甲基化原理及步骤
甲基化实验报告
甲基化实验报告甲基化是一种常用的化学修饰方法，通过甲基基团的引入，可以改变物质的性质和功能。
本实验旨在通过对苯甲酸的甲基化反应，探讨甲基化反应的原理、特点以及操作方法。
实验原理：甲基化是一种亲电取代反应，即在亲电取代剂（如溴甲烷）的作用下，亲电试剂（如苯甲酸）发生取代反应，形成新的化合物。
在甲基化反应中，亲电试剂作为电子受体，亲电取代剂作为电子供体，通过相互作用进行反应。
反应机理中，亲电试剂的芳香环中的π电子与亲电取代剂中的亲电中心（甲基）发生亲靠，同时放出对位的氯负离子。
实验步骤：1.准备化学试剂和玻璃仪器，包括苯甲酸、溴甲烷、三氯化铝、氯化钠、烧杯、漏斗、试管、洗涤瓶等。
2.称取适量的苯甲酸放入烧杯中。
3.用洗涤瓶将苯甲酸转移到漏斗中。
4.向漏斗中加入适量的溴甲烷，并加入少量的三氯化铝作为催化剂。
5.轻轻摇动漏斗，使溴甲烷与苯甲酸充分混合反应。
6.将反应液倒入试管中。
7.加入适量的氯化钠固化剂，使溴离子与铝离子发生反应。
8.进行离心操作，分离出有机相和水相。
9.将有机相倒入干净的试管中。
10.使用旋转蒸发仪将有机溶剂蒸发，得到产物。
实验结果与分析：通过本实验，得到了苯甲酸的甲基化产物。
根据实验操作和产物的性质，可以看出甲基化反应是一种相对简单、易操作的反应。
溴甲烷作为亲电取代剂，能够有效地与苯甲酸发生反应，形成甲基化产物。
三氯化铝作为催化剂，能够加速反应速率，提高产物的得率。
氯化钠作为固化剂，能够将有机相中的溴离子与铝离子发生反应，使两相分离。
甲基化反应具有以下特点：1.甲基化反应是一种亲电取代反应，反应速率较快。
2.甲基化反应容易发生副反应，如消除反应、分子重排等。
3.甲基化反应多发生在芳香体系上，对于其他化合物不一定适用。
4.甲基化反应需要选择适当的催化剂和条件，以提高产物的得率和选择性。
结论：通过本实验，成功地进行了苯甲酸的甲基化反应，并得到了甲基化产物。
甲基化反应是一种亲电取代反应，具有操作简单、反应速率快的特点。
dna甲基化的原理
dna甲基化的原理DNA甲基化是指DNA分子上的碱基（特别是腺嘌呤和胞嘧啶）上附加一个甲基（CH3）基团的化学修饰过程。
这种修饰作用发生在甲基转移酶酶作用下，将甲基从甲基供体转移到DNA分子上。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，调控着基因组的稳定性，DNA复制和RNA转录等生物过程。
DNA甲基化的原理可以概括为以下几个步骤：1.甲基供体提供：DNA甲基化需要一个供应甲基基团的供体，这个供体通常是S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。
SAM经过甲基转移酶的催化作用，在该过程中，SAM的甲基通过与SAM一些基团的共价键断裂，生成S-腺苷-L-同-蛋氨酸（SAH）。
2. 甲基转移酶催化：甲基转移酶（DNA甲基转移酶）是调控DNA甲基化的重要酶类。
这些酶能够识别特定的DNA序列，如CpG二核苷酸丰富区域，以及保守的dna甲基化特性。
甲基转移酶首先与DNA结合，然后将SAM供体的甲基转移给DNA分子。
这个过程是可逆的，并且在受到一些信号影响时可以被逆转。
3.甲基化的位置和模式：DNA甲基化通常发生在胞嘧啶（C）的C5位或腺嘌呤（A）的N6位。
具体来说，CpG二核苷酸丰富区域（CpG岛）常常是DNA甲基化的热点区域。
这种模式主要表现在线粒体DNA和内源性逆转录病毒的基因组DNA中。
4.甲基化与基因表达：DNA甲基化可以影响基因的表达。
局部甲基化会抑制转录因子的结合，阻碍转录因子和RNA聚合酶的结合，从而抑制转录的发生。
另一方面，全局甲基化可能导致基因组整体的转录沉默。
DNA甲基化调控的机制主要有两种：1.直接调控：DNA甲基化被认为是一种直接抑制基因转录的机制。
当DNA部分被甲基化，这会导致一些核蛋白质（转录因子）不能与甲基化的DNA结合。
因为转录因子无法结合到DNA上，这样会阻碍RNA聚合酶从而抑制基因的转录。
2.间接调控：DNA甲基化还可以通过在染色质水平上装配或阻止一些蛋白质如组蛋白修饰酶，进一步间接地影响基因表达。
甲基化原理及方法
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰测序法）基本原理在于：样本经亚硫氢酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶（C）保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶,因此在利用该处理产物作为模板的PCR产物中,甲基化的胞嘧啶还是胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶变成了脲嘧啶（胸腺嘧啶）,此时检测到的胞嘧啶（C）即是样品中本身的甲基化位点.第一部分基因组DNA的提取。
DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。
DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。
PH一定要准确为5.0。
加520ul至上述水浴后溶液中。
dna甲基化的过程和机制
dna甲基化的过程和机制
DNA甲基化的过程和机制如下：
DNA甲基化是指在DNA分子的特定位置上添加甲基基团，甲基化后的DNA序列可能发生某些改变，比如可以调节基因的表达等。
