双歧杆菌的分离与培养_秦玲玲
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固定维生素、矿物质、L-半胱氨酸、吐温-80的用量，采用正交实验设计(L16(43))优化氮源（A）、碳源 （B）和酵母浸出粉（C）的用量，因素水平见表1。
表1 基础培养基优化正交实验因素水平表(L16(43))
水平
1 2 3 4
A 4种氮源质量比
1︰1︰1︰2 1︰1︰2︰1 1︰2︰1︰1 2︰1︰1︰1
pH
B
C
4.18
4.11
4.24
4.14
4.14
4.15
4.06
4.21
0.18
0.10
从表3可以看出：3个因素对2个指标值的影响均是 B > A > C ，即碳源比例对指标的影响最显著，氮
源次之，酵母粉的添加量对指标值的影响最小；对OD值和pH的影响，碳源与氮源差别不显著，说明碳源
与氮源是影响双歧杆菌增菌效果的2个重要因素。由于酵母粉主要是 提供维生素，又因为在基础培养基中添加了维生素溶液，所以可能 造成酵母粉对指标值的影响偏小。综合2个指标值可以看出：A因素 的4水平、B因素的4水平、C因素的3水平组合在一起，增菌菌液吸 光值最高，pH较低，说明此种组合增菌效果最显著。以此组合做验
双歧杆菌（Bifidobacterium）是 Henry Tissier 于 1899 年首次在法国巴斯德实验室从母乳营养儿的粪便 中分离出来的一种厌氧菌，是肠道微生态的重要组成部分，也是人类最早发现的益生菌之一。因其在轻度 弯曲的末端常见分叉，因而命名为双歧杆菌[1]。现已发现的双歧杆菌有 30 多个种，来自人体的有 12 种。 研究表明，双歧杆菌具有维护肠道生态平衡、抗菌、增强免疫功能、抗肿瘤作用等多种生物学功能，在预 防和治疗疾病及促进人体健康方面起着重要作用。目前双歧杆菌类产品主要有食品、保健品、药品等。而 在此类产品的开发中大多数产品活菌量很低，保存不到一个月就全部死亡。因此，如何缩短培养时间并提 高活菌数目，就成为了技术关键[2]。本研究就是基于此目的，优化分离到的双歧杆菌培养基，缩短培养时 间并提高活菌数，为今后产品的开发奠定基础。
端尖锐[6]。
2.3 生理生化反应测定结果
2.3.1 革兰氏染色
·80·
齐齐哈尔大学学报
2008 年
染色后，细胞保留初染剂的颜色蓝紫色，则判断双歧杆菌为革兰氏阳性菌。
2.3.2 KOH 试验
抬起接种环后无拉丝现象，则双歧杆菌为 KOH 阴性菌。
2.3.3 过氧化氢酶测定
无气泡产生，则判断为过氧化氢酶阴性反应。
-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）作为显色底物，产生颜色反应，进而从市售酸奶中分离出 3 株双歧杆菌，并对其中的
1 株进行生长曲线的绘制及培养基成分的优化，为今后双歧杆菌产品的开发及生物学功能的探索奠定基础。
关键词：双歧杆菌；分离与鉴定；生长曲线；培养基
中图分类号：TS252.1
文献标识码：A
文章编号：1007-984X(2008)03-0078-05
含有双歧杆菌的酸奶制品，以 10 倍稀释法从 10-1 稀释到 10-10，取 5 个稀释梯度 10-4，10-5，10-6，10-7， 10-8，分别吸取稀释液各 0.1 ml，用涂棒涂布于改良的 MRS 培养基平板上，每个梯度做 2 个平行样[3]。然后 放于自制的厌氧罐里，37℃培养 48 h。取出观察菌落形态，挑取培养基中呈深蓝色的特征菌落进行革兰氏 染色，观察菌体形态。然后采取四区划线分离法纯化 3 次，最后选择单菌落，经镜检确认为纯种，转入斜 面培养基，4℃保存。 1.3.2 菌种的初步鉴定及生理生化反应
