(整理)基因工程试验.
基因工程试验指导
《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。
在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。
二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。
三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。
含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。
高中生物专项训练试题汇编47：基因工程(含答案详解)
高中生物专项训练试题汇编47：基因工程1．获得抗除草剂转基因玉米自交系A，技术路线如图。
为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是()①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点②G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点③酶切后，G基因形成的两个黏性末端序列不相同④酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同A．①③B．①④C．②③D．②④答案：A解析：为了防止Ti质粒被切成多个片段而失去应有功能，每种限制酶只有一个酶切位点，①正确；若编码蛋白质的序列中，有限制酶酶切位点，会使序列不能合成蛋白质，②错误；酶切后形成的黏性末端不同，保证了G基因不发生自身环化，③正确；若形成的黏性末端序列相同，会使Ti质粒发生自身环化，④错误，因此选择的原则是①③，故A项正确。
2．用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。
以下叙述不正确的是()A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B．图2中酶切产物可用于构建重组DNAC．泳道①是用SalⅠ处理得到的酶切产物D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA答案：D解析：分析图1可知，XhoⅠ有2个酶切位点，SalⅠ有3个酶切位点，这些酶切位点不重合，所以图1中两种限制酶识别的核苷酸序列不同，故A项正确，不符合题意。
图2中的酶切产物可与用同种限制酶处理的载体构建重组DNA，故B项正确，不符合题意。
由图2可知，泳道①得到了四种酶切产物，说明泳道①是由具有3个酶切位点的酶处理后得到的，即用SalⅠ处理得到的酶切产物，故C项正确，不符合题意。
限制酶识别的是双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA，不是识别单链DNA，故D项错误，符合题意。
3．(经典题，6分)如图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。
以下相关叙述，正确的是()A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异答案：D解析：构建表达载体需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶，故A项错误。
基因工程试验设计
基因工程试验设计基因工程是指通过基因操作技术对生物体的遗传信息进行改造和调控的一种技术手段。
在基因工程中，通过对目标生物体的基因进行剪接、插入、删除等操作，可以实现对生物体性状的改变和遗传特征的调控。
基因工程技术在医学、农业、环境保护等领域具有广阔的应用前景。
1.实验目的：明确实验的目的和预期结果，例如改变生物体的特定性状、提高生物体的产量或抗病性等。
2.选择目标生物体：根据实验目的选择适合的目标生物体，可以是细菌、真菌、植物、动物等。
3.确定基因操作的方式：基因工程技术有多种操作方式，如基因剪接、基因插入、基因删除等。
根据实验目的和目标生物体的特点选择合适的操作方式。
5.确定基因传递方式：确定基因将如何传递到目标生物体中，可以采用转染、转化、转基因等方式。
6.制备实验材料：根据实验设计制备所需的实验材料，包括目标生物体的培养基、基因操作所需的酶、载体等。
7.设计对照组和实验组：根据实验目的设计对照组和实验组，对照组不进行基因操作，实验组进行基因操作。
8.确定实验条件和时间：确定实验的条件和时间，包括温度、湿度、光照等条件，以及实验的持续时间。
9.设计实验步骤：根据实验目的和操作方式设计实验步骤，包括基因操作、培养、鉴定等。
10.实验数据的分析和解读：根据实验结果进行数据分析和解读，判断实验是否成功，预测实验结果对生物体的影响。
基因工程试验设计需要综合考虑实验的科学性、技术可行性和安全性等因素。
在设计过程中，需要进行充分的文献调研和数据分析，确保实验的有效性和可靠性。
同时，也需要遵循伦理规范和相关法律法规，保证生物安全和环境保护。
总之，基因工程试验设计是对基因工程技术进行验证和探索的重要过程。
通过合理的设计和操作，可以实现对生物体的遗传信息进行改造和调控，为生物科学研究和实践应用提供重要支持。
基因工程实验报告
基因工程实验报告引言基因工程是现代生物技术的一个重要分支，通过对生物体基因的修改和重组，可以创造出具有特定功能的生物体。
本次实验旨在探究基因工程在农业、医学等领域的应用，以及可能带来的潜在风险和争议。
实验方法1. 筛选目标基因：首先，我们在实验中选择了对叶绿体功能有重要影响的一个基因作为目标基因。
2. 基因克隆：通过PCR技术，将目标基因从细菌DNA中放大，然后将其插入载体DNA中。
3. 转化目标生物体：将重组的载体DNA转入植物叶片细胞中，借助几丁质体、热激冲击等方法促使基因转化成功。
