96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤
β2-微球蛋白(β2M)检测试剂盒 SEA260Hu使用说明书
[需自备的设备及试剂]
1、450±10nm 滤光片的酶标仪（建议仪器使用前提前预热） 2、单道或多道微量移液器及吸头 3、稀释样品的 EP 管 4、蒸馏水或去离子水 5、吸水纸 6、盛放洗液的容器 7、0.01mol/L（或 1×）磷酸缓冲盐 (PBS)，pH=7.0-7.2
[试剂盒的储存及有效期]
2、 血浆：用 EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的 30 分钟内于 2-8oC 1,000×g 离心 15 分钟，
取上清即可检测，或将上清置于-20oC 或-80oC 保存，避免反复冻融。 3、 尿液：请收集清晨第一次尿液（中段尿），或 24 小时尿液，2,000×g 离心 15 分钟后收集上清，并将标本保
[实验原理]
将β2M 抗体包被于 96 孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中β2M 与连接于固相载 体上的抗体结合，然后加入生物素化的β2M 抗体，在将未结合的生物素化抗体洗净后，加入 HRP 标记的亲和素， 再次彻底洗涤后加入 TMB 底物显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品浓度。
[标本处理]
1、 本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本 的可能使用量，预留充足的样本。
2、 实验前应预测标本含量，如果标本浓度过高，应对标本进行稀释，使稀释后的标本符合试剂盒的检测范围， 计算时再乘以相应的稀释倍数。
3、 血清或血浆标本推荐稀释大约 500 倍，如：稀释 500 倍，首先取 20μL 血清或血浆样本加入 180μL PBS， 做 10 倍稀释，然后再取 10 倍稀释后的样本 10μL 加入 490μL PBS 即可，稀释的每一步都需混匀。标本使 用 0.01mol/L 的 PBS 稀释(PH=7.0-7.2）。
DL-96Ⅲ细菌测定系统操作规程
DL-96Ⅲ细菌测定系统操作规程1.目的规范DL-96Ⅲ细菌测定系统操作规程，保证检验质量。
2.原理细菌测定系统，是对已分离培养出来的细菌、真菌等微生物进行种、属鉴定，并同时测定该菌对各种抗菌药物MIC的专用设备。
细菌测定系统由检测装置、嵌入式控制装置组成，测定系统采用比色、比浊法判定随机体外诊断试剂板微量反应孔阴阳性结果进行检测和分析，并自动生成细菌种类和抗菌药物MIC半定量分析结果。
试剂板由生化反应孔和抗菌药物MIC测定孔组成。
在生化反应孔中加入细菌悬液，经35-37℃孵育，在细菌代谢作用下生化反应直接颜色变化或经加入显色剂后产生颜色变化；抗菌药物MIC采用微量肉汤稀释法，加入还有细菌的MH肉汤培养基，经35-37℃孵育，根据试验孔是否出现浑浊（沉淀）确定细菌是否生长。
测定系统采用比色法对各项生化反应进行结果判定，根据细菌生化反应的概率来完成细菌的鉴定；测定系统通过比浊法对抗生素进行MIC半定量测定分析MIC值。
3.工作环境环境温度：5-40℃相对湿度：≤80% 大气压力：76KPa-106 KPa 电源电压：AC220V±22V，50Hz±1Hz 光照度：避免阳光直射。
4.操作程序4.1 使用本试剂板的基本要求：4.1.1无特殊营养要求的革兰氏阳性菌、革兰阴性菌和真菌等病原菌4.1.2 18-24小时分离培养的单个纯菌落（或纯培养物）。
4.2 随机试剂板的选择：4.2.1 根据待测菌的培养特性、菌落特征、氧化酶实验、触酶试验结果以及革兰染色情况，选择好相应的试剂板。
4.2.2 试剂板的选择DL-96E 、DL-96NE、 DL-96STAPH、DL-96STREP、DL-96FUNGUS4.3 试剂板的接种4.3.1 DL-ZD1浊度仪的校准连接浊度仪电源，仪器运行正常，依次放入调零样品和调幅样品，调节仪器测试分别到达“0”和“100”即可使用。
4.3.2 菌悬液与药敏液的配置菌悬液制备：挑取纯培养单个菌落于稀释液瓶内壁研磨呈细菌悬液，要求如下：DL-96E 、DL-96NE、 DL-96STAPH的菌悬液都制备0.5麦氏单位；DL-96STREP菌悬液制备2麦氏单位；DL-96FUNGUS菌悬液都制备1麦氏单位；药敏液的配置：具体请见细菌测定系统随机体外诊断试剂板使用说明书4.3.3 试剂板的接种与孵育具体请见细菌测定系统随机体外诊断试剂板使用说明书。
biofilm
生物被膜（BF）的定义
微生物有组织生长的聚集体。
细菌不可逆的附着于惰性或活性实体的 表面，繁殖、分化，并分泌一些多糖基 质、将菌 体群落包裹其中而形成的细 菌聚集体膜状物。
单个生物被膜可由同种或不同种微生物 形成。
生物被膜（BF）的组成及结构