甲基化的机制主要涉及到DNA甲基转移酶（DNMT）的作用。
DNMTs是一类能够将甲基基团从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移到DNA分子上的酶，是DNA甲基化过程的主要参与者。
在DNA甲基化过程中，DNMT首先将SAM转化为活性中间体，然后将活性中间体的甲基基团转移到DNA分子上。
DNA甲基化的过程可以分为以下几个步骤：
识别和结合：DNMT首先识别DNA分子上的特定序列，通常是富含胞嘧啶的区域。
识别后，DNMT结合到DNA分子上，形成一个复合体。
甲基化反应：在复合体中，SAM的甲基基团被转移到DNA分子上，通常是胞嘧啶残基的5位碳原子上。
这个过程涉及到化学键的转移，需要消耗能量。
释放和去甲基化：完成甲基化反应后，DNMT从DNA分子上释放下来，留下甲基化的DNA序列。
在某些情况下，甲基化的DNA序列可以被去甲基化，即甲基基团被去除，恢复到未甲基化的状态。
去甲基化的过程通常涉及到特定的去甲基化酶的作用。
总之，DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，可以影响基因的表达和功能。
了解DNA甲基化的过程和机制有助于深入理解生物
学和医学中的许多问题，包括发育、疾病和治疗方法等。
septin9基因甲基化检测原理
septin9基因甲基化检测原理引言：近年来，基因检测技术的发展为临床诊断和疾病预防提供了新的可能性。
基于DNA甲基化的检测方法已成为常用的生物标记物检测手段之一。
其中，septin9基因甲基化检测已经被广泛应用于结直肠癌的早期筛查。
本文将介绍septin9基因甲基化检测的原理及其在临床中的应用。
一、DNA甲基化的概述DNA甲基化是一种通过在DNA分子中加入甲基基团来修饰基因表达的机制。
在DNA甲基化过程中，甲基转移酶将甲基基团添加到DNA分子的胞嘧啶（C）碱基上，形成甲基化胞嘧啶（mC）。
DNA 甲基化通常发生在CpG位点上，即胞嘧啶和鸟嘌呤（G）相邻的碱基。
二、septin9基因甲基化检测原理septin9基因位于人类染色体17上，是一个与肿瘤发生和发展相关的重要基因。
在癌症发生过程中，septin9基因的甲基化水平通常会发生改变。
septin9基因甲基化检测是通过检测septin9基因的甲基化状态来判断患者是否存在结直肠癌的一种方法。
septin9基因甲基化检测通常采用基于聚合酶链式反应（PCR）的技术。
具体步骤如下：1. 样本采集：从患者的血液中提取出DNA样本，这一步骤通常采用抽血的方式进行。
2. DNA甲基化处理：将DNA样本进行甲基化处理，使未甲基化的胞嘧啶（umC）转化为甲基化胞嘧啶（mC），以便后续的PCR反应。
3. PCR反应：使用特定的引物和酶，对septin9基因的DNA进行扩增。
PCR反应的结果将根据septin9基因在结直肠癌患者和健康人群中的甲基化差异而有所不同。
4. 产物检测：通过电泳等方法，对PCR反应的产物进行检测。
根据septin9基因的甲基化差异，可以判断样本是否存在结直肠癌。
三、septin9基因甲基化检测的临床应用septin9基因甲基化检测作为一种非侵入性的检测方法，已经在结直肠癌的早期筛查中得到了广泛应用。
相比传统的结直肠镜检查和粪便潜血试验，septin9基因甲基化检测具有以下优势：1. 非侵入性：septin9基因甲基化检测只需要提取血液样本，无需进行疼痛和不适的结肠镜检查。
甲基化转化原理
甲基化转化原理
甲基化转化的原理主要涉及DNA序列中的胞嘧啶（Cytosine）被选择性地添加甲基团，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC），这一过程通常由DNA甲基转移酶（DNMT）催化完成。
详细来说，DNA甲基化是一种表观遗传修饰，其原理包括以下几个关键点：
1. 化学修饰：DNA甲基化过程中，甲基是由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供的，这个甲基会被DNA甲基转移酶添加到DNA分子的胞嘧啶上，主要在CG二核苷酸序列中发生。
2. 基因表达调控：当DNA甲基化发生在基因启动子区域时，它通常会抑制该基因的转录活性。
这是因为甲基化会影响转录因子与DNA结合的能力，进而影响基因的表达。
3. 结构维持与印记：DNA甲基化在调控基因表达、维持染色质结构、基因印记以及胚胎发育等生物学过程中扮演着重要角色。
它有助于保持基因组的稳定性和调控特定基因的活性状态。
4. 甲基化检测：为了研究DNA甲基化模式，科学家们开发了多种技术，其中一种常用的是甲基化特异性PCR（MSP）。
这种方法利用重亚硫酸盐处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变。
随后通过PCR扩增，可以区分甲基化和非甲基化的DNA序列。
综上所述，DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制，它通过在DNA序列中添加甲基团来调节基因的表达，且这种修饰是可逆的。
这一过程对于生物体的发育、基因表达调控以及遗传特征的稳定传递都至关重要。
甲基化原理及步骤
二、DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。
中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。