4. 筛选阳性转化率：通过筛选培养基中的抗性选择制剂，筛选出转化成功的阳性细胞。
5. 验证目标基因的表达：通过PCR扩增和基因芯片技术验证目标基因在转化植物中的表达情况。
实验结果1. 实验结果显示：我们成功将目标基因插入到植物叶片细胞的染色体中，并且获得了一定比率的阳性转化植株。
2. 鉴定转化植株：对转化植株进行证实鉴定，确保目标基因已经整合到植株基因组中，且稳定表达。
3. 表达验证：通过PCR扩增和基因芯片分析，确定目标基因在转化植物中得到了表达，并且表达量较高。
4. 性状鉴定：对转化植物进行生长发育、形态结构、生理生化等方面的综合性状鉴定，结果显示转化植物与野生型无显著差异。
讨论基因工程技术的应用：本次实验展示了基因工程技术在农业生产中的应用前景，通过将具有耐逆性、抗病虫害等功能基因导入植物，可以提高植物的产量和抗逆性。
潜在风险和争议：但是，基因工程也伴随着一系列争议和风险，如转基因植物可能对环境造成影响，转基因食品可能对人体健康产生潜在影响，因此需要严格的监管和评估。
结论通过本次实验，我们成功地验证了基因工程技术的可行性，展示了其在农业和生命科学领域的广阔应用前景。
然而，我们也要看到基因工程技术所带来的潜在风险和争议，需要谨慎评估和监管。
基因工程是一把双刃剑，只有正确使用才能实现其最大的利益。
愿基因工程技术为人类带来更多福祉。
高中生物实验大全(已整理好A4)
高中生物实验大全(已整理好A4)实验一：营养成分的定性检测实验所需材料：牛奶、蛋白质、蔗糖、淀粉、食盐、饭菜、水果等步骤：1. 取一定量的样品，分别加入一些化学试剂；2. 观察样品颜色的变化、气味的变化、沉淀的产生，可初步判断样品中是否存在对应的营养成分。
实验二：光合作用实验所需材料：苗叶、酒精、碘液、盐酸、取样器、滴定管、显微镜等步骤：1. 将新鲜苗叶置于室内或光源下；2. 通过取样器、滴定管等工具分别抽取叶绿素溶液、葡萄糖溶液、碳酸盐溶液，以及加入一些其他化学试剂；3. 在相应的试管中进行反应，并观察变化。
实验三：DNA分离实验所需材料：动物细胞、实验室试剂、离心机、显微镜等步骤：1. 从动物组织中取出细胞；2. 通过试剂对细胞进行破碎、提取DNA；3. 经过离心机离心，提取分离后的DNA，并进行观察和测量。
实验四：发酵实验所需材料：酵母、糖、面粉、水、试管、鱼缸等步骤：1. 将面粉、糖和水混合制成糊状物，加入酵母；2. 在试管或鱼缸中进行发酵；3. 观察发酵过程中气泡的产生和颜色的变化等。
实验五：细胞培养实验所需材料：培养皿、细胞培养基、移液管、显微镜等步骤：1. 选择适合的培养皿，添加细胞培养基；2. 将待培养的细胞加入培养皿中，封闭培养皿；3. 放入恒温箱中进行培养；4. 观察细胞的生长状况和数量变化等。
实验六：人类遗传与基因工程实验所需材料：血样、PCR试剂盒、电泳仪等步骤：1. 取血样提取人类基因；2. 通过PCR扩增目标序列；3. 将PCR产物进行电泳，观察条带的出现及大小等。
实验七：缩阴菌的筛选实验所需材料：不同来源的缩阴菌样本、琼脂平板、各种营养成分培养基、培养箱等步骤：1. 将各种缩阴菌样本分别制备到琼脂平板上培养；2. 观察不同缩阴菌的生长情况，选择生长状况最好的样本；3. 根据该菌株的特点，选择适合的营养成分培养基，进行后续培养。
实验八：炭水化合物和脂质的检测实验所需材料：红蜡笔、苯甲酸、酒精等步骤：1. 取一块白纸，涂上红蜡笔；2. 按照一定比例加入苯甲酸、酒精等溶剂，将溶液滴入红蜡笔上，观察颜色的变化，判断是否存在炭水化合物和脂质。
基因工程实验报告
基因工程实验报告生命学院生技114班摘要：一、本次试验内容概况如下：（1）准备植物材料：小麦幼苗（2）对基因进行双酶切，准备的载体进行双酶切，转移Top10菌株。
（3）进行PCR检测，查看检测结果是否成功，成功则证明转入了BL21菌株，进行表达过程。
（4）进行电泳。
（目的蛋白的大小会知道，高诱导。
证明符合预期结果。
说明此区域该目的基因大量表达，其他区域目的基因没有大量表达。
）（5）用Weatern杂交去证明。
因为载体是已知的，在相应位置杂交出杂带，证明的该目的基因确实克隆到了载体上，并且蛋白质进一步进行了表达。
二、实验流程：用Trizol 法提取小麦总RNA→用RT-PCR技术扩增GAPDH截短体基因→用琼脂糖凝胶电泳进行片段胶回收→表达载体pGEX4T—1的构建→表达菌株转化→诱导表达→Western杂交关键词：RNA提取、RT-PCR扩增目的基因cDNA、琼脂糖电泳、质粒提取、表达载体的目的片段的酶切、载体和外源DNA的连接、感受态细胞的制备及转化、重组质粒的筛选、鉴定及转化、目的基因诱导表达、Western Blotting检测、DNA的传化与回收、培养基制备和细菌培养具体实验过程：一、<一>小麦总RNA提取1、材料设备：小麦幼苗、高速冷冻离心机、低温冰箱、核酸电泳设备、液氮罐、研体、剪刀、镊子。
2、试剂：（1）0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）（2）器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。
剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。
（3）无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶装重蒸馏水，按0.01%的DEPC（体积/体积），处理过后高压灭菌。
（4）Trizol（5）75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
基因工程实验
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五、实验注意事项
