利用CRISPR-Cas9技术定点突变链霉菌rpsL基因
利用CRISPR-Cas9技术定点突变链霉菌rpsL基因
利用CRISPR-Cas9技术定点突变链霉菌rpsL基因链霉菌(Streptomyces)是活性产物的重要来源,其次级代谢产物应用广泛,可作为抗真菌药物、抗病毒药物、抗肿瘤药物、抗高血压药、免疫抑制剂以及抗生素等。
近年来从链霉菌发现新化合物的几率不断下降。
但是基因组学研究结果显示链霉菌含有编码20个或更多潜在次级代谢物的基因,其中仅一部分在发酵过程中表达,说明链霉菌含有大量沉默基因,在新化合物发掘和新药研发方面仍有巨大潜力。
本文期望通过CRISPR-Cas9技术靶向链霉菌rpsL基因引入K88E和P91S突变,改变核糖体稳定性,激发链霉菌自身次级代谢物合成潜能,即通过核糖体工程打开链霉菌次级代谢产物的合成途径。
在模式菌株天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor 1147中K88E和P91S 突变是激活效果较为明显的两种突变。
CRISPR-Cas9技术在链霉菌中的应用是相对新颖的课题,最早的见刊文献在2014年年末。
建立高效、普遍适用的基因组编辑系统对于后续唤醒沉默基因及优化菌株都具有极其重要的意义。
本文首先针对链霉菌建立了一套CRISPR-Cas9系统,人工合成了 pCas9-1质粒,对11株海绵共附生链霉菌进行遗传操作。
测试了质粒含有的热敏元件pSG5 rep、筛选标记阿布拉霉素抗性基因(acc)和硫链丝菌素抗性基因(trs),结果显示均能正常工作,并对各培养、筛选、质粒清除等条件进行了优化。
利用该质粒定点突变链霉菌rpsL基因没有获得阳性结果。
然后由pCas9-1质粒衍生出两种不同的质粒,分别命名为pCas9-2和pCas9-3。
这三种质粒含有相同的sgRNA(用于靶向同一位点)和相同的同源重组(HR)模板,区别在于sgRNA和Cas9元件的启动子不同。
利用这两种质粒再次对海绵共附生链霉菌开展操作,依然没有阳性结果。
之后针对陆生链霉菌S.coelicolorAS4.242操作,pCas9-2质粒成功实现了定点突变,阳性率在50%以上,且多次重复显示该系统能稳定工作。
热点03 基因编辑(解析版)
热点03--基因编辑第I卷（选择题）一、单选题1．2020年的诺贝尔化学奖授予了两位在基因组编辑技术（如CRISPR/Cas）领域作出杰出贡献的女科学家。
这项技术的问世源自于人们在本世纪初对细菌抵御噬菌体的机理研究：不少的细菌第一次被特定的噬菌体感染后，由细菌Cas2基因表达的Cas2核酸内切酶（蛋白质）便会随机低效切断入侵的噬菌体DNA双链，并将切下的DNA片段插入CRISPR位点，形成“免疫记忆”。
当细菌再次遭遇同种噬菌体时，由CRISPR位点转录产生的crRNA便会将另一种核酸内切酶（如Cas9）准确带到入侵者DNA处，并将之切断，即“免疫杀灭”。
过程如图所示。
下列说法错误的是（）A．细菌体内发生图中的①过程，需要细菌提供场所、模板、原料、能量等B．图中②过程的机理类似于mRNA与DNA模板链的结合C．核酸内切酶Cas2通过识别特定序列的DNA，并在特定位点将DNA切断D．细菌利用CRISPR/Cas分子装置剿灭入侵噬菌体的过程相当于高等动物的特异性免疫【答案】C【分析】分析图形：左图是初次免疫形成免疫记忆，右图为再次感染后的免疫杀灭。
左图中细菌当第一次被特定的噬菌体感染后，细菌cas2基因表达的Cas2核酸内切酶（蛋白质）会随机低效切断入侵的噬菌体DNA双链，并将切下的DNA片段插入CRISPR位点，形成“免疫记忆”。
右图中当细菌再次遭遇同种噬菌体时，由CRISPR位点转录产生的crRNA 便会将另一种核酸内切酶（如Cas9）准确带到入侵者DNA处，并将之切断，形成“免疫杀灭。
【详解】A、细菌体内发生图中的①过程为基因的表达，包括转录和翻译过程，需要提供核糖体（翻译场所）、细菌DNA（转录模板）、转移RNA（运输氨基酸）、核糖核苷酸（转录原料）、氨基酸（翻译原料）、A TP（供能），A正确；B、由图可知：当细菌再次遭遇同种噬菌体时，由CRISPR位点转录产生的crRNA便会将另一种核酸内切酶准确带到入侵者DNA处，涉及RNA与DNA的结合，与mRNA 与DNA模板链的结合的机理类似，利用的是碱基互补配对的原则，B正确；C、根据题干信息可知：Cas2核酸内切酶能随机低效切断入侵的噬菌体DNA双链，并没有特异性的识别，C错误；D、细菌利用如图所示的CRISPR/Cas分子装置剿灭入侵噬菌体的过程，是后天形成的，则相当于高等动物的特异性免疫，D正确。
crispr cas9原理及应用
