人鼠嵌合抗体名词解释
什么是抗体人源化
什么是抗体人源化目前，用细胞工程制备人单抗在技术上和伦理上都存在一些难题，治疗性抗体的开发就集中在具有治疗前景的鼠源单抗上。
但是鼠源单抗对人体具有异源性反应，可诱发人抗鼠抗体效应（Human anti-mouse antibodies, HAMA反应），使得单抗的治疗效果明显滞后。
随着基因重组技术的发展和人们对抗体结构认识的深入，研究者们尝试对鼠源性抗体进行改造，致力于在保留与抗原结合的高亲和力的基础上，减少异源性抗体的免疫原性，推动抗体人源化研发的进程。
人源化抗体主要指以用基因克隆及DNA重组技术对鼠源单克隆抗体改造，重新表达产生的抗体。
其大部分氨基酸序列被人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。
嵌合抗体和CDR移植抗体根据人源化程度不同，单抗又可分为嵌合抗体（60%-70%人源化氨基酸序列）和CDR(complementarity-determining region)移植抗体（90%-95%人源化氨基酸序列）。
1、人-鼠嵌合抗体人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）：第一代人源化抗体。
其是在基因水平上将鼠源单克隆抗体的V区和人抗体的C区(variable region, 可变区)连接，在合适的宿主细胞内表达可得到人-鼠嵌合抗体。
嵌合抗体用于人体所产生的HAMA反应比鼠源单抗明显减弱；另外，人源C区(constant region，恒定区)可更有效地介导人体一些免疫反应，如CDC（complement-dependent cytotoxicity, CDC, 依赖补体的细胞毒性作用），ADCC（antibody dependent cell mediated cytotoxicity, 抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用）。
2、CDR移植抗体嵌合抗体虽然可以部分解决异种蛋白的排斥问题，但由于其还含有鼠源V区，依然有可能会诱发HAMA反应，干扰抗体疗效，诱发超敏反应，在临床上其应用会受到一定限制。
抗体的人源化
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五、单域抗体和分子识别单位
（1）单域抗体:由VH(VL)单个可变区组成的，只有 抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特 异结合能力也强。
（2）分子识别单位（MRU）:是由单个CDR区构成的 小分子抗体，亲和力较低。
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多功能抗体及其制备
一、双功能抗体
二、多功能抗体 三、抗体融合蛋白
抗体的人源化
基因工程抗体
基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为 平台，制备的生物药物总称。 由于目前制备的抗体均为鼠源性，临床应用时，对 人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从 而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，因 此，在 80 年代早期，人们开始利用基因工程制备 抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。
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Ig分子的结构模式图
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原理： 抗体同抗原结合的功能：决定于抗体分子的可变区 （V） 同种性免疫源性：决定于抗体分子的稳定区（C）。
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一、人—鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
在基因水平上将鼠源单 克隆抗体可变区和人抗 体恒定区连接起来并在 合适的宿主细胞中表达， 这种抗体称为人－鼠嵌 合抗体
Fv
ScFvPage Fra bibliotek1515
三、Fab和Fv抗体
（1）Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用 下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗 原的活性。
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（2）Fv 或 ScFv Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。
将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中 改成人源的，就成为了镶面抗体
抗体工程名词解释
31胞内抗体（intrabody）：将小分子抗体基因导入细胞内，使其在细胞内特定部位表达，通过与靶抗原的结合影响其生物学活性。
14.同种异型（allotypes）是指同一种属内不同个体间，由于遗传基因的不同，不同个体间免疫球蛋白分子具有不同的抗原决定簇。
