or through translational suppression via pbodies.
Dominant negative mutant of a transcription factor
pol II
PP P
Inhibition of Expression
RNA interference (RNAi) Knockout
RNA INTERFERENCE (RNAi)
Andrew Z. Fire and Craig C. Mello "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA". – Nobel Prize in Physiology and Medicine 2019
The Specificity of RNAi
• if siRNAs elicit a specific response, then all of the siRNAs designed against the same target would be expected to produce similar gene expression signatures
Andrew Fire, SiQun Xu, Mary K. Montgomery, Steven A. Kostas, Samuel E. Driver, Craig C. Mello. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature 391: 806 – 811, 2019
2. A protein that is functional as a dimer. A mutation that removes the functional domain, but retains the dimerization domain would cause a dominate negative phenotype, because some fraction of protein dimers would be missing one of the functional domains. •
• Examples: 1. A mutation in a transcription factor that removes the activation domain, but still contains the DNA binding domain. This product can then block the wildtype transcription factor from binding the DNA site leading to reduced levels of gene activation.
(Global effects)
Degradation of mRNA (Sequence-specific effects)
Inhibition of protein synthesis Degradation of mRNAs
Endogenous SRC-1 RNAi
1
943 963
4365
SRC-1 mRNA
Histone Deacetylase (HDAC) inhibitors
Histone deacetylase inhibitors and the promise of epigenetic (and more) treatments for cancer. Nature Reviews Cancer. 2019 Vol 6. 38-51
5’ C C U C A G G G C A G A G A A C C A U C U T T T T G G A G U C C C G U C U C U U G G U A G A 5’
Small interfering RNA (siRNA)
Loss of Function
• Inhibition of activity • Inhibition of expression
Inhibition of Activity
Specific inhibitors Dominant negatives Specific antibodies
RNAi in Mammalian cells
> 30 base pair double-stranded RNA
Short interfering RNAs <ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ30 base pairs
PKRinactive
Cleavage
2’, 5’-ASinactive
RNAi
PKRactive
2’, 5’-ASactive
Methods of RNAi knockdown in mammalian cells
siRNA vs. shRNA: Similarities and differences. Advanced Drug Delivery Reviews 61 (2009) 746–759
Schematic of the siRNA mediated RNA interference pathway. After entry into the cytoplasm, siRNA is either loaded onto RISC directly or utilize a Dicer mediated process. After RISC loading, the passenger strand departs, thereby commencing the RNA interference process via target mRNA cleavage and degradation. siRNA loaded RISCs are also found to be associated with nucleolus region and maybe shuttled in and out of nucleus through an yet unidentified process.
• Analysis of the Drosophila and C. elegans genomes reveals 3 types of RNase III enzymes.
1. the canonical RNase III, which contains a single RNase III signature motif and a dsRNA-binding domain (dsRBD; for example RNC_CAEEL ).
• Cleavage into precisely sized fragments is determined by the fact that one of the active sites in each Dicer protein is defective, shifting the periodicity of cleavage from 9–11 nucleotides for bacterial RNase III to 22 nucleotides for Dicer family members.
b-gal
Shang, Y., and Brown, M. Science 295: 2465-2468, 2019
-+ + +
Mechanisms Involved in RNAi
The Discovery of Dicer
• RNase III family members are among the few nucleases that show specificity for dsRNA.
Schematic of the shRNA mediated RNA interference pathway. After delivery of the shRNA expression vector into the cytoplasm, the vector needs to be transported into the nucleus for transcription. The primary transcripts (pre-shRNA) follow a similar route as discovered for the primary transcripts of microRNA. The primary transcripts are processed by the Drosha/DGCR8 complex and form pre shRNAs. Pre-shRNAs are transported to the cytoplasm via exportin 5, to be loaded onto the Dicer/TRBP/PACT complex where they are further processed to mature shRNA. Mature shRNA in the Dicer/TRBP/PACT complex are associated with Argonaute protein containing RISC and provide RNA interference function either through mRNA cleavage and degradation, or through translational suppression via pbodies.
Dominant negative mutant of a transcription factor
pol II
PP P
Inhibition of Expression
RNA interference (RNAi) Knockout
RNA INTERFERENCE (RNAi)
Andrew Z. Fire and Craig C. Mello "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA". – Nobel Prize in Physiology and Medicine 2019
The Specificity of RNAi
• if siRNAs elicit a specific response, then all of the siRNAs designed against the same target would be expected to produce similar gene expression signatures
Andrew Fire, SiQun Xu, Mary K. Montgomery, Steven A. Kostas, Samuel E. Driver, Craig C. Mello. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature 391: 806 – 811, 2019
2. A protein that is functional as a dimer. A mutation that removes the functional domain, but retains the dimerization domain would cause a dominate negative phenotype, because some fraction of protein dimers would be missing one of the functional domains. •
• Examples: 1. A mutation in a transcription factor that removes the activation domain, but still contains the DNA binding domain. This product can then block the wildtype transcription factor from binding the DNA site leading to reduced levels of gene activation.
(Global effects)
Degradation of mRNA (Sequence-specific effects)
Inhibition of protein synthesis Degradation of mRNAs
Endogenous SRC-1 RNAi
1
943 963
4365
SRC-1 mRNA
Histone Deacetylase (HDAC) inhibitors
Histone deacetylase inhibitors and the promise of epigenetic (and more) treatments for cancer. Nature Reviews Cancer. 2019 Vol 6. 38-51
5’ C C U C A G G G C A G A G A A C C A U C U T T T T G G A G U C C C G U C U C U U G G U A G A 5’
Small interfering RNA (siRNA)