crispr cas9原理及应用CRISPR-Cas9 是一种革命性的基因编辑技术，其原理基于一种存在于细菌免疫系统中的天然机制。
该技术利用了一种称为Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats （CRISPR）的 DNA 序列和 Cas9 蛋白质，能够准确地识别和编辑基因组中的特定目标序列。
CRISPR-Cas9 技术的基本原理是通过设计特定的引导 RNA 来指导 Cas9 蛋白质精确地结合到目标 DNA 序列上。
一旦 Cas9与目标 DNA 结合，它会切割 DNA 分子，从而可能引发自然修复过程或介导外源 DNA 片段嵌入到基因组中。
这种技术的目标序列可以根据需求进行设计，从而实现精确的基因组编辑。
CRISPR-Cas9 技术在基因组编辑领域有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因功能和疾病模型的构建。
科学家可以利用CRISPR-Cas9 技术来人为地引发基因突变，以研究基因功能和疾病的发病机制。
此外，CRISPR-Cas9 技术还可以用于治疗基因相关疾病。
通过准确编辑患有遗传病的患者的基因组，科学家可以修复或纠正疾病相关基因的缺陷，以治疗或预防疾病的发生。
CRISPR-Cas9 技术还被用于生物学研究和农业领域。
从基因组编辑的角度看，这种技术可以用于培育产量更高、对病虫害抵抗力更强的农作物，以满足全球不断增长的粮食需求。
此外，CRISPR-Cas9 技术还可以用于改良微生物产生特定化合物，例如药物或化学制品。
总而言之，CRISPR-Cas9 是一种功能强大的基因编辑技术，它已经革新了生物学研究和医学领域。
它的应用不仅仅局限于基因功能研究，还包括基因治疗、农业改良等领域，为人类带来了希望和新的可能性。
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用基因编辑技术CRISPR-Cas的原理与应用在该题目中，我们将探讨基因编辑技术CRISPR-Cas的原理和应用。
以下是对CRISPR-Cas的解释以及该技术在生物学和医学领域的广泛应用。
一、CRISPR-Cas的概述CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种存在于细菌和古菌中的宿主免疫系统。
CRISPR-Cas系统通过储存和利用外源DNA序列信息来识别和破坏入侵的病毒和噬菌体。
二、CRISPR-Cas的工作原理1. CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9是其中最常用的一种CRISPR系统。
它基于Cas9酶与CRISPR RNA（crRNA）和转录单元的连接，使Cas9能够识别和切割目标DNA序列。
crRNA通过配对目标DNA上的特定序列，引导Cas9到目标位点。
Cas9酶通过其核酸酶活性切割DNA，引发细胞自然的DNA修复机制。
2. CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13系统除了Cas9，CRISPR-Cas系统中还有其他酶如Cas12和Cas13。
CRISPR-Cas12使用crRNA和转录单元来导向Cas12酶切割DNA，而CRISPR-Cas13则使用crRNA来导向Cas13酶切割RNA。
三、CRISPR-Cas的应用领域1. 基因组编辑CRISPR-Cas系统可以被用来编辑生物体的基因组。
通过设计合适的引导RNA序列，可以将Cas酶定点引导到目标基因组位点，并进行切割或修改特定的DNA序列。
这为基因功能研究和疾病相关基因的研究提供了高效率和精准性的工具。
2. 基因治疗CRISPR-Cas系统在基因治疗中具有巨大潜力。
通过将CRISPR-Cas 工具引导到有缺陷的基因区域，可以修复或替换不正常的基因序列。
这为一些遗传性疾病的治疗提供了新的可能性。
crisprcas9基因编辑技术原理
crisprcas9基因编辑技术原理CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种革命性的生物技术，它允许科学家以前所未有的精确度和效率对DNA进行编辑。
这项技术基于细菌的自然防御机制，已被广泛用于生物医学研究和基因治疗领域。
CRISPR-Cas9技术的原理CRISPR-Cas9系统是由两部分组成的：CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）和Cas9蛋白。