18. F(ab，)2用胃蛋白酶水解lgG，可从重链铰链区二硫键近羧基端处断裂，从而获得一个大分子片段和若干小分子多肽片段。大片段保留铰链区及二硫键，为Fab双体，具有双价抗体活性，能与两个相应的抗原决定簇结合，称为F(ab，)2
3.抗原决定簇(antigenic determinant),又称表位(epitope)：是位于抗原物质分子表面或者其他部位的具有一定组成和特殊结构的化学基团。它的功能是与免疫系统中淋巴细胞上的受体结合以及与相应抗体分子结合。它是免疫原引起免疫应答以及抗体产生特异反应的基本结构单位。
4.决定簇互补区(complementarity-determining region,CDR)：氨基酸序列的变异并非随机均匀地分布在整个可变区，而是集中在几个较小的区段，这些区段被称为高变区或超变区或决定互补区。
47 抗原结合价（antigenic valence）：):是指能与抗体分子结合的抗原决定簇的总数。每一种半抗原可理解为单一的抗原决定簇，而天然抗原含有很多不同的抗原决定簇，它是带有大量多种“天然”半抗原的大分子。
6. 独特型 （idiotype)：是指存在于同一个体内，由不同B细胞克隆产生的Ig分子，其V区的抗原特异性各不相同。
蛋白质工程
蛋白质工程一、名词解释：1.蛋白质工程:是研究蛋白质结构和定点改造蛋白质结构的一门学科。
它运用基因工程手段，通过有控制的基因修饰和基因合成，对现有蛋白质进行定向改造，以期获得性能更加优良、更符合人类社会需要的蛋白质分子。
2. 抗体:指机体的免疫系统在抗原刺激下产生的可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
3. 人-鼠嵌合抗体：用鼠可变区和人恒定区融合形成的抗体。
4.人源化抗体：将鼠杂交瘤抗体的超变区嫁接到人抗体上形成的抗体。
5. 一级结构：是多肽链中氨基酸残基从N-末端到C-末端的排列顺序及二硫键的位置。
6.二级结构：是指多肽链主链借助氢键排列成特有的规则的反复构象。
7.超二级结构（结构模体）：一级顺序上相邻的二级结构在三维折叠中，彼此靠近、按特定的几何排布形成排列规则的、在空间结构上可以辨认的、可以同一结构模式出现在不同蛋白质中的二级结构组合体，称为结构模体。
8.发夹式β模体（或ββ组合单位）：两段相邻的反平行β链被一环链连接在一起构成的组合单位，其形貌与发夹相似，称为发夹式β模体。
9.希腊钥匙模体：四段紧邻的反平行β链以特定的方式来回往复组合，其形貌类似于古希腊钥匙上特有的回形装饰纹，故称为希腊钥匙型模体。
11.结构域：二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域。
12.三级结构：在二级结构、结构模体的基础上，进一步盘曲、折叠形成的，涉及主链、侧链在内的所有原子和基团的空间排布。
13.四级结构：是指在多条肽链组成的一个蛋白质分子中，各亚单位在寡聚蛋白质中的空间排布及亚单位间的互相作用。
14.优势构象：任何氨基酸侧链中的组成基团都可以绕着其间的C-C单键旋转，从而产生各种不同的构象。
AA分子的各种构象异构体并不是平均分布的, 总是以其最稳定的构象为重要的存在形式即为优势构象。
15.交错构象：是能量上最有利的排布，在这种构象中，一个碳原子的取代基正好处在另一个碳原子的两个取代基之间。
人鼠嵌合抗体
人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体特点（1）既保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力，又使鼠源性成分减少70%左右；（2）其人源Fc段能有效介导生物学效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖性细胞毒作用（CDC）等；（3）能自由地选择抗体的型、亚型、类、亚类、大小、结构域及添加糖基化位点等，以利用其不同的生物学特点及理化特性；（4）由高效真核表达载体和人抗体恒定区组成的嵌合抗体表达“盒子”可以容许插入不同的鼠单克隆抗体的可变区，缩短操作和研制周期；（5）操作相对简单。
技术与方法1.可变区基因克隆RNA提取及反转录取对数生长期的杂交瘤细胞株（约107个细胞），按照Trizol RNA提取试剂盒的说明书抽提细胞的总RNA，再进行RT-PCR扩增，回收纯化扩增产物备用。
扩增轻链、重链的V区基因根据Orlandi等（1989）设计的扩增小鼠可变区基因的引物，以上述扩增产物为模板扩增抗体基因的可变区。
回收重链VH(约360bp)、轻链VL（约330bp）片段，插入T-easy载体，各送3份样品测序。
测序所得序列在GeneBank核酸数据库中进行分类及同源性分析。
两端加入酶切位点根据上述PCR产物序列设计含酶切位点的引物，再次进行扩增，以使抗体可变区基因片段具有与载体相吻合的酶切位点，便于插入表达载体。
回收纯化扩增产物备用。
2.嵌合抗体表达载体构建改造含信号肽及人工Ig重链和轻链C区基因片段的单克隆位点（1）设计含重链信号肽起始位点序列及酶切位点Nhe I的上游引物HLF(KOZAK+4G，即GCCGCCATGG),和含Xho I工位点的下游引物HLR，以质粒pAc-κ-CH3为模板，扩增出重链信号肽基因片段；（2）设计含Xho I和Kpn I位点上游引物HCF,和含Furin(RKRR)序列及酶切位点Xba I 的下游引物HCR，以质粒pAc-κ-CH3为模板，扩增出重链恒定区基因片段；用Xho I 连接上述片段得到含重链信号肽、MCS及重链恒定区的基因片段；（3）设计含酶切位点Apa I的上游引物LLF,和含EcoR I位点的下游引物LLR,以质粒pAc-κ-CH3为模板，扩增出轻链信号肽基因片段；（4）设计含EcoR I和Hind III位点上游引物LCF,和含Pme I的下游引物LCR，以质粒pAc-κ-CH3为模板，扩增出轻链恒定区基因片段；用EcoR I连接上述片段得到含轻链信号肽、MCS及轻链恒定区的基因片段。