试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。
然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。
向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。
DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。
第一步：试剂准备（1）3 M NaOH原料（用前现配）把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。
使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。
（2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配）配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。
（3）溶解试剂Ⅰ（用前现配）打开前将试剂瓶加温至室温。
对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。
充分涡旋振荡混合。
使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。
用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。
试剂Ⅰ避光保存以免分解。
为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。
（4）溶解试剂Ⅱ打开前将试剂瓶加温至室温。
将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。
每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。
充分混合确保完全溶解。
过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。
第二步：DNA修饰程序1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。
注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA 修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。
甲基化建库原理和流程
甲基化建库原理和流程
甲基化建库是一种DNA甲基化分析的方法，它可以揭示DNA甲基化在基因组水平上的分布和差异。
甲基化建库的原理是利用化学方法将甲基化的DNA序列与未甲基化的DNA序列进行区别，然后通过高通量测序技术对这些DNA序列进行分析。
甲基化建库的流程可以分为以下步骤：
1. DNA提取：从样品中提取DNA
2. DNA酶切：将DNA酶切成一定大小的片段
3. 甲基化特异性酶切：通过加入甲基化特异性酶对DNA进行酶切，只切割未甲基化的DNA，而不切割甲基化的DNA。
4. DNA片段修复：对DNA片段进行修复，以便于添加Illumina 测序接头
5. 连接Illumina测序接头：将Illumina测序接头连接到DNA 片段的末端
6. PCR扩增：对连接了Illumina测序接头的DNA片段进行PCR 扩增，以便于测序
7. 高通量测序：对PCR扩增产物进行高通量测序，得到甲基化建库的序列数据
8. 数据分析：对测序数据进行质控、比对和甲基化位点的鉴定和注释。
通过甲基化建库可以获得基因组范围内的甲基化信息，对于探究生物学中的某些现象和疾病的发生机制有着重要的意义。
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二、DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤
修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。
中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。
试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。
然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。
向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。
DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。
第一步：试剂准备
（1）3 M NaOH原料（用前现配）
把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。
使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。
（2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配）
配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。
（3）溶解试剂Ⅰ（用前现配）
打开前将试剂瓶加温至室温。