CRISPR是细菌基因组中的一种特殊结构，由一系列重复的DNA序列组成，这些序列之间由非重复的间隔序列隔开。
这些间隔序列实际上是细菌在遭遇病毒入侵时，从病毒DNA中截取的片段，用作识别和防御未来入侵的标记。
Cas9蛋白是一种核酸酶，它能够切割DNA。
在自然状态下，Cas9蛋白与CRISPR RNA（crRNA）和转录自CRISPR区域的一段RNA（tracrRNA）结合，形成复合体。
crRNA和tracrRNA的结合使得Cas9能够识别并结合到特定的DNA序列上，然后切割双链DNA。
CRISPR-Cas9的应用科学家们利用CRISPR-Cas9技术，通过设计特定的导向RNA（gRNA），可以指导Cas9蛋白精确地定位到目标DNA序列上。
一旦定位成功，Cas9蛋白就会在目标位点切割DNA，造成DNA双链断裂。
细胞自身的DNA修复机制会尝试修复这个断裂，科学家可以利用这一点，通过提供特定的DNA模板，引导细胞修复机制将特定的基因序列插入到目标位点，实现基因的添加、删除或替换。
CRISPR-Cas9的优势1. 精确性：CRISPR-Cas9可以精确地定位到基因组中的特定位置，实现单碱基的编辑。
2. 灵活性：通过改变导向RNA的序列，可以轻松地将Cas9蛋白引导到不同的基因位点。
3. 效率：CRISPR-Cas9技术大大提高了基因编辑的效率，使得基因编辑变得更加快速和经济。
基于CRISPR
第38卷第2期2024年3月山东理工大学学报(自然科学版)Journal of Shandong University of Technology(Natural Science Edition)Vol.38No.2Mar.2024收稿日期:20230301基金项目:江苏省高校 青蓝工程 项目(2023);江苏省高职院校青年教师企业实践项目(2021QYSJ063);江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学)开放课题(SDGC2239)第一作者:谢钰珍,女,295842442@;通信作者:覃鸿妮,女,qinhn@文章编号:1672-6197(2024)02-0067-06基于CRISPR /Cas9基因编辑技术构建PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株谢钰珍1,覃鸿妮1,2,吴凡1,孙曙光1,孟丽君3(1.苏州工业园区服务外包职业学院生物科技学院,江苏苏州215123;2.江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学),江苏苏州215000;3.苏州东岭生物技术有限公司,江苏苏州215123)摘要:利用CRISPR /Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD -L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP )序列,构建含有PD -L1-GFP 报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株㊂根据CRISPR -Cas9靶点设计原则,针对PD -L1基因终止密码子设计两对sgRNA ,退火形成双链后连接至Lenti -V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证㊂对于正确的Lenti -V2-sgRNA 重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率㊂根据靶点位置设计左同源臂+GFP +右同源臂序列合成Donor 片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证㊂将验证成功的Lenti -V2-sgRNA 和pUC19-donor -GFP 共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP 表达情况,菌落PCR 及基因测序验证GFP 报告基因的靶向插入效果㊂经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD -L1的Cas9载体Lenti -V2-gRNA 和含GFP 基因的Donor 质粒pUC19-donor -GFP 构建成功㊂两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察㊁多克隆验证㊁单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP 成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR 均检测到特异条带,表明在PD -L1终止密码子前成功插入了GFP 片段,细胞株构建成功㊂通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD -L1-GFP 报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD -L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD -L1的上游新靶点及药物奠定了基础㊂关键词:PD -L1;CRISPR /Cas9;报告基因;GFP 中图分类号:TB532.1;TB553文献标志码:AConstruction of HT29cell line with PD -L1-GFPreport gene by CRISPR /Cas9systemXIE Yuzhen 1,QIN Hongni 1,2,WU Fan 1,SUN Shuguang 1,MENG Lijun 3(1.School of Biotechnology,Suzhou Industrial Park Institute of Services Outsourcing,Suzhou 215123,China;2.Jiangsu Province Engineering Research Center of Precision Diagnostics and Therapeutics Development,Soochow University,Suzhou 215000,China;3.Suzhou Dongling Biotechnology Company Limited,Suzhou 215123,China)Abstract :Using CRISPR /Cas9and homologous recombination technology to tap green fluorescent protein (GFP)sequence at specific position of PD -L1gene,we constructed human colon cancer cell (HT29)㊀stable cell line containing PD-L1-GFP reporter gene.According to the design principle of CRISPR-Cas9target,two pairs of sgRNAs were designed for the stop codon of PD-L1gene.After annealing,the sgRNAs were connected to the Lenti-V2plasmid.The plasmid was extracted and verified by sequencing after amplification of the receptor cells.For the correct Lenti-V2-gRNA recombinant plasmid,the effi-ciency of gene editing was verified by T7E1digestion.According to the target location,Donor fragment was synthesized from left homologous arm+GFP+right homologous arm sequence,which was ligated to pUC19after double enzyme digestion.Plasmid extraction and sequencing were also performed after re-combinant vector transformation and amplification.HT29cells were co-transfected with Lenti-V2-gRNA and pUC19-donor-GFP,and the expression of GFP protein was detected by fluorescence microscopy. Finally,the targeted insertion effect of GFP reporter gene was verified by