1 用微波煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的 1/3，否则易溢出
2 煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变 形，并减少漏胶的机会
加入等体积的氯仿， 12000rpm，离心5分钟，取上清
加入1/10体积的3MNaAc，加2倍体积的预冷的无水乙 醇，混匀。
置于-70℃冰箱约10min以上或者-20℃冰箱30min至 数个小时
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12000rpm离心15分钟（4℃），倒掉酒精，离心几秒，
用移液枪尽可能除去酒精
用0.5ml70 %酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉 酒精
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当加入中性缓冲液调和时，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA 不能复性，它们之间交联形成不溶性网状 结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结 合沉淀下来。
通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA 及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂 的RNA可用RNaseA消除。再用酚／氯仿 处理，可除残留蛋白质
真核生物的基因组DNA为双螺旋结构，在在碱性溶 液中，双链DNA氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生 变形，而基因组DNA分子量相对较大，在碱性PH条 件下其线性的大分子量基因组DNA不能复性，而形成 缠连的网状结构与蛋白质等共沉淀。
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2 异丙醇和无水乙醇对核酸沉淀的优缺点 答：异丙醇和乙醇都能与与任意比例的水相混合。异 丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，乙醇可以去 盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。 异丙醇沉淀量多，但杂质也多，增加了后续实 验风险。其优点为：所需容积小且速度快，适用于 浓度低，而体积大的DNA样品的沉淀。一般不需要 在低温条件下长时间放置。缺点为：易使盐类（如 NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙 醇难以挥发除去 乙醇是沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐 类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处， 不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品 容积的95％乙醇可有效沉淀DNA。其缺点是总体积 较大。需在-20放置很长时间，30分钟-1小时，同 时DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分DNA溶 解损失
基因工程试卷及答案 (2)
基因工程试卷及答案一、名词解释题1.同尾酶：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可以产生相同的黏性突出末端。
这些酶统称为同尾酶。
p222.星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为星星活性。
p263.基因克隆：通过体外重组技术，将一段目的DNA经切割、连接、插入适当载体，并导入受体细胞扩大形成大量子代分子的过程。
p394.基因文库：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体，称之为基因文库。
p395.包涵体蛋白：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起所形成的没有生物活性的、无膜裸露结构。
6.反义核酸：是指一些可以通过碱基互补原则与被感染细胞内部的某个靶标mRNA或DNA结合，抑制或封闭该基因的转录和表达，或切割mRNA使其丧失功能的人工合成的单链反义分子。
p3467.反义DNA:：称反义寡核苷酸，是一种人工合成的、能与mRNA互补的、用于抑制翻译的短小反义核酸分子。
p3478.RNA干扰（RNAi）：是指对应与某种mRNA的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（dsRNA）分子使mRNA发生特异性降解，导致其不能表达的转录后基因沉默现象。
p3509.限制性内切酶：是一种能识别双链DNA中的特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核苷酸酶。
p1510.基因治疗：是将目的基因放进特定载体中导入靶细胞或组织，通过替换或补偿引起疾病的基因，或者关闭或抑制异常表达的基因来克服疾病的治疗方法。
二、选择题1、DNA分子SexAI每隔多少个碱基会出现一个酶切位点（D ）A、256B、1024C、4096D、163842、下列序列中认为哪一个最有可能是二类限制酶切位点（C ）A、GAATCGB、GCTATGC、AAATTTD、AGGGGCA3、下列当A260/A280=（A ）时，为纯DNA的是。