菌种活化扩培后，以 2.5%的接种量接种于改良的 MRS 液体培养基中，37℃厌氧培养，分别于 0，4， 8，12，16，20，24，28，32 h 取样，用 UV7500 紫外分光光度计在 600 nm 条件下比色，测定菌液的吸光 值，以培养时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制生长曲线，同时测定培养基的 pH[5]。 1.3.4 培养基的优化
1︰1︰1
0.5
1.892
4.21
6
1︰1︰2︰1
1︰1︰2
0.3
1.582
4.22
7
1︰1︰2︰1
1︰2︰1
0.9
1.660
4.23
8
1︰1︰2︰1
2︰1︰1
0.7
1.786
4.09
9
1︰2︰1︰1
1︰1︰1
0.7
1.842
4.29
10
1︰2︰1︰1
1︰1︰2
0.9
1.753
4.39
11
1︰2︰1︰1
双歧杆菌只生长在接种的穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性。
2.4 生长曲线的绘制
单一菌株的生长曲线如图 5 所示。
由图 5 可知，12 h 之前菌体数量大量增长，12 h 时达到对数生长期，随后菌体数量基本保持不变。 OD 值虽然不能直接准确地反映活菌数，但是可以大 致反映菌液中菌体的多少、菌液的浓度。OD 值越大 表明菌液中菌体含量越多。 2.5 培养基的优化
各营养的功能、组成、对菌株生长产生影响的原理，这些都需要讨论。下一步工作的设想是将乳清直 接作为双歧杆菌的培养基，使得乳清中的乳清蛋白和乳糖共同对其生长起促进作用。将乳清培养基与双歧 杆菌基础培养基对其培养的效果进行对比；调整乳清培养基成分以得到更高的双歧杆菌活菌数，降低双歧 杆菌的生产成本，为进一步研究双歧杆菌的高浓度培养奠定基础；对分离的双歧杆菌菌株进行耐药性因子 检测以及耐酸和耐氧驯化，使其成为能够安全食用并应用于生产优良菌株。
实验号 1
A 4种氮源质量比
1︰1︰1︰2
B 3种碳源质量比
1︰1︰1
C 酵母粉质量分数/%
0.3
指标
OD 600nm
pH
1.761
4.02
2
1︰1︰1︰2
1︰1︰2
0.5
1.641
4.18
3
1︰1︰1︰2
1︰2︰1
0.7
1.769
4.09
4
1︰1︰1︰2
2︰1︰1
0.9
1.831
4.03
5
1︰1︰2︰1
1 材料与方法
1.1 材料与培养基 含有双歧杆菌的酸奶制品，购自齐齐哈尔医学院研究所。 改良的 MRS 固体培养基：胰蛋白胨 5 g、酵母浸出粉 5 g、柠檬酸铁铵 2 g、乙酸钠 5 g、Na2HPO4 2 g、
MnSO4 0.05 g、MgCl2 0.5 g、葡萄糖 15 g、乳糖 5 g、L-半胱氨酸 0.5 g、X-Gal 0.06 g、吐温-80 1ml、琼脂 25 g、水 1 000 ml。调 pH7.0，121℃灭菌 15 min。
图 1 双歧杆菌的形态（100×）
图 2 婴儿双歧杆菌
图 3 两歧双歧杆菌
图 4 长双歧杆菌（100×）
由图 2～图 4 可见，婴儿双歧杆菌，革兰氏阳性、染色不均匀、菌体呈两头尖中间粗或是呈 V 字形；
两歧双歧杆菌，菌体呈 Y 字形，并且分支末端圆形；长双歧杆菌，大多为短杆状，个别呈 Y 字形，分支末
1︰2︰1
0.3
1.836
4.19
12
1︰2︰1︰1
2︰1︰1
百度文库
0.5
1.797
4.13
13
2︰1︰1︰1
1︰1︰1
0.9
1.849
4.20
14
2︰1︰1︰1
1︰1︰2
0.7
1.867
4.14
15
2︰1︰1︰1
1︰2︰1
0.5
1.782
4.03
16
2︰1︰1︰1
2︰1︰1
0.3
1.921
3.99
第3期
21 世纪是生命科学的世纪，社会的进步促使人们的精神压力和工作压力增大，寻求健康长寿提高生活 质量是生命科学研究的主题，双歧杆菌的开发与利用有其巨大的潜力和广阔的市场，也必将促进微生态学、 生理学、营养学、病理学、食品开发学、保健科学出现新的显著性突破[8-10]。
参考文献
