人二倍体细胞建株
(完整word版)细胞培养发展历史
1856年，实现红豆杉细胞培养生产紫杉醇的突破。
1885年，Roux温生理盐水培育鸡胚组织；1887年，培养皿（英文：Petri dish）由在德国生物学家罗伯特·科赫手下工作的细菌学家朱利斯·理查德·佩特里（Julius Richard Petri，1852－1921）于1887年设计，故也称为“佩特里皿”。
是一种用于细胞培养的实验室器皿，由一个平面圆盘状的底和一个盖组成，一般用玻璃或塑料制成。
1902年，植物细胞培养是在植物组织培养技术基础上发展起来的。
1902年Haberlandt 确定了植物的单个细胞内存在其生命体的全部能力(全能性)，使成为植物组织培养的开端。
其后，为了实现分裂组织的无限生长，对外植体的选择及培养基等方面进行了探索。
1906年，Beebe和Ewing用盖片悬滴培养法，以动物血清做培养基，培养狗淋巴细胞存活了72 小时。
现代细胞培养是从Harrison(1907)和Carrel(1912)两人开始的。
Harrison参考前人经验，创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法。
1907年，哈里森(Harrison)在无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。
1910-1912年，Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代，完善了悬滴培养法；1912年，Haberlandt的学生Kotte和美国的Robins在根尖培养中获得了组织培养的成功。
Kotte采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。
1915年，昆虫细胞培养的鼻祖是德国人forhardBendict（1878—1958），发表了有关昆虫细胞培养的第一篇文章。
1923年，Carral设计创立了卡氏瓶培养法，用此法可根据需要随时更换培养液，既有利于组织不断生长，又可以运用不同种类的营养液培养不同的细胞，极大地推动了当时组织培养研究。
人二倍体细胞狂犬疫苗与Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性对比分析
人二倍体细胞狂犬疫苗与Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性对比分析人二倍体细胞狂犬疫苗与Vero细胞纯化狂犬疫苗是两种常见的疫苗类型，它们都是用于预防狂犬病的疫苗，但它们的制备过程和安全性可能存在一些差异。
本文将对这两种疫苗的安全性进行对比分析，帮助读者更好地了解这两种疫苗的特点和适用范围。
人二倍体细胞狂犬疫苗是一种由人类细胞培养制备的疫苗，它们来源于人的胚胎组织或细胞株。
这种疫苗制备的过程较为复杂，需要经过多道程序，从细胞培养、病毒复制、收获和纯化等环节，确保最终的疫苗产品符合国家标准和生产安全规定。
而Vero细胞纯化狂犬疫苗则是利用Vero细胞培养，通过细胞培养、病毒复制、收获和纯化等步骤，生产出的疫苗产品。
在安全性方面，这两种疫苗都有着严格的生产工艺和质量控制要求，保证生产过程中的卫生和纯度全面符合相关法规和标准要求。
但是在实际应用中，人二倍体细胞狂犬疫苗和Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性会有所不同。
人二倍体细胞疫苗制备的过程可能会存在与细胞培养相关的潜在风险，如细胞变异、病毒污染等。
而Vero细胞纯化疫苗则通过纯化过程将可能存在的杂质去除，减少了潜在的风险。
从制备过程来看，Vero细胞纯化狂犬疫苗在安全性上可能更有优势。
人二倍体细胞疫苗和Vero细胞纯化疫苗的生产工艺、疫苗成分和疫苗质量也会对其安全性产生影响。
人二倍体细胞疫苗可能含有人类组织或细胞株的成分，存在一定的传染风险；而Vero细胞纯化疫苗则是通过Vero细胞培养制备，不含有人类组织或细胞株成分，安全系数更高。