对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。
充分涡旋振荡混合。
使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。
用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。
试剂Ⅰ避光保存以免分解。
为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。
（4）溶解试剂Ⅱ
打开前将试剂瓶加温至室温。
将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。
每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。
充分混合确保完全溶解。
过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。
第二步：DNA修饰程序
1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH
加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。
注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA 修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。
再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。
2、50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴）
3、加入550 μl新鲜配制的DNA修饰试剂Ⅰ并涡旋振荡。
4、加热块或水浴50℃避光孵育4-16小时。
第三步：初步脱盐
1、强力涡旋振荡悬浮DNA修饰Ⅲ。
用10x的1mL塑料移液管枪头来回吸排悬液以分散仍存在的凝块。
2、向含DNA溶液的管中加入5μl充分悬浮的DNA修饰试剂Ⅲ。
3、加入750μl DNA修饰试剂Ⅱ并充分混匀。
4、室温孵育5-10分钟。
5、5000 X g离心10秒使DNA试剂Ⅲ成颗粒状。
（应出现一种白色的小颗粒。
）弃去上清。
6、加入1.0mL 70%的乙醇，涡旋振荡，5000 X g离心10秒，弃去上清。
该步骤重复进行，共3次。
7、将第三次上清弃去后，离心管高速离心2分钟，用塑料移液管枪头移去剩余上清。
第四步：完成DNA修饰（脱磺酸基作用），再次脱盐，并洗脱。
1、适量样本加入50μl 20 mM NaOH/90% EtOH溶液。
2、充分涡旋振荡悬浮颗粒，再室温孵育5分钟。
3、5000 X g离心以移除管顶所有成分。
加入1.0mL 90%的乙醇并涡旋振荡洗脱颗粒。
再旋转，除去上清。
再次重复该步骤。
4、第二次洗脱除去上清后，高速离心样本3分钟。
5、用塑料移液管头除去所有剩余上清。
试管室温晾干10-20分钟（必须除去酒精气味）。
6、加入TE缓冲液。
注意：加入TE的量取决于起始DNA的量和目的用途所需的加入浓度。
例如，如果加入25μl TE，基于完全恢复1μg DNA的最终浓度应为40ng/μl。
快速强力涡旋振荡直到颗粒完全悬浮。
用手轻打或轻敲内容物至管顶（但是不要离心）。
7、50-60℃下样本孵育15分钟以洗脱DNA。
8、高速离心2-3分钟并用塑料移液管头转移样本（上清）到新管。
9、进行MSP或测序，或-15～-25℃可保存达2个月，-80℃可保存6个月。
避免重复融化和解冻；可分量储存。
不要将DNA存储在自动除霜冰箱。
10、当从一管中转移已解冻的DNA以备用时，避免将试剂Ⅲ转移到PCR反应管中。
通常首先将管充分离心，使残留的试剂Ⅲ固体成颗粒状。
三、MSP
（1）引物合成
运用特别设计的针对甲基化和非甲基化序列的引物，引物由上海生物工程有限公
司合成。
见表1
表1 甲基化引物序列及扩增条件
hMLH1引物引物序列(5’～3’)产物长度温度甲基化(M) 正义ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC 115 bp 55℃甲基化(M) 反义CCTCATCGTAACTACCCGCG 115 bp 55℃非甲基化(U) 正义TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT 124 bp 55℃非甲基化(U) 反义ACCACCTCATCATAACTACCCACA 124 bp 55℃（2）PCR反应条件
a 反应体系：10×PCR缓冲液5μl，2.5mmol/LdNTP4μl，甲基化上下游引物
和去甲基化上下游引物分别为1μl，甲基化模板DNA5μl，Taq酶0.25μl，加水至
总体积50μl。
b 循环条件：
共35个循环
（3）PCR产物结果判定：琼脂糖凝胶电泳
a 甲基化阳性：甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断，但非甲基化特
异性引物未扩增出相应长度的片断，则判断基因启动子区5’CpG岛甲基化阳性。
b 甲基化阴性：非甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断，但甲基化特
异性引物未扩增出相应长度的片断。
则判断基因启动子区5’CpG岛甲基化阴性。