[1] 吕志勇，吕志刚. 双歧杆菌的保健功能及其产品研发[J]. 安徽农业科学，2006，34（19）：5031-5032. [2] 吴拥军，王嘉福，蔡金腾，等. 耐氧双歧杆菌生长代谢过程的研究[J]. 食品科学，2001，（10）：40-43. [3] 赵红梅，朱恩波. 荆州地区牛乳中双歧杆菌的选择性培养[J]. 乳品加工，2000，（10）： 48-49. [4] 刘兰，曹郁生，黄筱萍. 双歧杆菌选择计数方法的研究进展[J]. 食品与发酵工业，1999，25（4）：61-63. [5] 沈萍，范秀容，李广武. 微生物学实验[M]. 3 版. 北京：高等教育出版社，2002：119-123. [6] 凌代文. 乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M]. 北京：中国轻工业出版社，1999：1-129. [7] 汤丹剑，卫莉，张文. 培养方式对双歧杆菌检测结果的影响[J]. 中国乳品工业，2000，28（1）：20-22. [8] 陈雪梅，邱翔. 双歧杆菌的研究进展[J]. 营养与日粮，2007，（214）：15-17. [9] Ishibashi N and Shimamura S. Immunpotenttiacting Propeties of Bifodobacterium Longum[J]. Food Technol，1993，（6）：126-135. [10] Hughes D B and Hoover D G. Growth promotion of Bifidobacterum species by whey and casein fraction from human and bovine
B 3种碳源质量比
1︰1︰1 1︰1︰2 1︰2︰1 2︰1︰1
C 酵母粉质量分数/%
0.3 0.5 0.7 0.9
注：4种氮源比例为：m（大豆蛋白胨）︰m（胰蛋白胨）︰m（酪蛋白水解物）︰m（牛肉浸膏）； 3种碳源比例为：m（葡萄糖）︰m（异麦芽糖）︰m（乳糖）。
2 结果
2.1 菌落与菌体形态特征 含有双歧杆菌的酸奶制品，经过系列稀释、涂布、分离纯
2.3.4 吲哚试验
在乙醚和培养物之间没有产生红色环状物，则为阴性反应。
2.3.5 需氧试验
接种管经培养后，培养液清澈，管底大量菌体沉淀，可判断双歧杆菌为厌氧菌。
2.3.6 明胶液化
将已接种培养的接种管和未接种的对照试管置于冰箱中，对照管凝固时，接种管也凝固，可判断为阴
性反应。
2.3.7 运动性检测
表 4 验证实验结果( A4B4C3)
理论值
实验值
误差/%
OD 600nm
1.933
1.852
4.19
pH
4
3.980
0.50
证实验，实验结果见表4。
由表4可以看出，理论值与实际值差别不显著，说明用正交实验优选出的最佳组合符合实际情况[7]。因
此确定最优组合为：A4B4C3。
3 讨论
在双歧杆菌的培养基中，添加 X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）作为底物，双歧杆菌水解 底物释放出吲哚，产生颜色反应。双歧杆菌菌落呈深蓝色，乳酸菌和其它细菌一般为白色或淡蓝色，因此 可对酸奶中的双歧杆菌进行筛选。
正交试验所需的碳氮源：大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白水解物、牛肉浸膏、葡萄糖、异麦芽糖、乳 糖。 1.2 仪器与设备
普通培养箱（上海跃进医疗器械厂）、 超净工作台（上海跃进医疗器械厂）、 压力蒸汽灭菌锅（上海 深安医疗器械厂）、显微镜、 UV7500 紫外分光光度计等。 1.3 方法 1.3.1 样品稀释、涂布及分离纯化
按表1的因素水平表，采用L16(43) 正交实验设计 表实施实验，以培养液pH和吸光值为指标，测定结
OD600nm
1.8 1.6 1.4 1.2