临床使用中对这两种疫苗的不良反应进行监测和统计分析也是很重要的。
通过对患者接种后的不良反应进行监测和分析，可以更好地评估疫苗的安全性和适用性。
有研究显示，人二倍体细胞疫苗在部分接种者中可能会出现不良反应，如发热、局部反应等；而Vero细胞纯化疫苗在临床使用中的不良反应相对较少。
人二倍体细胞狂犬疫苗和Vero细胞纯化狂犬疫苗在安全性上存在一定的差异。
肠道病毒71型灭活疫苗
灭活疫苗仍然存在问题
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EV71 免疫保护机制复杂，除体液免疫外， 细胞免疫也发挥着重要的作用。然而，灭活疫苗主要诱导的是体液免疫， 细胞免疫不够充分。
灭活疫苗生产和运输成本高昂。疫苗效力较高而疫苗价格较低的常规免疫才符合我国的成本效益 ， 这可能会制约灭活疫苗的应用。
EV71 本身存在抗体依赖性增强感染现象，不恰当的疫苗接种有可能会增加重症病例的风险。
Enterovirustype71inactivatedvaccine
课程：生物技术制药
班级：2013生技一班
肠道病毒71型灭活疫苗
EV71图片
肠道病毒 71 型( enterovirus 71， EV71) 为单股正链 ＲNA病毒，是小 ＲNA 病 毒 科 肠 道 病 毒 属 中 的 重 要 成 员 之 一。EV71 基因组由 7400 多个核苷酸构成， 包含一个开放读码框，编码大约 2200 个氨基酸的多聚蛋白。该多聚蛋白可被进一步水解成 P1、 P2 和 P3 三个前体蛋白，P1 前体蛋白编码VP1、 VP2、 VP3 和 VP4 四种结构蛋白，P2、 P3 前体蛋白编码 7种非结构蛋白( 2A ～ 2C 和 3A ～ 3D) EV71 包括 A、 B 和C 3 种基因型，11 个基因亚型， 每种亚型感染均可引起手足口病( hand， foot and mouth disease， HFMD
EV71 疫苗除能诱导中和抗体外，还能诱导细胞免疫应答，其也具有免疫保护作用。
EV71疫苗可行性
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全病毒灭活疫苗
减毒活疫苗
基因工程疫苗
病毒样颗粒( VLPs)疫苗
肠道病毒 71 型疫苗分类
冻干人用狂犬病疫苗二倍体原理
冻干人用狂犬病疫苗二倍体原理狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的急性传染病，对人类和动物都具有较高的致死率。
为了预防和控制狂犬病的传播，研发了冻干人用狂犬病疫苗。
这种疫苗的制备过程中采用了二倍体原理，下面我们来详细了解一下。
二倍体是指细胞在某一特定时期，其染色体数量是正常状态下的两倍。
在冻干人用狂犬病疫苗的制备过程中，二倍体原理是指使用狂犬病病毒株在细胞培养基中感染细胞，经过一系列操作，使病毒在细胞内复制，最终使细胞内含有较高浓度的病毒。
制备病毒种苗。
病毒种苗是狂犬病病毒的一种弱毒株，它不会引起狂犬病的严重症状，但具有免疫原性。
病毒种苗通过体内或体外传代培养，经过多次传代，使病毒逐渐适应培养环境，增加复制效率和病毒产量。
培养细胞。
在制备冻干人用狂犬病疫苗过程中，常用的细胞包括Vero细胞和鸡胚纤维细胞。
这些细胞具有较好的病毒感染和复制能力，适合用于制备疫苗。
然后，感染细胞。
将培养好的细胞与病毒种苗接种于细胞培养基中，让病毒感染细胞。
感染后，病毒会进入细胞内，利用细胞的生物合成机制复制自身。
接着，复制病毒。
经过一段时间的培养，病毒会在细胞内不断复制，形成大量的病毒颗粒。
这些病毒颗粒会释放到细胞外，继续感染其他细胞。
收集病毒。
当细胞内病毒产量达到一定水平时，可以通过离心等方法将病毒从细胞培养基中分离出来。
收集到的病毒溶液经过一系列的处理，包括杀灭病毒、纯化和浓缩等步骤，最终得到冻干狂犬病疫苗。