包括分泌的多糖蛋白、多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白 等多糖蛋白复合物。 粘附细胞之间散在着一些“水通道”,即细菌群落之间 存在的充满环境液体的内隙。 成熟生物被模型从外到内包括主体生物膜层、连接层、 条件层、基质层。
三、氧浓度变化对铜绿假单胞菌生物被膜 形成的影响
研究无氧、低氧(10%氧浓度)、正常氧(20%)及高氧(30%、 40%、50%、60%)七个不同氧浓度条件下生物被膜和藻 酸盐的产生情况。 实时定量检测不同氧浓度对Lasl、RhlI、algU表达的影响 建立生物被膜生成量和Lasl、RhlI、algU表达量之间的关 系图。
研究生物被膜（BF）的意义
近年来随着医学界对某些环境中常见细菌所致的一些 慢性和顽固性疾病的深入了解 ,发现生物膜是导致这 些细菌性疾病难以根治的主要原因 。 以生物膜形式存在的细菌不同于浮游细菌 ,它们对抗 生素等杀菌剂、恶劣环境及宿主免疫防御机制有很强 的抗性,生物膜内细菌在生理、代谢、对底物的降解或 利用和对环境的抵抗能力等方面都具有独特的性质
生物被膜（BF）的体外鉴定
一、96孔微量板定量检测法
是目前各实验室广泛应用的定量检测细菌生物被膜的 公认方法。目前几乎所有的细菌都以该方法被报道。 不仅能定性细菌形成生物被膜，而且和不同的染色方 法结合还能定量计算细菌形成生物被膜的能力。
生物被膜形成曲线的测定
食源性克雷伯氏菌的分离鉴定与生物膜形成特性
食源性克雷伯氏菌的分离鉴定与生物膜形成特性汤纯; 史云娇; 卞欢; 孙芝兰; 刘芳; 朱云龙【期刊名称】《《江苏农业学报》》【年(卷),期】2019(035)005【总页数】6页(P1216-1221)【关键词】新鲜鸭血; 克雷伯氏菌; 生物膜; 胞外多糖【作者】汤纯; 史云娇; 卞欢; 孙芝兰; 刘芳; 朱云龙【作者单位】江苏省农业科学院农产品加工研究所江苏南京 210014; 扬州大学旅游烹饪学院江苏扬州 225127【正文语种】中文【中图分类】TS251.7克雷伯氏菌属细菌(Klebsiella sp.)，是重要的条件致病菌和医源性感染菌，广泛存在于人的肠道和呼吸道中，在人体免疫力低下时，会引发败血症等疾病[1]。
经过临床病理研究和细菌学研究发现克雷伯氏菌肠道感染的可能性远大于呼吸道感染的可能性，现已检测出多起克雷伯氏菌病例，可能与食用地沟油等非正规渠道生产的食品有关[2]。
Hamza等[3]对埃及的5个肉鸡场调查发现，在肉鸡及养殖人员的粪便、饮用水中产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯氏菌检出率较高。
韩坤等[4]从水貂中分离得到10株肺炎克雷伯氏菌，其中大部分菌株对多种临床常用药物表现出耐药性，对青霉素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、三代头孢菌素类及磺胺类抗生素的耐药性较高，临床治疗十分困难。
同时，克雷伯氏菌属细菌能产胞外多糖[5]，有较强的生物膜形成能力。
生物膜，又称为生物被膜，是微生物有组织生长的聚集体，能够在有生命、无生命的物体表面附着[6]。
在自然界中，大部分微生物以生物膜的形式存在[7]，同时生物膜中大量的黏性基质形成了一个物理屏障，使抗生素和宿主的免疫系统不能对细菌产生有效的攻击[8-9]。
本研究利用结晶紫染色法[10]，以在取血过程中极易被微生物污染的新鲜鸭血[11-13]为样本，定量检测鸭血中优势腐败菌的生物膜形成能力。
以其中1株成膜能力最强的克雷伯氏菌K6为目标菌株，测定该菌7 d内形成的生物膜内菌数及胞外多糖含量，研究其成膜特性，为今后禽体取血加工过程中腐败微生物的控制及该菌生物膜的抑制剂开发提供基础。
Biolog微生物鉴定步骤
氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/Aw
则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)
氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A
则该菌株为肠道菌(GN-ENT)
如果菌株①需要在巧克力培养基上或需要6.5% CO2培养
②在BUG+B培养基上生长非常差
形成针尖大小的菌落
那么可以认为这些菌是苛生菌(GN-FAS)
非肠道菌 GN-ENT
肠道菌 GN-FAS
苛生菌 GP-COCCUS-ROD杆球菌、GP-COCCUS球菌、GP-ROD杆菌 GP-ROD
（芽孢杆菌） AN
厌氧菌 YT
酵母菌 FF
丝状真菌 扩大培养基 BUG+B BUG+B 巧克力培养基 BUG+B BUG+M+T BUA+B BUY 2%ME 培养温度 30℃ 35-37℃ 35-37℃ 35-37℃ 30℃ 35-37℃ 26℃ 26℃ 培养气体 空气 空气 6.5% CO2 空气或6.5% CO2 空气 无氢气的厌氧环境 空气 空气 接种液类型 GN/GP-IF GN/GP-IF+T GN/GP-IF+T GN/GP-IF+T GN/GP-IF AN-IF 水 FF-IF 接种浊度/