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
4
8
12
16
20
24
28
32
培养时间/ h
图 5 双歧杆菌的生长曲线
果见表2，相应的极差分析见表3。
表2 基础培养基优化的正交实验结果(L16(43))
第 24 卷第 3 期 2008 年 5 月
齐齐哈尔大学学报 Journal of Qiqihar University
Vol.24,No.3 May,2008
双歧杆菌的分离与培养
秦玲玲，廖海印，金雨华，张宁，张鹭
（齐齐哈尔大学 生命科学与工程学院，黑龙江 齐齐哈尔，161006）
摘要：利用大多数双歧杆菌具有半乳糖苷酶且活性较高的特性，在改良的 MRS 培养基中加入 X-Gal（5-溴-4-氯
化后，在改良的 MRS 固体培养基上，菌落直径为 1.0～ 2.0 mm，呈深蓝色，圆形凸起，光滑，湿润，边缘整齐，不形 成菌丝体。菌体形状呈 Y 形、V 形、L 形、短杆形、弯曲状、 棒状，有分叉，如图 1。 2.2 菌种初步鉴定结果
经初步鉴定，已获得的双歧杆菌是多种双歧杆菌的杂体， 有婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）、两歧双歧杆菌 （ Bifidobacterium bifidum ） 和 长 双 歧 杆 菌 （ Bifidobacterium longum），3 种双歧杆菌的形态分别见图 2～图 4。
双歧杆菌的分离与培养
·81·
表3 基础培养基优化中各指标的极差分析结果
指标
OD600nm
A
B
C
A
k1
1.751
1.836
1.175
4.08
k2
1.730
1.711
1.778
4.19
k3
1.807
1.762
1.816
4.25
k4
1.855
1.834
1.773
4.09
R
0.125
0.126
0.041
0.17
收稿日期：2008-03-03 作者简介：秦玲玲(1983-)，女，黑龙江呼兰县人，在读硕士研究生，主要从事微生物遗传学研究，E-mail：qllhzl@163.com。
第3期
双歧杆菌的分离与培养
·79·
根据菌落形态、X-Gal 颜色反应及染色镜检等进行初步菌种鉴定[4]。挑取具有双歧杆菌形态特征的菌株 进行生理生化反应，包括革兰氏染色、KOH 实验、过氧化氢酶实验、明胶液化、吲哚实验、好氧实验、运 动性检测等。 1.3.3 生长曲线的测定
表1 基础培养基优化正交实验因素水平表(L16(43))
水平
1 2 3 4
A 4种氮源质量比
1︰1︰1︰2 1︰1︰2︰1 1︰2︰1︰1 2︰1︰1︰1
pH
B
C
4.18
4.11
4.24
4.14
4.14
4.15
4.06
4.21
0.18
0.10
从表3可以看出：3个因素对2个指标值的影响均是 B > A > C ，即碳源比例对指标的影响最显著，氮
源次之，酵母粉的添加量对指标值的影响最小；对OD值和pH的影响，碳源与氮源差别不显著，说明碳源
与氮源是影响双歧杆菌增菌效果的2个重要因素。由于酵母粉主要是 提供维生素，又因为在基础培养基中添加了维生素溶液，所以可能 造成酵母粉对指标值的影响偏小。综合2个指标值可以看出：A因素 的4水平、B因素的4水平、C因素的3水平组合在一起，增菌菌液吸 光值最高，pH较低，说明此种组合增菌效果最显著。以此组合做验
双歧杆菌（Bifidobacterium）是 Henry Tissier 于 1899 年首次在法国巴斯德实验室从母乳营养儿的粪便 中分离出来的一种厌氧菌，是肠道微生态的重要组成部分，也是人类最早发现的益生菌之一。因其在轻度 弯曲的末端常见分叉，因而命名为双歧杆菌[1]。现已发现的双歧杆菌有 30 多个种，来自人体的有 12 种。 研究表明，双歧杆菌具有维护肠道生态平衡、抗菌、增强免疫功能、抗肿瘤作用等多种生物学功能，在预 防和治疗疾病及促进人体健康方面起着重要作用。目前双歧杆菌类产品主要有食品、保健品、药品等。而 在此类产品的开发中大多数产品活菌量很低，保存不到一个月就全部死亡。因此，如何缩短培养时间并提 高活菌数目，就成为了技术关键[2]。本研究就是基于此目的，优化分离到的双歧杆菌培养基，缩短培养时 间并提高活菌数，为今后产品的开发奠定基础。