冻干狂犬病疫苗的制备过程中，二倍体原理的应用使病毒在细胞内得以复制，并在一定时间内达到高浓度。
这样可以提高疫苗的效力和产量，保证疫苗的质量。
冻干狂犬病疫苗经过冷冻干燥处理后，具有较长的保存期限，方便运输和使用。
冻干人用狂犬病疫苗的制备过程中，二倍体原理的应用不仅提高了疫苗的效力和产量，还保证了疫苗的稳定性和质量。
这对于预防和控制狂犬病的传播具有重要意义。
随着科技的进步，疫苗制备技术也在不断改进，相信未来会有更多的创新和突破，提高疫苗的效果和安全性，为人类健康保驾护航。
冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)DongganRenyong
冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞）Donggan Renyong Kuangquanbing Yimiao (Ren Erbeiti Xibao) Rabies Vaccine (Human diploid cell) for Human Use, Freeze-dried本品系用狂犬病病毒固定毒接种于人二倍体细胞，经培养、收获、浓缩、纯化、灭活病毒后，加入适宜稳定剂冻干制成。
用于预防狂犬病。
1 基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造2.1 生产用细胞生产用细胞为人二倍体细胞（MRC-5株或其他经批准的细胞株）。
2.1.1 细胞管理及检定应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
各级细胞库细胞代次应不超过批准的限定代次。
2.1.2 细胞制备复苏一定数量的工作细胞库细胞，加入适宜的培养液，在适宜温度下培养，扩增至一定数量，用于接种病毒的细胞为一个细胞批。
每批原液的生产细胞应来自复苏扩增后的同一细胞批。
2.2 毒种2.2.1 名称及来源生产用毒种为狂犬病病毒固定毒Pitman-Moore株或经批准的其他人二倍体细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。
2.2.2 种子批的建立应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。
各种子批代次应不超过批准的限定代次。
2.2.3 种子批毒种的检定主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行 2.2.3.1～2.2.3.4项检定。
2.2.3.1 鉴别试验采用小鼠脑内中和试验鉴定毒种的特异性。
将毒种做10倍系列稀释，取适宜稀释度病毒液分别与狂犬病病毒特异性免疫血清（试验组）和阴性血清（对照组）等量混合，试验组与对照组的每个稀释度分别接种11～13g小鼠6只，每只脑内接种0.03ml，逐日观察，3天内死亡者不计（动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20%），观察14天。
中和指数应不低于500。
2.2.3.2 病毒滴定将毒种做10倍系列稀释，每个稀释度脑内接种体重为11～13g小鼠至少6只，每只脑内接种0.03ml，逐日观察，3天内死亡者不计（动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20%），观察14天。
人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准分析-重庆狂犬疫苗抗体检测
人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准分析一、人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准狂犬病病毒RNA编码核蛋白（N）、M1、M2、病毒包膜糖蛋白（G）和L五种蛋白，其中G蛋白是狂犬病病毒最主要的抗原，可有效刺激特异性辅助性T细胞和细胞毒性T细胞（CTL）增生，并诱导机体产生特异性抗体。