基因工程实验
基因工程实验详细步骤一、目的基因LK的扩增——PCR（含电泳）（一）目的基因LK的扩增——NE201（1）实验准备材料：rLK重组质粒（模板）试剂：PCR试剂盒用具：移液枪（2.5μl、10μl、50μl）以及相应枪头（盒）、EP管（100μl）、EP板（大、小）；冰袋两只、手套、废液桶仪器：离心机（14000rpm）、PCR扩增仪（2）反应体系（50μl）试剂（按照加样顺序）用量dH2O23μL重组质粒1μL上游引物F 0.5μL下游引物R 0.5μLTaq酶25μL（3）反应条件预变性95℃，10min变性95℃，30s退火56.6℃，35s延伸72℃，40s最终延伸72℃，10minTIP：*吸取或加入液体时，枪头尽量少伸入，可避免气泡产生；若有气泡，需10000rcf离心1min 再进行下一步实验*勤换枪头，避免污染试剂或产物*任何移液枪用完后及时调回最大量程*仪器用完后及时关闭（二）LK PCR产物的电泳——NE217（1）实验准备材料：LK PCR产物试剂：去离子水、50×TAE缓冲液、电泳用琼脂糖、6×Loading Buffer、DL1000marker（D526A）、Ultrapower DNA Stain染液用具：钥匙、称量纸、橡皮筋、100ml锥形瓶、50ml量筒；制胶槽、制胶卡、制胶梳（18teeth）；移液枪（10μl、1000μl）及相应枪头（盒），100μl EP管，EP板（大、小）；冰袋两只、手套（包括塑料和麻布）、废液桶仪器：电子天平、微波炉、电泳仪（含电泳槽）（2）制胶（3%）1. 称取电泳用琼脂糖0.6g（即总体积20ml 的3%），小心倒入100ml锥形瓶中2. 取TAE缓冲液400μl于50ml量筒中，去离子水定容至20ml（实为电泳缓冲液）3. 将量筒中液体转入锥形瓶中，盖上吸量纸，用橡皮筋封好，再用步骤2中用剩的枪头扎一个小孔4. 将制胶梳（18 teeth）、制胶卡、制胶槽洗净并用吸水纸擦干，组装好5. 至于微波炉中，注意观察，煮沸后立即拿出（戴上麻布手套），轻轻晃匀，重复2-4次，至胶完全澄清均一为止6. 及时将胶转入准备好的制胶槽，凝固30min后，连着横条纹塑料板一起放入电泳槽中（胶孔靠近负极）（3）加样和电泳1. 在EP管内分别加入A. DL1000marker 5μl，染液1μl；B. PCR产物5μl，6×loading buffer1.2μl，染液1μl2. 将样品全部转入胶孔中。
基因工程实验报告2012
实验一植物总DNA的提取、纯化一、实验目的：掌握从植物的组织（细胞）中提取DNA的方法。
二、实验原理：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物。
在高盐浓度条件下，核酸以稳定形式与去污剂CTAB络合于溶液中，当降低溶液浓度到一定程度时，CTAB与核酸的复合物从溶液中沉淀下来，通过离心就可将该复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB溶于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB溶于乙醇中。
苯酚、氯仿、异戊醇混合液抽提更好，但是苯酚较难除去。
EDTA螯合Mg2+或Mn2+，抑制Dnase（DNA酶）的活性，防止降解DNA。
三、仪器、材料与试剂：材料：青皮的叶子（野外采集，冷冻于-20度的冰箱中）。
主要仪器：水浴锅、台式高速离心机、研钵、涡旋仪（避免破坏核酸链，震荡时间要短，混匀即可，可以用手来混匀）、移液枪等。
主要试剂和材料：CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）裂解液：2%CTAB（W/V）、20 mmol EDTA(pH8.0)、100 mmol Tris-HCl (pH8.0)、1.4 mol NaCl 。
氯仿：异戊醇（24：1）。
异丙醇，无水乙醇。
TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA。
四、实验步骤：1. 取2g左右的嫩叶子放入预冷的研磨中，第一次加入较多的液氮，开始先慢慢磨开后研磨中待液氮量较少时快速磨动，如发现液氮挥发完迅速加入液氮（加入时动作要轻，防止粉末溅起），重复两次。
2. 将粉末加入预冷1.5mlEP管中（约1/3）后，加入事先700ul65℃水浴的2%CTAB和30ul室温β-巯基乙醇（剧毒），轻轻摇动混匀。
放入65℃水中水浴40min，每10min取出震荡使沉淀散开。
3. 取出后冷却至室温，加入氯仿/异戊醇（24：1，V/V）至满管（加药品千万注意别让药品污染桌面及手上，有必要可带面罩），剧烈震荡后12000rpm离心10min，取上清加入500µl 氯仿/异戊醇12000rpm 离心10min。
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基因工程实验流程实验一丹参总DNA的提取实验目的：掌握从植物或动物的组织（细胞）中抽提DNA的方法。
实验材料：丹参叶片实验器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，研钵和杵，离心管，微量移液器，枪头实验步骤：第一次使用前请先在漂洗液WB和结合液PQ中加入指定量的无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!取所需适量裂解液PL放置在65℃预热，使用前加入β-巯基乙醇到终浓度2%。
1.取适量植物组织（新鲜组织100mg 或干重组织30 mg）在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。
2.转移细粉到一个1.5ml离心管，不要解冻，加600μl 65℃预热的裂解液PL (确认已加入β-巯基乙醇至2%)，剧烈涡旋振荡混匀，用大口径枪头轻柔吹打帮助裂解。