端尖锐[6]。
2.3 生理生化反应测定结果
2.3.1 革兰氏染色
·80·
齐齐哈尔大学学报
2008 年
染色后，细胞保留初染剂的颜色蓝紫色，则判断双歧杆菌为革兰氏阳性菌。
2.3.2 KOH 试验
抬起接种环后无拉丝现象，则双歧杆菌为 KOH 阴性菌。
2.3.3 过氧化氢酶测定
无气泡产生，则判断为过氧化氢酶阴性反应。
-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）作为显色底物，产生颜色反应，进而从市售酸奶中分离出 3 株双歧杆菌，并对其中的
1 株进行生长曲线的绘制及培养基成分的优化，为今后双歧杆菌产品的开发及生物学功能的探索奠定基础。
关键词：双歧杆菌；分离与鉴定；生长曲线；培养基
中图分类号：TS252.1
文献标识码：A
文章编号：1007-984X(2008)03-0078-05
含有双歧杆菌的酸奶制品，以 10 倍稀释法从 10-1 稀释到 10-10，取 5 个稀释梯度 10-4，10-5，10-6，10-7， 10-8，分别吸取稀释液各 0.1 ml，用涂棒涂布于改良的 MRS 培养基平板上，每个梯度做 2 个平行样[3]。然后 放于自制的厌氧罐里，37℃培养 48 h。取出观察菌落形态，挑取培养基中呈深蓝色的特征菌落进行革兰氏 染色，观察菌体形态。然后采取四区划线分离法纯化 3 次，最后选择单菌落，经镜检确认为纯种，转入斜 面培养基，4℃保存。 1.3.2 菌种的初步鉴定及生理生化反应
菌种活化扩培后，以 2.5%的接种量接种于改良的 MRS 液体培养基中，37℃厌氧培养，分别于 0，4， 8，12，16，20，24，28，32 h 取样，用 UV7500 紫外分光光度计在 600 nm 条件下比色，测定菌液的吸光 值，以培养时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制生长曲线，同时测定培养基的 pH[5]。 1.3.4 培养基的优化
1︰1︰1
0.5
1.892
4.21
6
1︰1︰2︰1
1︰1︰2
0.3
1.582
4.22
7
1︰1︰2︰1
1︰2︰1
0.9
1.660
4.23
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1︰1︰2︰1
2︰1︰1
0.7
1.786
4.09
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1︰2︰1︰1
1︰1︰1
0.7
1.842
4.29
10
1︰2︰1︰1
1︰1︰2
0.9
1.753
4.39
11
1︰2︰1︰1
双歧杆菌只生长在接种的穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性。
2.4 生长曲线的绘制
单一菌株的生长曲线如图 5 所示。
由图 5 可知，12 h 之前菌体数量大量增长，12 h 时达到对数生长期，随后菌体数量基本保持不变。 OD 值虽然不能直接准确地反映活菌数，但是可以大 致反映菌液中菌体的多少、菌液的浓度。OD 值越大 表明菌液中菌体含量越多。 2.5 培养基的优化
各营养的功能、组成、对菌株生长产生影响的原理，这些都需要讨论。下一步工作的设想是将乳清直 接作为双歧杆菌的培养基，使得乳清中的乳清蛋白和乳糖共同对其生长起促进作用。将乳清培养基与双歧 杆菌基础培养基对其培养的效果进行对比；调整乳清培养基成分以得到更高的双歧杆菌活菌数，降低双歧 杆菌的生产成本，为进一步研究双歧杆菌的高浓度培养奠定基础；对分离的双歧杆菌菌株进行耐药性因子 检测以及耐酸和耐氧驯化，使其成为能够安全食用并应用于生产优良菌株。