G蛋白特异性抗体是狂犬病疫苗最重要的保护性抗体，免疫效果主要依赖其抗原表位、结构、蛋白折叠及糖基化等。
N蛋白也是一种有效的保护性抗原，能够刺激B细胞和Th细胞诱导产生细胞和体液免疫。
磷蛋白（P）可诱导CTL，但保护作用较弱。
机体在接种狂犬病疫苗约7天左右产生IgM抗体，在约14天后产生IgG抗体并迅速升高。
IgM和IgG抗体均具有中和病毒的能力，有些中和抗体能进入感染狂犬病病毒的神经细胞内抑制病毒复制。
CTL的高峰出现在免疫后12天，可清除中枢神经系统内的狂犬病病毒，Th细胞可增强抗核蛋白和糖蛋白抗体，也能增加保护效果。
但Suss的研究认为细胞免疫在狂犬病中的作用不明。
由于狂犬病病毒核蛋白序列高度保守，氨基酸同源性达78%至93%，故病毒之间在核壳体水平上存在着广泛的抗原交叉反应。
狂犬病病毒的主要抗原部位为G蛋白外功能区，当其氨基酸同源性>74%时，病毒之间能够交叉中和，为同一遗传谱系内的病毒；膜外区的氨基酸同源性<62%时，则无交叉中和反应。
目前疫苗株均属于遗传谱系I，对遗传谱系II中的病毒感染不具保护作用。
现已经有十余个种类或基因型的狂犬病病毒属病毒被描述为狂犬病的病原体。
目前为止，遗传谱系I的狂犬病病毒是引起人狂犬病的最常见的病毒型别，也是至今应用于狂犬病疫苗生产的唯一病毒种类。
故现有疫苗可能无法为遗传谱系I外的其他血清型病毒感染提供保护。
因此，用于疫苗的病毒种类必须慎重选择。
生产用毒种应是在实验室细胞培养适应和减毒，并具有稳定生物学特性的固定毒株，其历史和来源应确证清楚，并经过全面的特征性检定，符合国家相关文件的要求。
人二倍体细胞狂犬疫苗与Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性对比分析
人二倍体细胞狂犬疫苗与Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性对比分析1. 引言1.1 研究背景狂犬病是一种由狂犬病毒引起的急性传染病，主要通过动物的唾液传播给人类。
狂犬病具有极高的致死率，一旦发病几乎无法治愈，因此预防接种疫苗成为预防狂犬病的主要手段之一。
人二倍体细胞狂犬疫苗和Vero细胞纯化狂犬疫苗是目前用于预防狂犬病的两种主要疫苗。
人二倍体细胞狂犬疫苗是通过培养在人体成纤维细胞上制备而成，而Vero细胞纯化狂犬疫苗则是利用非致癌的绿猴肾细胞株Vero细胞制备而成。
两种狂犬疫苗在预防狂犬病方面各有优势，但其安全性对比尚未进行深入研究。
本研究旨在对人二倍体细胞狂犬疫苗和Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性进行对比分析，为疫苗选择提供更为客观的数据支持。
通过实验设计和分析，我们希望能够探讨两种疫苗在安全性方面的差异，为狂犬病防控提供更科学的建议。
1.2 研究目的研究目的是比较人二倍体细胞狂犬疫苗和Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性，以了解两种疫苗在接种过程中可能产生的不良反应及其程度。
通过对两种疫苗的安全性进行详细分析和比较，可以为疫苗研发和接种提供重要的参考依据。
本研究旨在探讨人二倍体细胞狂犬疫苗和Vero细胞纯化狂犬疫苗在安全性方面的差异，为狂犬疫苗接种提供科学依据，保障公众健康安全，推动疫苗研究和应用的发展。
通过本研究的开展，我们希望能够全面评估两种疫苗的安全性表现，为医学界和公众提供可靠的信息，促进狂犬病防治工作的开展，同时为未来相关研究提供参考和借鉴。
2. 正文2.1 人二倍体细胞狂犬疫苗的安全性分析人二倍体细胞狂犬疫苗是一种经过特殊培养的细胞感染制备的疫苗，其在疫苗生产过程中不含有任何动物源性成分，因此具有较高的安全性。
研究表明，该疫苗在动物模型和临床试验中均表现出良好的安全性和免疫原性。
人二倍体细胞狂犬疫苗在生产过程中不含有动物源性成分，避免了可能存在的动物病原体污染。