重组抗体的表达
3 总结
重组抗体的高效表达
2.1 表达宿主的选择 2.2 表达载体的结构排列 2.3 高效表达载体的构建 2.4 抗体基因序列的优化 2.5 信号肽的选择 2.6 抗体表达系统及其筛选的策略 2.7 细胞培养工艺优化
谢谢大家
RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的DNA 序列。 与转录调节因子协同促进转录。
hCMV、 CHEF-1a、 hEF-1a 、UBC
增强启动子的活性和功能，能够使基因转录频率明显增加的DNA Human CMV
序列。
Immediate early enhancer
能阻止临近调控元件对其所界定的基因启动 子起增强和抑制作用。
信号肽将加速此过程的完成，从而提高抗体的表达水平。
● 信号肽选择策略：①与表达蛋白质同源的分泌信号肽;
②与宿主表达细胞同源的分泌信号肽; ③机体内表达的分泌蛋白的分泌信号肽； ④替换高效表达蛋白质的信号肽序列作为重组抗体的信号肽； ⑤对原有抗体信号肽序列进行一级结构改造; ⑥替换某些病毒的蛋白质信号肽序列。
重组抗体的表达
1 抗体发展历程 2 重组抗体的高效表达
2.1 表达宿主的选择 2.2 表达载体的结构排列 2.3 高效表达载体的构建 2.4 抗体基因序列的优化 2.5 信号肽的选择 2.6 抗体表达系统及其筛选的策略 2.7 细胞培养工艺优化
1 抗体发展历程
重 组 抗 体：又叫基因工程抗体, 是利用DNA和蛋白质工程技术, 在基因水平上对免疫球蛋白分子进行适当加
免疫学名解
6．铰链区：在Ig分子重链间的二硫键区域、包括CH1和CH2之间的约30个左右氨基酸残基，含有大量的脯氨酸，富有弹性和伸展性，使Ig分子两臂能张合自如，有利于与不同距离的抗原决定簇结合，称为铰链区。
6.B7-CD28：是指提供T细胞活化第二信号的一对协同刺激分子，CD28表达于T细胞表面，B7表达于APC表面。
7.CD40-CD40L：是指提供B细胞活化第二信号的一对协同刺激分子，CD40表达于B细胞表面，CD40L表达于Th细胞表面。
8.ITIM：即免疫受体酪氨酸抑制基序，是指位于免疫细胞抑制性受体胞内段上的一种氨基酸基本序列，磷酸化后可以招募蛋白酪氨酸磷酸酶，对细胞活化发挥负调节作用。
2.体液免疫：是指由B细胞介导为主，产生抗体的特异性免疫应答过程。
3.外源性抗原：是指在抗原提呈过程中，APC从细胞外摄入的抗原。
4.初次应答：是指机体免疫系统首次接触某个抗原时所产生的免疫应答。
5.独特型网络：是指个体内抗体及抗原受体分子可变区的独特型表位与抗独特型通过互相刺激互相制约而构成的网络，在机体的免疫应答中起重要的调节作用。
4．凝集原：.指凝集反应中的抗原。
5． 凝集素：指凝集反应中的抗体。
6．试管凝集试验：是在试管内颗粒性抗原与相应抗体直接结合，在一定条件下，会出现肉眼可见的凝集现象。
7． 间接凝集反应：将可溶性抗原(或抗体)先吸附于适当大小的颗粒性载体表面，然后与相应抗体(或抗原)作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性疑集现象称间接凝集反应或被动凝集反应(passive agglutination test)。
抗体工程名词解释
18. F(ab，)2用胃蛋白酶水解lgG，可从重链铰链区二硫键近羧基端处断裂，从而获得一个大分子片段和若干小分子多肽片段。大片段保留铰链区及二硫键，为Fab双体，具有双价抗体活性，能与两个相应的抗原决定簇结合，称为F(ab，)2
7.改型抗体(reshaped antibody)：将鼠单抗的CDR移植到人单抗的骨架区上，有可能使人单抗获得鼠单抗的特异性，并最大限度地减少鼠单抗的异源性，仅有9%的序列来源于亲本鼠单抗，这种CDR移植的人单抗称作改型抗体。
8.dsFv：有时ScFv比其亲本抗体的亲和力明显降低，并常常显示聚集倾向，尤其在37°C时ScFv的稳定性较差，这与轻重链可变区是由作用力较弱的非共价键连接在一起有关。为了改善这一缺点有人在VH和VL之间导入了一个链间二硫键，构建了disulfide-stabilized FV，简称dsFv。
10.抗体导向的酶-前药治疗(ADEPT)：将针对肿瘤相关抗原的抗体与某些酶的偶合物注入体内，使其定位于肿瘤局部，再给予无细胞毒活性的前药，此前药在肿瘤局部被连接于抗体的酶转换为有细胞毒活性的药物，从而杀伤肿瘤细胞达到治疗目的。
11.噬菌体抗体库(phage antibody library)：将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之表达到噬菌体颗粒表面，就形成了噬
9.最小识别单位或分子识别单位(molecular recognition unit,MRU)：抗体与抗原的结合主要涉及CDR，而CDR中以CDR3尤其重链CDR3最为关键。基于这一事实有人用来自CDR的短肽模拟了亲本抗体的特异结合活性，证实CDR确有可能成为特异结合抗原的最小分子，被称为最小识别单位或分子识别单位。