如果组织裂解困难，可根据需要加一个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。
3.65℃水浴20-60分钟，在水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
可选如果组织干燥或者产量低，可以适当延长水浴时间。
如RNA残留多，可在水浴前加入6μlRNA酶（20mg/ml）。
4.加入700μl氯仿/异戊醇（体积比24：1混合），颠倒充分混匀几分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm 离心5分钟。
若提取的植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前用等体积酚/氯仿（1：1）抽提一遍。
5.小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管，注意不要吸到界面物质。
如上清比较浑浊，则需要重复步骤4一遍，直到得到透亮上清。
6.较精确估算上清量，加入1.5倍体积结合液PQ （请先检查是否已加入无水乙醇!）后立刻涡旋，充分混匀。
此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。
7.将上一步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放- 5 - 入收集管中）13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液（先加700μl离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心）。
8.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。
9.加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
10.加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
11.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热），室温放置3-5分钟12,000rpm 离心1分钟。
将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果预计和需要产量高，可增大洗脱体积，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
13.DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20 ℃。
按照植物总DNA提取试剂盒操作说明。
1%琼脂糖凝胶电泳检测注意事项：1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm 的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.开始实验前将需要的水浴先预热到65℃备用。
3.需要自备氯仿/异戊醇（体积比24：1混合）、无水乙醇和β-巯基乙醇。
4.结合液PQ 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。
若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.不同来源的植物组织材料中提取DNA的量会有差异，一般100mg新鲜组织典型产量可达3-25μg。
6.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。
也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。
用水洗脱DNA应该保存在－20℃。
实验结果：本组实验结果是第九孔和第十孔，其中第九孔的DNA 提取效果较第十孔提取效果好。
两空之间的差异可能是由于两个离心管中添加的植物量不一样，所以最后提取的量不一样。
实验结果分析：1.在液氮研磨叶片的时候，研磨不够充分，且在向离心管中添加的时候，添加的量不多，速度慢，导致氧化，对提取效率造成很大影响。
2.可能是因为在提取DNA的最后步骤向吸附管中添加的洗脱液太多150ul，导致DNA的浓度过低，所以条带不亮。
3.在第九步中，将吸附柱放置室温晾干，可能晾置时间不足，导致添加的有机溶剂没有完全挥发，而有机溶剂影响了DNA的提取。
实验二质粒DNA的提取及酶切检测实验目的：学习和掌握小量提取质粒的方法。
实验原理：质粒提取（碱裂解法）根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH12.0-12.6的碱性条件下，线性的染色体DNA变性，双螺旋解开，而共价闭环质粒DNA仍保持双链紧密缠绕的状态。
将pH 调至中性并保持高盐浓度的条件下，染色体DNA之间形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS作用下形成沉淀，而共价闭环质粒DNA保持可溶状态，经离心可将大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质除去，质粒DNA留在上清液中，用酚、氯仿抽提，可进一步纯化质粒DNA。
实验材料：含有pET28a质粒的大肠杆菌H5а；构建好的含有目的基因SRP的pET28a-SRP质粒的大肠杆菌DH5а实验器材：离心机、水浴锅、电泳仪、离心管，微量移液器，枪头，等实验步骤：质粒提取按照试剂盒操作说明。
1．用1.5ml离心管收集1-5ml菌液。