人二倍体细胞疫苗经过严格的纯化和灭活处理，确保疫苗中病毒活性被彻底破坏，从而降低了疫苗接种后出现疾病的风险。
人二倍体细胞狂犬疫苗与Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性对比分析
人二倍体细胞狂犬疫苗与Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性对比分析1. 引言1.1 背景介绍狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的急性传染病，可影响多种动物和人类。
狂犬病在感染后会导致中枢神经系统的损害，严重情况下甚至会导致死亡。
为了预防狂犬病的传播，狂犬疫苗的接种已经成为公共卫生的一项重要措施。
目前市面上有多种狂犬疫苗供应，其中包括使用人二倍体细胞和Vero细胞纯化的疫苗。
人二倍体细胞狂犬疫苗是使用人二倍体细胞培养的疫苗，而Vero细胞纯化狂犬疫苗则是利用Vero细胞进行提取和纯化的疫苗。
针对不同来源疫苗的研究逐渐增多，但对于这两种疫苗的安全性，副作用以及临床效果的对比研究相对较少。
本研究旨在对人二倍体细胞狂犬疫苗和Vero细胞纯化狂犬疫苗进行安全性对比分析，旨在为疫苗生产和接种提供科学依据，进一步促进狂犬病的防控工作。
1.2 研究目的该研究的主要目的是对比分析人二倍体细胞狂犬疫苗与Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性，从而为疫苗生产和临床应用提供科学依据。
通过对两种疫苗的成分、副作用以及临床试验结果进行比较，旨在找出哪种疫苗更安全、更有效，以及在实际应用中的推荐使用情况。
研究目的也包括探讨人二倍体细胞狂犬疫苗在临床应用中的表现和优势，以及对比分析结果后对于在疫苗生产和选择上的建议。
通过本研究，可以为疫苗生产企业提供更准确的安全性评估和选择参考，同时对于公共卫生机构在疫苗推广和应用上提供更具有科学性和可操作性的建议，有助于提升疫苗接种的安全性和有效性，保障公众健康。
1.3 研究意义狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的急性传染病，传染性极强，病死率极高。
及时接种狂犬疫苗成为预防狂犬病的有效手段之一。
人二倍体细胞狂犬疫苗和Vero细胞纯化狂犬疫苗是目前广泛使用的两种狂犬疫苗，其安全性和有效性直接关系到人们的生命健康。
通过对人二倍体细胞狂犬疫苗和Vero细胞纯化狂犬疫苗进行安全性对比分析，可以为疫苗生产和选择提供科学依据。
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人二倍体细胞建株、检定及制备疫苗规程人二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。
[B]A细胞株的要求[/B]用于疫苗生产的人二倍体细胞株（以下简称细胞株）须按下列规定进行全面检定。
新建立细胞株，应按《新生物制品审批办法》进行审批。
1 建立细胞株必须具备下列资料1.1 建立细胞株所用的胎儿的胎龄和性别，中止妊娠原因。
1.2 建立细胞株所用胎儿的父、母年龄、职业及健康状况，胎儿父、母系三代应无明显遗传缺陷和肿瘤疾病历史。
在取胎儿组织时，应作出详细调查，报卫生部审批前，应进行一次重复调查。
1.3 原始组织种类，原代培养的数量与生长状况。
1.4 细胞培养史和生长特征，细胞寿命、世代数。
1.5 细胞生长液的成分。
2 细胞株的检定2.1 染色体的鉴定和制片细胞原系建株过程，每8～12世代*应作一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少应有4～5次染色体检查结果。
每次染色体检查，应从同一世代不同细胞培养瓶中取细胞混合再培养，制备染色体标本片。
染色体标本应长期保存（直至褪色不能用为止），以备复查。