应把鉴定板拿出冰箱
让鉴定板恢复到常温
因为有些菌种（如Neisseria ）对温度的快速变化很敏感
6. 仔细校正浊度计
接种菌悬液的浊度应在规定的范围内
7. 鉴定板中包含多种对温度和光照敏感的物质
如果个别孔出现棕黑色
说明碳源已经被降解
有时候
在保质期内或超过保质期不长的时间里
SHENTEK 质粒 DNA 残留检测试剂盒 （PCR-荧光探针法） 说明书
SHENTEK®质粒DNA残留检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书货号：SK030217PL100版本：A/4仅供研究用湖州申科生物技术有限公司⏹试剂盒简介SHENTEK®质粒DNA残留检测试剂盒用于定量检测基因治疗产品中质粒DNA残留的专用检测试剂盒，如CAR-T细胞治疗中慢病毒载体制备相关的质粒DNA。
本试剂盒利用Taqman探针原理，通过各质粒共有DNA序列，如ColE1/pMB1/pBR322/pUC来源的复制子，定量检测样本中质粒DNA的残留。
客户可以事先将质粒DNA序列给本公司技术人员进行确认。
本试剂盒检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到102copies/μl。
试剂盒配套有质粒DNA定量参考品。
本试剂盒与SHENTEK®宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样本中残留的微量质粒DNA。
⏹试剂盒成份表1.试剂盒组份组份装量储存条件Plasmid DNA定量参考品50μl×1管-18℃及以下Plasmid Primer&Probe MIX300μl×1管-18℃及以下，避光qPCR Reaction Buffer850μl×2管-18℃及以下，避光DNA稀释液 1.5ml×3管-18℃及以下IPC MIX150μl×1管-18℃及以下，避光⏹规格：100Reactions。
⏹有效期:规定储存条件下24个月。
⏹适用机型（包括但不限于）ABI PRISM®7500Real-Time PCR SystemCFX96(Bio-Rad)Linegene9600plus（博日）⏹实验所需但试剂盒中未含材料1.5ml无菌离心管96孔qPCR板1000μl，100μl，10μl无菌有滤芯枪头⏹相关设备荧光定量PCR仪1000μl，100μl，10μl移液枪⏹操作过程Plasmid DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备Plasmid DNA定量参考品浓度为1.2ng/μl，通过如下公式换算成拷贝数：2.98×108copies/μl。
微生物检测菌落总数测定方法
微生物学检验菌落总数的测定1 原理微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。
它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL ）样品中的活菌数量。
2 材料和仪器2.1 平皿：φ90mm 。
2.2 无菌锥形瓶：容量250mL ，500 mL 。
2.3 无菌吸管：1mL （具0.01mL 个度）,10mL （具0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2.4 灭菌锅。
2.5 恒温培养箱2.6 涂棒。
2.7 酒精灯。
2.8 超净工作台。
2.9 磁力搅拌器。
2.10 漩涡振荡器3 检验程序菌落总数的检验程序见下图。
方法①↙ ↘方法②↘ ↙4 操作步骤4.1 培养基和试剂的配制4.1.1 平板计数琼脂培养基：LB培养基（最常用）牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20g蒸馏水1LpH 7.0～7.2将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。
4.1.2 无菌生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。
4.2 样品的稀释：4.2.1 固体样品：称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。
4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。
4.2.3按照4.2.2操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管或吸头。
4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。
标准操作规程(SOP)——流感禽流感微量中和抗体检测