colony PCR and gene sequen-cing.The Cas9vector Lenti-V2-gRNA and Donor plasmid pUC19-donor-GFP containing PD-L1were successfully constructed by enzyme digestion and sequencing.After the two recombinant plasmids were transfected into HT29cells,the results of microscopic observation,polyclonal verification,monoclonal screening and identification showed that GFP was successfully transferred into HT29cells and expressed, and the monoclonal cells screened by limited dilution method had uniform fluorescence.Moreover,com-pared with the control group,specific bands were detected in the genomic PCR of the clones of positive cells,indicating that the GFP fragment was successfully inserted before the PD-L1stop codon,and the cell line was successfully constructed.HT29colon cancer cell line with stable expression of PD-L1-GFP reporter gene was successfully constructed by gene editing technology,and a system was established to di-rectly observe whether PD-L1is expressed and the degree of expression,which laid a foundation for sub-sequent in vitro and in vivo screening of upstream new targets and drugs regulating PD-L1. Keywords:PD-L1;CRISPR/Cas9;reporter gene;GFP㊀㊀PD1(programmed death-1,程序性死亡受体-1)为PDCD1基因编码的Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表达于活化的免疫细胞表面,如T细胞㊁B细胞㊁NK细胞以及单核细胞等㊂PD1是维持自身耐受性的重要因子,在生理条件下可通过TCR识别抗原,调节外周组织中T细胞的功能,从而应对和清除外源病菌及内源异常细胞㊂PD-L1(程序性死亡配体-1)也称CD274,是PD1的配体之一,是由CD274基因编码的一种细胞表面糖蛋白,多过度表达于肿瘤细胞表面[1]㊂作为重要的负性免疫调节因子,当T细胞表面PD1受体与肿瘤细胞表面表达的PD-L1配体结合后,可向细胞内传递调控信号,抑制T细胞活化与增殖,从而帮助肿瘤细胞逃脱宿主的免疫监视,因此,抑制PD1/PD-L1通路或者通过特异性靶点抑制PD-L1蛋白的表达,可有效增强肿瘤治疗效果㊂近年来的临床研究结果显示,由PD1/PD-L1通路介导下的免疫抑制在非小细胞肺癌㊁胃癌㊁乳腺癌㊁大肠癌等多种恶性肿瘤的发生发展中均具有重要作用,PD-L1在以上各种癌组织的表达明显升高,且PD-L1的阳性表达与肿瘤大小㊁转移情况㊁分化程度及远期生存率存在密切关系[2-3];此外,从诱导肿瘤细胞表面高表达PD-L1的相关因素来看,目前已报道的肿瘤细胞中调控PD-L1表达的相关信号通路主要有Akt3信号通路和MAPK信号通路㊁IFN-γ信号通路和AR信号通路[4],而且这些通路的某些抑制剂已被证明可调节PD-L1㊂例如:TGFβR-1抑制剂LY364947可明显降低TGFβR-1诱导的PD-L1mRNA和蛋白表达[5];突变转录因子FOXP3在PD-L1启动子区的结合位点后,胰腺癌细胞PD-L1的表达明显受到抑制[6];但关于结肠癌肿瘤细胞PD-L1表达的具体调控机制仍需进一步研究㊂CRISPR/Cas9系统是一种新型基因编辑