每次染色体检查，至少应随机取1000个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检查，并作出有助于复查的记录，其中至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相，作出核型分析。
并应粗数500个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。
可以G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体带型，应用照相图片作出带型分析。
以显带技术检出的核型异常（假二倍体、倒位、易位等）发生率应用比现用上限更宽的基本数据进行评价，合格上限尚未定出。
2.1.1 合格要求1000个和500个中医细胞标本中，检查异常率、合格的上限（可信限95%，Poison 法）如表1。
表1异常检查细胞数（个）1000 500 100染色单体和染色体断裂47 26 8结构异常17 10 2超二培性8 5 2亚二倍性*180 90 18多倍性**30 17 4*亚二倍性超过上限时，可选用批标本片重数**+一个中期细胞内超过53条染色体即为一个多倍体2.1.2 染色体制片要求应及时进行制片质量检查，如发现细胞堆积，染色体分散不好等，由于技术原因不适于读片时，可以及时重新制片。
但已经读片后，不断因某项超过标准（亚二位性除外）而废弃不算。
如考虑到制片技术与质量问题，可重试两次，当有一次结果与原结果相近时，又无可知原因，应以原结果为准。
2.2 外源因子检查细胞株不应有细菌、霉菌、支原体和病毒等污染。
每8～12世代细胞培养物，应进行下列检查。
2.2.1 细菌、霉菌、支原体检查按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.2.2 病毒检查2.2.2.1 细胞直接观察及红细胞吸附试验取混合瓶细胞样品，接种小瓶或小管，长成单层后更换维持液，观察2周，镜检细胞，应保持正常形态特征。
培养7天，用0.2%～0.5%鸡和豚鼠混合红细胞悬液进行红细胞吸附试验，先置于4～8℃，后置于20～25℃，各30分钟，两次观察结果均应为阴性。
2.2.2.2 细胞培养检查细胞培养的上清液混合样品，至少接种4种细胞（原代人肾或猴肾细胞、原代兔肾细胞、人源传代细胞和另一批人二倍体细胞）。
接种的样品量应占维持液的20%以上，于培养5～7天和14天时，进行红细胞吸附试验（见2.2.2.1项）。
培养7天的上清液在同种细胞培养上盲传一代，观察14天，应无细胞病变，红细胞吸附试验应为阴性（在该试验的细胞维持液中，允许加入少量该细胞培养用的牛血清，以利细胞维持和观察）。
2.2.2.3 动物试验检查用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和鸡胚各一组。
每组动物或鸡胚接种受检细胞不应少于107。
按表2所列要求进行试验和观察。
如80%以上动物和鸡胚健存，此试验为通过。
2.2.2.4 其他检查细胞株传代过程中，至少于2个不同世代水平进行包涵体、乙型肝炎表面抗原及电镜检查，结果均应为阴性。
2.3 肿瘤原体检查每8～12世代做一次细胞株的异种移植试验，观察细胞株有无致肿瘤性质，每次实验使用6只乳鼠（3～5日龄）或体重8～10g小白鼠，经抗胸腺血清（ATS）处理，皮下接种活二倍体细胞（最适传代的细胞），观察14天，检查有无结节形成。
有结节或可疑病灶时，做病理切片检查。
试验同时，用HeLa或其他人源传代细胞系做阳性对照试验，用动物数与处理方法同试验组，接种被检二倍体细胞数应为对照肿瘤细胞数的5倍以上。
结果二倍体细胞株不应有移植瘤形成，而对照组细胞则应有80%或更多的动物有典型移植瘤出现（肿瘤结节需经病理组织学诊断）。