标准操作规程（SOP）——一、目的微量中和试验是一种敏感性高、特异性强的血清学方法，用于测定血清中的病毒特异性中和抗体水平。
中国国家流感中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程，进行流感/禽流感微量中和抗体检测实验，以确保实验的准确性。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感/禽流感微量中和抗体检测。
三、责任进行流感/禽流感微量中和抗体检测的技术人员需严格按照规定进行操作。
四、程序（一）生物安全要求H5，H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的操作需要在生物安全3级（BSL-3）实验室中进行。
其余流感病毒的操作需要在生物安全2级（BSL-2级）实验室中进行。
操作人员必须严格按照相应实验室的要求做好个人防护。
（二）材料1．中和反应实验材料（1）病毒：一般采用接种鸡胚尿囊腔后收获的流感/禽流感病毒液，在-70℃中保存，并且注意避免反复冻融。
进行中和试验之前，需先进行病毒滴度（TCID50）的滴定。
具体步骤如下，1）病毒的稀释：可采取对数或者半对数稀释的方法。
以下介绍半对数稀释法。
取1管冻存病毒尿囊液，用病毒培养液进行1:100稀释。
第一列4个孔每孔加入146μL 1:100稀释过的病毒液，其它各列每孔加入100 μL 病毒培养液。
然后用多道加样器从第一孔吸46μL 至第二孔，做系列半对数稀释，使之成为10－2、10－2.5、10－3、10－3.5……10－7。
每孔含有100μL 病毒液。
2）每孔加入100μL MDCK 细胞悬液（1.5×104细胞/孔），37℃，5%CO 2培养箱孵育18～22h 。
每一滴度作平行4孔。
3）细胞固定、ELISA 操作如下述。
4）OD 值 〉2倍MDCK 细胞对照OD 值判定为阳性5）病毒滴度计算见组织细胞半数感染量滴定SOP 。
（2）血清样品：包括待检血清、阳性及阴性血清对照。
如果待检血清有可能需要多次检测，则需将待检血清进行小量分装，-20℃至-70℃保存均可，避免多次反复冻融。
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96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤(protocol) 摘要：96孔微量板定量检测法（polystyrene microtiter plate assay）检测细菌生物膜有着许多优势。
一方面，在对大批样品快速操作时能保持试验的一致性。
另一方面，微量板定量检测法不仅能对细菌形成生物膜定性，而且还能定量计算细菌形成生物被的能力，因此96孔微量板法被广泛应用于定量检测细菌生物被膜的方法。
关键词：生物膜 , 菌膜
尤其是在对大批样品快速操作时还能保持试验的一致性，使得96孔板，乃至384
microtiter plate assay）不仅能定性细菌能否形成生物膜，而且和不同染色方法结合，还能定量计算细菌形成生物被的能力，这对实验室生物被膜研究工作是非常有利的，因此96孔微量板定量检测法是目前实验室广泛应用的定量检测细菌生物被膜的方法。
主要试剂和仪器：
聚苯乙烯96孔板、PBS缓冲液、甲醇、1%结晶紫溶液、33%冰乙酸溶液、酶标仪或分光光度计。
实验步骤：
(1) 在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μl培养液，接种10μl过夜培养菌液，37°C静置孵育36h；
(2)将培养液吸出，每孔加入200μl无菌PBS缓冲液清洗板孔3次；
(3) 每孔加入100μl甲醇固定15min，然后吸出培养孔中的甲醇，自然风干；
(4) 每孔加入100μl 1%结晶紫溶液，室温下染色5min；
(5) 吸出培养孔中的结晶紫染色液后，用流水把多余的染料冲洗干净；
(6) 把培养板倒置在滤纸上除去残余的水，并在37°C烘箱中烘干或室温凉干；
(7) 完全干燥后，每孔加入100μl 33%冰乙酸溶液，在37°C培养箱中作用30min以溶解结晶紫；
(8) 590nm条件下，用酶标仪测定培养孔中溶液的OD值；
(9) 每次试验每种菌株做3个孔的重复，试验数值取3次平均值（D值）；
(10) 以未接种菌的培养液作为阴性对照，阴性值的2倍作为界限值(Dc)。
结果判定：
基于D值，菌株可分为3类：
（1）强生物被膜形成株（D＞2×Dc）；
（2）弱生物被膜形成株（Dc＜D≤2×Dc）；
（3）无生物被膜形成株（D≤Dc）。
2004年，Fox等采用微量板定量检测法对分离自45个奶牛场的牛奶、奶牛乳头皮肤和挤奶器的221株金黄色葡萄球菌的生物被膜形成情况进行了研究，鉴定出牛奶中分离的葡萄球菌41.4%有生物膜形成，皮肤和机器中分离的葡萄球菌分别为24.7%、14.7%有生物膜形成，表明与牛奶密切相关的金黄色葡萄球菌比乳腺外源葡萄球菌更容易形成生物被膜，并证明生物被膜形成是奶牛乳内感染的一个危险因素。