实验号 1
A 4种氮源质量比
1︰1︰1︰2
B 3种碳源质量比
1︰1︰1
C 酵母粉质量分数/%
0.3
指标
OD 600nm
pH
1.761
4.02
2
1︰1︰1︰2
1︰1︰2
0.5
1.641
4.18
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1︰1︰1︰2
1︰2︰1
0.7
1.769
4.09
4
1︰1︰1︰2
2︰1︰1
0.9
1.831
4.03
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1︰1︰2︰1
1 材料与方法
1.1 材料与培养基 含有双歧杆菌的酸奶制品，购自齐齐哈尔医学院研究所。 改良的 MRS 固体培养基：胰蛋白胨 5 g、酵母浸出粉 5 g、柠檬酸铁铵 2 g、乙酸钠 5 g、Na2HPO4 2 g、
MnSO4 0.05 g、MgCl2 0.5 g、葡萄糖 15 g、乳糖 5 g、L-半胱氨酸 0.5 g、X-Gal 0.06 g、吐温-80 1ml、琼脂 25 g、水 1 000 ml。调 pH7.0，121℃灭菌 15 min。
图 1 双歧杆菌的形态（100×）
图 2 婴儿双歧杆菌
图 3 两歧双歧杆菌
图 4 长双歧杆菌（100×）
由图 2～图 4 可见，婴儿双歧杆菌，革兰氏阳性、染色不均匀、菌体呈两头尖中间粗或是呈 V 字形；
两歧双歧杆菌，菌体呈 Y 字形，并且分支末端圆形；长双歧杆菌，大多为短杆状，个别呈 Y 字形，分支末
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1︰1︰1
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1︰1︰2
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1︰2︰1
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1.782
4.03
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2︰1︰1
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3.99
第3期
21 世纪是生命科学的世纪，社会的进步促使人们的精神压力和工作压力增大，寻求健康长寿提高生活 质量是生命科学研究的主题，双歧杆菌的开发与利用有其巨大的潜力和广阔的市场，也必将促进微生态学、 生理学、营养学、病理学、食品开发学、保健科学出现新的显著性突破[8-10]。
参考文献
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B 3种碳源质量比
1︰1︰1 1︰1︰2 1︰2︰1 2︰1︰1
C 酵母粉质量分数/%
0.3 0.5 0.7 0.9
注：4种氮源比例为：m（大豆蛋白胨）︰m（胰蛋白胨）︰m（酪蛋白水解物）︰m（牛肉浸膏）； 3种碳源比例为：m（葡萄糖）︰m（异麦芽糖）︰m（乳糖）。
2 结果
2.1 菌落与菌体形态特征 含有双歧杆菌的酸奶制品，经过系列稀释、涂布、分离纯
2.3.4 吲哚试验
在乙醚和培养物之间没有产生红色环状物，则为阴性反应。
2.3.5 需氧试验
接种管经培养后，培养液清澈，管底大量菌体沉淀，可判断双歧杆菌为厌氧菌。
2.3.6 明胶液化
将已接种培养的接种管和未接种的对照试管置于冰箱中，对照管凝固时，接种管也凝固，可判断为阴
性反应。
2.3.7 运动性检测
表 4 验证实验结果( A4B4C3)