12,000rpm离心1min，弃上清。
应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。
菌量过大可能导致溶菌不充分，纯化时会影响质粒纯度。
菌体的体积与质粒拷贝数参见注意事项。
2．250μl溶液Ⅰ/RNaseA混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。
室温静置1-2min。
初次使用本试剂盒时，请将RNaseA全部加入到溶液Ⅰ中，均匀混合后于4℃保存。
可保存6个月。
●不要残留细小菌块。
菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA得率的高低。
●室温静置1-2min是为使溶液中的RNA被充分降解。
3．加入250μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀6-10次。
室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
●若溶液Ⅱ出现沉淀，请于37℃保温溶解。
待恢复至室温后使用。
沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。
●不可剧烈混和，否则会使染色体DNA断裂。
●此步骤不宜超过5min。
4．加入350μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。
此时会出现白色絮状沉淀。
5.12,000rpm室温离心10min，收集上清。
6．将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。
●如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积（800μl），可将上清分次加入DNA纯化柱中。
7.12,000rpm离心1min，弃滤液。
●此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱的硅胶膜上。
8．加入500μl溶液PB/PE（去蛋白液），12,000rpm离心1min，弃滤液。
●此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。
9．加入500μl溶液WB，12,000rpm离心1min，弃滤液。
●溶液W初次使用前用无水乙醇按1:1.5稀释，即含60%乙醇。
10．加入500μl溶液W，12,000rpm离心1min，弃滤液。
11.12,000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。
12．将DNA纯化柱置于新的离心管中。
向纯化柱中央处，悬空滴加50-100μl溶液Eluent，室温放置2min。
●12,000rpm离心1min，管底即为高纯度质粒DNA。
质粒DNA 于-20℃保存●溶液Eluent可用无菌双蒸水代替，但其pH需为8.0-8.5。
溶液Eluent的加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。
酶切反应体系：载体pET28a-SRP 30ulXho I 1ulHind III 1 ul双酶切buffer 5 ul超纯H2O 13ul37度，3小时。
电泳检测分析注意事项;1.使用前往准备好的solution中加入RNaseA；2．浓缩的wash buffer用乙醇稀释；3．所有步骤都在室温下操作。
实验结果：实验结果分析实验三目的基因的克隆[实验目的]通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
[实验原理]多聚酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程。
在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。
1，变性：加热使模板DNA在高温下(94℃)变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2．退火：使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。
3．延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按5，+3，方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Tag聚合酶。
[仪器、材料与试剂] ·(一)仪器1．PCR热循环仪2．琼脂糖凝胶电泳系统 3. 吸头、0.2ul PCR管，微量移液器，(二)材料：质粒(三)试剂1．2×PCR Master Mix (含dNTP，Tag酶，缓冲液)2．质粒DNA3．引物（上、下游引物浓度均为约10umol/ul）F:5-CCC AAGCTT CTTTTTAATCCTTCCCTCAAATATC-3（Hind III）R: 5-CCG CTCGAG GGGACAATGAAAAAGCTGATAAC-3 (Xho I) 4．灭过菌的millipore 水5．琼脂糖6．DNA相对分子质量标准物DL2000[实验方法]1．学习PCR仪的使用，设定反应程序：反应程序为：94℃变性3 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1min20s，30个循环；72℃延伸8 min。
4℃保存2．加样（冰上操作）：50ul反应体系，其中上游引物1ul，下游引物1ul，丹参DNA 模板2 ul或质粒DNA模板1ul，2×PCR Master Mix 25ul, 灭菌水21或22ul。