表2动物组别要求动物或鸡胚数接种途径接种细胞悬液量（ml/只）观察天数结果乳鼠24小时内2窝≥10脑内腹腔0.010.121 应健存成鼠12～14g 10 脑内腹腔0.030.521 应健存豚鼠350～500g5 腹腔 5.0 42应健存,解剖无结核病变家兔1.5～2.5kg5皮内皮下0.1×10**9.021无异常健存鸡胚9～11日龄10 尿囊腔 0.2 3～4尿液血凝试验阴性****豚鼠于注射前及观察4周作旧结核菌素试验，应为阴性**每只于背部皮内注射10处，每处0.1ml***应用豚鼠和鸡混合红细胞作直接血凝试验可以用任何以免疫抑制剂处理，并对肿瘤细胞有同样敏感性的其他动物试验，如无胸腺小白鼠（nude nu/nu基因型等）。
3 细胞种子细胞株传代过程的早期，应选定适应世代数培养出大量细胞，制成悬液，分装安瓿作为细胞种子。
置液氮中冻存，以备细胞株建成后，大量供应细胞。
冻存的种子细胞活存率应在60%以上。
冻存后一定时间，应至少复苏培养一系至衰老期，并在不同传代水平，检查细胞株的生长、胞核学特征、异种移植等，证明细胞经冻存后的生物学性质无明显改变。
[B]B二倍体细胞用于疫苗生产的要求[/B]1 细胞1.1 细胞株用于疫苗生产的细胞株，必须符合本规程要求。
不含外源因子、核型正常、对病毒敏感和具有足够多的细胞种子。
可用KMB-17、2BS等细胞株。
所用细胞株均须经卫生部批准。
1.2 细胞种子批一个细胞种子批应有足够量早世代细胞，分装安瓿保存于液氮中，作为细胞种子。
2 生产用细胞种子批用一个或数个细胞种子安瓿传代增殖到适宜世代，具有一定量的均一细胞悬液，分装安瓿，标明世代、安瓿号和冻存的日期，保存于液氮中，作为生产用细胞种子。
2.1 生产用细胞种子批检定2.1.1 细菌、霉菌、支原体检查按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.1.2 动物和鸡胚检查外源因子用生产用细胞种子世代水平或至2/3世代寿命水平的细胞作检定样品。
用下列动物和鸡胚检查：乳鼠（24小时内）2窝最少10只成鼠12～14g 10只豚鼠350～500g 5只家兔 1.5～2.5kg 5只鸡胚9～11日龄 10只各种动物和鸡胚的接种法、观察期，按照A2.2.2.3条进行。
2.1.3 肿瘤原性检查按A2.3项执行。
2.1.4 染色体的监测检查用于生产的最后一个世代或其后任一世代，至少检查500个中期细胞的多倍性、染色体精确计数、断裂率、结构异常及其他异常发生率，例如螺旋消失或初级次缢痕或次级次缢痕的明显减弱等。
按A2.1.1项进行评价。
生产用细胞库细胞染色体监测用的染色体标本片和照片，应作为该细胞批监测此细胞生产疫苗批的记录，永久保存。
3 生产用细胞的培养3.1 从生产用细胞种子开始传代培养，以适宜分种率连续传代，直至增殖足够量的细胞培养物用于生产。
用于生产的细胞世代，应在细胞整个寿命期的前2/3世代内。
3.2 细胞外源因子检查于种毒当天，或在连续传代种毒，于最后一次细胞种毒当天，此批细胞留取2%～5%不种毒，换维持液作为正常细胞对照，以检查外源因子。
从换液之日起观察2周，细胞应无异常变化。
用换维持液0～2天的对照细胞上清液，接种原代兔肾、非人灵长类传代细胞及另一批人二倍体细胞，接种样品量应占维持液的20%。
观察14天，换液后5～8天用上清液，在相应细胞盲代一代，观察14天，做血吸附试验。
在收毒时，用0.2%～0.5%鸡和豚鼠红细胞，在2～8℃和20～25℃做血吸附试验，应为阴性。
3.3 细胞鉴别试验在生产用细胞世代水平或其后数代，检查300个中期细胞，计数多倍体，作100个中期细胞染色体检查，应核型正常，鉴别确为本细胞无误。
除染色体监测外，还可用HLA表面抗原鉴定试验。
──────────────────*细胞“世代”的说明：英文是“Population doubling”，简写“PD”，译成“群体培增”，为通俗和习惯以名词“世代”来表示。
PD可按实际计数，增加一倍，或按细胞培养面积，增加一倍，为一个PD，即一个世代。
也就是细胞以1:2分种率传代则为一个世纪，以1:4分种率传代则为2个世代，1:8分种率传代则为3个世代。