理论值
实验值
误差/%
OD 600nm
1.933
1.852
4.19
pH
4
3.980
0.50
证实验，实验结果见表4。
由表4可以看出，理论值与实际值差别不显著，说明用正交实验优选出的最佳组合符合实际情况[7]。因
此确定最优组合为：A4B4C3。
3 讨论
在双歧杆菌的培养基中，添加 X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）作为底物，双歧杆菌水解 底物释放出吲哚，产生颜色反应。双歧杆菌菌落呈深蓝色，乳酸菌和其它细菌一般为白色或淡蓝色，因此 可对酸奶中的双歧杆菌进行筛选。
正交试验所需的碳氮源：大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白水解物、牛肉浸膏、葡萄糖、异麦芽糖、乳 糖。 1.2 仪器与设备
普通培养箱（上海跃进医疗器械厂）、 超净工作台（上海跃进医疗器械厂）、 压力蒸汽灭菌锅（上海 深安医疗器械厂）、显微镜、 UV7500 紫外分光光度计等。 1.3 方法 1.3.1 样品稀释、涂布及分离纯化
按表1的因素水平表，采用L16(43) 正交实验设计 表实施实验，以培养液pH和吸光值为指标，测定结
OD600nm
1.8 1.6 1.4 1.2
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
4
8
12
16
20
24
28
32
培养时间/ h
图 5 双歧杆菌的生长曲线
果见表2，相应的极差分析见表3。
表2 基础培养基优化的正交实验结果(L16(43))
第 24 卷第 3 期 2008 年 5 月
齐齐哈尔大学学报 Journal of Qiqihar University
Vol.24,No.3 May,2008
双歧杆菌的分离与培养
秦玲玲，廖海印，金雨华，张宁，张鹭
（齐齐哈尔大学 生命科学与工程学院，黑龙江 齐齐哈尔，161006）
摘要：利用大多数双歧杆菌具有半乳糖苷酶且活性较高的特性，在改良的 MRS 培养基中加入 X-Gal（5-溴-4-氯
化后，在改良的 MRS 固体培养基上，菌落直径为 1.0～ 2.0 mm，呈深蓝色，圆形凸起，光滑，湿润，边缘整齐，不形 成菌丝体。菌体形状呈 Y 形、V 形、L 形、短杆形、弯曲状、 棒状，有分叉，如图 1。 2.2 菌种初步鉴定结果
经初步鉴定，已获得的双歧杆菌是多种双歧杆菌的杂体， 有婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）、两歧双歧杆菌 （ Bifidobacterium bifidum ） 和 长 双 歧 杆 菌 （ Bifidobacterium longum），3 种双歧杆菌的形态分别见图 2～图 4。
双歧杆菌的分离与培养
·81·
表3 基础培养基优化中各指标的极差分析结果
指标
OD600nm
A
B
C
A
k1
1.751
1.836
1.175
4.08
k2
1.730
1.711
1.778
4.19
k3
1.807
1.762
1.816
4.25
k4
1.855
1.834
1.773
4.09
R
0.125
0.126
0.041
0.17
收稿日期：2008-03-03 作者简介：秦玲玲(1983-)，女，黑龙江呼兰县人，在读硕士研究生，主要从事微生物遗传学研究，E-mail：qllhzl@163.com。
第3期
双歧杆菌的分离与培养
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根据菌落形态、X-Gal 颜色反应及染色镜检等进行初步菌种鉴定[4]。挑取具有双歧杆菌形态特征的菌株 进行生理生化反应，包括革兰氏染色、KOH 实验、过氧化氢酶实验、明胶液化、吲哚实验、好氧实验、运 动性检测等。 1.3.3 生长曲线的测定