技术,通过sgRNA介导核酸酶Cas9对基因组特定位点进行识别㊁切割,从而实现基因编辑,操作相对简便,基因编辑效率高㊂本文利用CRISPR/Cas9技术,在PD-L1基因终止密码子之前插入绿色荧光蛋白GFP基因,通过构建稳定表达PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞株HT29,旨在建立一个可直观观察细胞上PD-L1是否表达以及表达强弱的系统,为进一步研究结肠癌细胞中PD-L1表达的可能调控机制提供帮助,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定基础㊂86山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀1㊀材料与方法1.1㊀材料HT29细胞和293T细胞(苏州东岭生物技术有限公司保存),Lenti CRISPR V2质粒载体和pUC19载体(苏州东岭生物技术有限公司),胶回收试剂盒(Thermo),Stbl3感受态大肠杆菌(TransGen Biotech),DMEM培养基和D10培养基(HYclone), T4连接酶(Takara公司),DNA聚合酶(NEB)㊂1.2㊀方法1.2.1㊀sgRNA引物的设计与合成根据NCBI查询的PD-L1基因序列,使用CRISP在线设计工具(/E-CRISP/),根据靶点设计原则,在PD-L1基因终止密码子处设计sgRNA,并在序列正义链与反义链的5 端添加Esp3I(BsmBI)酶切位点,合成的具体序列如下:sgRNA-1:GAGGAGACGTAATCCAGCAT gRNA-1-F:CACCGAGGAGACGTAATCCAGCA gRNA-1-R:AAACATGCTGGATTACGTCTCCTC sgRNA-2:GTCTCCTCCAAATGTGTATC gRNA-2-F:CACCGTCTCCTCCAAATGTGTATC gRNA-2-R:AAACGATACACATTTGGAGGAGA为检测突变是否成功,设置了一对检测引物,扩增产物为包含sgRNA靶点的基因组DNA片段,检测引物具体序列如下:Test-F:TGGGGGACAAGCCATCCCAA Test-R:ATGATTTGCTTGGAGGCTCC1.2.2㊀LentiV2-gRNA重组质粒的构建及鉴定根据所设计序列合成单链sgRNA,经梯度降温PCR退火形成双链sgRNA㊂退火结束后,将得到的双链gRNA连接到已用Esp3I酶切回收后的线性Lenti-V2空载质粒中,连接产物转化Stbl3感受态细胞,37ħ培养过夜后挑取阳性单克隆进行测序验证,测序引物:LKO1-5(GACTATCATATGCTTAC-CGT)㊂针对序列正确的单克隆,提取其对应菌液中的质粒DNA,即可得到正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒㊂1.2.3㊀pUC19-Donor-GFP重组质粒的构建及鉴定设计左同源臂+GFP+右同源臂序列,序列两端添加酶切位点XbaI/BamHI,送公司合成Donor片段,将合成的Donor片段㊁pUC19分别用XhaI和BamHI双酶切后连接㊂取10μL连接产物转化至50μL Stbl3感受态大肠杆菌中,37ħ培养1h 后,均匀涂在含有Amp的LB平板上,过夜培养㊂次日挑取6个克隆于4mL含有Amp的LB培养基中, 37ħ培养16h㊂16h后取1mL菌液抽提质粒,并对质粒进行菌落PCR,判断选取的单克隆中是否含有目的片段㊂将验证正确的质粒送至测序,测序引物:M13-R(CAGGAAACAGCTATGACC),测序正确后冻存菌种㊂1.2.4㊀细胞培养和细胞转染从-80ħ冰箱中取出冻存的HT29细胞,复苏结束后留2mol/L的细胞量在10cm培养皿中培养,隔天进行传代培养㊂培养至第4天时将HT29转移至24孔板中的2孔(一孔转染,一孔阴性对照),每孔0.5ˑ106细胞㊂转染前1~2h更换新鲜培养基(0.9mL/孔),按Lenti-V2-sgRNA(0.6μg)㊁Donor-GFP(0.4μg)㊁1mg/mL PEI(3μL)㊁DMEM(97μL)配制转染体系,室温孵育30min后,将混合液加入到1孔中,另一个孔无须加入,轻轻摇匀后放入培养箱培养(37ħ,5%CO2)㊂1.2.5㊀多克隆效果验证提取转染后的HT29细胞基因组DNA,利用在PD-L1基因组以及GFP上分别设计的上下游引物,对其进行PCR鉴定,以检测其中是否含有在PD-L1位点成功插入GFP片段的目的细胞㊂引物序列: PD-L1-F(TTCAAATTTATCATTTATCA),GFP-R (CCGGACACGCTGAACTTGTG),PCR体系:模板DNA10ng㊁PD-L1-F和GFP-R各1μL,2X PrimeSTAR HS DNA Polymerase MIX10μL,总体积20μL㊂PCR扩增程序:98ħ预变性20s,98ħ变性10s,55ħ退火5s,72ħ延伸35s,共30个循环,68ħ彻底延伸2min㊂扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析㊂1.2.6㊀单克隆细胞筛选转染72h后,观察细胞生长状况并计数,采用有限稀释法,用D10(10%的FBS+DMEM)按每200μL一个细胞稀释到96孔板中,培养24h 后,显微镜观察荧光及细胞状态,并做好标记㊂继续培养,当上一步标记的单克隆细胞密度达到80%后,消化并收集细胞,用基因组DNA抽提试剂盒提取基因组,作为检测引物(TestF㊁R)的扩增模板,最后将扩增产物送至公司测序,以检测PD-L1-GFP 报告基因是否插入成功㊂96第2期㊀㊀㊀㊀㊀谢钰珍,等:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株2㊀结果与分析2.1㊀Lenti -V2-gRNA 重组质粒构建结果重组质粒基因测序结果显示,在酶切位点之间插入的片段位置㊁方向以及序列与预期一致(图1),含有本实验所需要的两条sgRNA 序列,证明LentiV2-gRNA 重组质粒构建成功㊂2.2㊀两条sgRNA 切割效果验证结果为了验证所设计的两条sgRNA 的切割效果,将两种Lenti -V2-gRNA 重组质粒转入293T 细胞后提取基因组DNA,并对其进行T7E1酶切鉴定,结果显示1和2两种sgRNA 都能切下相应大小的条带(图2),证明Lenti -V2-sgR1和Lenti -V2-sgR2都具有切割效果,本实验随机使用其中1条,采用sgRNA2,即Lenti -V2-sgR2㊂图1㊀Lentiv2-gRNA重组质粒测序结果图2㊀T7E1酶切图2.3㊀pUC19-Donor -GFP 重组质粒构建结果以挑选的6个单克隆为模板,经菌落PCR 均能扩增出目的片段(图3),说明菌落中含有目标质粒㊂将阳性质粒进一步送至金唯智测序,从图4可以看出,第一行的序列为测序结果,第二行的序列是所需的模板序列,序列比对完全正确,pUC19-Donor -GFP 质粒构建成功㊂2.4㊀Lenti -V2-sgR2和pUC19-donor -GFP 细胞转染结果㊀㊀将Lenti -V2-sgR2和pUC19-donor -GFP 转染至HT29细胞,72h 后荧光显微镜下观察细胞状态㊂由图5可知,培养72h后可观察到少量细胞表达绿注:1-6为随机挑取的6个单克隆,M 为DNA marker㊂图3㊀pUC19-Donor -GFP 重组质粒转化质粒菌落PCR 结果色荧光,证明GFP 成功转入HT29并进行了表达㊂2.5㊀PD -L1-GFP 报告基因工程细胞株阳性单克隆筛选结果2.5.1㊀多克隆效果验证结果图6为多克隆PCR 鉴定结果,可以发现实验组在200bp 位置有目的条带,而对照组没有,证明GFP 插入到指定位点㊂2.5.2㊀单克隆细胞筛选结果为将上述验证的插入正确GFP 序列位点的细胞挑选出来,将多克隆细胞进行单克隆筛选,图7为荧光显微镜观察结果,可以看到细胞形成了单克隆并且具有均一的荧光,可以进行后续的验证㊂7山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀图4㊀pUC19-Donor重组质粒测序结果(a)细胞图(b)荧光图图5㊀HT29细胞荧光蛋白表达为验证上述挑选的单克隆中所需的序列存在,对其基因组PCR 之后送至金唯智测序,图8显示与正常HT29细胞基因组相比,敲入的实验组所挑的单克隆在终止密码子前插入了GFP 片段,证明细胞系构建成功㊂3㊀讨论PD1表达于活化的免疫细胞表面,如B淋巴细图6㊀多克隆验证琼脂糖凝胶电泳图图7㊀单克隆细胞荧光状态图胞㊁CD4+T 细胞等㊂PD -L1作为PD1的配体之一,在癌组织上可见异常高表达,如肾癌㊁肝癌㊁肺癌㊁乳腺癌及卵巢癌等;但在肿瘤邻近的正常组织中低水平表达,提示它参与肿瘤发生发展,并在削弱抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用㊂PD1/PD -L1是负性共刺激分子,当肿瘤细胞表面的PD -L1与免疫细胞表面的PD1结合时,可抑制免疫细胞的增殖与活性甚至诱导其凋亡,使癌细胞成功逃脱免疫杀伤㊂近年来,PD -L1及其受体PD1信号通路一直是肿瘤免疫领域的热门研究对象,针对阻断PD1/PD -L1通路的单克隆抗体已然成为了肿瘤免疫治疗的明星产品,目前FDA 已经批准了五种PD -L1抑制剂㊂作为非特异性免疫治疗产品,PD -L1抑制剂的抗癌效应具有广谱性,且在不同癌症疾病中显示出了很好的治疗[7-11],但由于治疗过程中的原发性和获得性耐药,相当大比例的患者无法从中受益㊂相较于单药疗法,近年来越来越多的研究正向着PD1/PD -L1耐药机制研究以及联合用药靶点的筛选上转移[12]㊂在一些研究报道中,针对不同类型免疫检查点的联合疗法已被证明对几种肿瘤有效㊂例如:采用抗PD -1抑制剂抗体㊁抗CD137激动剂抗体和疫苗治疗的三联疗法可以显著增强胰腺导管腺癌的治疗效果[13-14];联合anti -PD -L1和anti -TIGIT 在临床上对转移性NSCLC 患者非常有效[15];增强ITCH 活17第2期㊀㊀㊀㊀㊀谢钰珍,等:基于CRISPR /Cas9基因编辑技术构建PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株性可促进PD -L1泛素化降解从而降低肿瘤细胞PD -L1表达,化合物AK087与MAPK 抑制剂联用可明显增强MAPK 靶向治疗黑色素瘤的效果[16]等㊂但对于其他大部分肿瘤来说,不同疗法治疗过程中肿瘤表面PD -L1的表达量变化情况及产生治疗抗性的关键机制,仍需进一步研究㊂注:斜体为GFP 片段,下划线为PDL1终止密码子,WT 为正常HT29测序序列,Knock -in clone 为实验组测序序列㊂图8 对照组和实验组序列对比图㊀㊀为了探究结肠癌细胞表面PD -L1表达的更多可能调控机制,本研究利用CRISPR /Cas9系统和同源重组的原理,通过两次转染将GFP 荧光基团成功插入到PD -L1基因终止密码子之前,成功构建了PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株,通过荧光信号直观观察细胞上PD -L1是否表达以及表达的强弱程度,为进一步研究结肠癌细胞中PD -L1表达的可能调控机制提供了材料,并为后期体内外筛选调控PD -L1的上游新靶点及药物奠定了基础㊂参考文献:[1]谢丽叶,付杰军,卢奕,等.PD1/PD -L1激活促进癌症发生㊁发展和转移的研究进展[J].肿瘤防治研究,2017,44(6):423-427.[2]车章洪.PD -1/PD -L1通路在肿瘤的发生发展过程中对T 细胞的活化作用研究进展[J].中国新药杂志,2017,26(16):1913-1917.[3]方宇,王海娟,李征洋,等.PD -L1和A2aR 在大肠癌中的表达及意义[J].河北医药,2021,43(3):345-348,352.[4]丰江舟,杨梦梦,朱彬彬,等.人PD -L1基因启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建[J].皖南医学院学报,2016,35(6):524-526.[5]柯佳,李卓伟,李超,等.TGF -β1对结肠癌SW620细胞及其PD -L1表达的影响[C]//中国解剖学会.中国解剖学会2019年年会论文文摘汇编.昆明:解剖学杂志编辑部,2019:182.[6]王秀超.胰腺癌肿瘤细胞PD -L1表达调控机制及联合干预实验研究[D].天津:天津医科大学,2017.[7]李青丽,唐瑶,李富丽,等.抗PD -L1抗体抑制小鼠非小细胞肺癌移植瘤的生长及其机制[J].肿瘤,2020,40(8):531-540.[8]孙晨,镡云辉,耿波,等.PD -1/PD 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CRISPR／Cas9：一种新型的基因组定点编辑技术
CRISPR／Cas9：一种新型的基因组定点编辑技术摘要：CRISPR/Cas9系统是原核生物抵御病毒或质粒等外来遗传物质入侵的一种获得性免疫系统，主要由非特异性的Cas9核酸酶和起识别作用的crRNA所组成。
相较于传统的基因组编辑技术，基于CRISPR/Cas9系统的基因组定点编辑技术具有快速、简单、高效等优点，并且几乎可以用于任何物种的基因编辑。
尽管CRISPRJCas9系统的基因组特异性还有待进一步确认，但该系统在基因组编辑方面的简便性和有效性必将促进生物学的研究和人类疾病基因治疗方面的发展。
关键词：人工核酸内切酶：基因编辑：CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术是研究基因功能的一种重要手段，同时也是许多基因相关疾病的潜在治疗方法。
早期主要依赖于基因同源重组及体细胞核移植技术来完成对特定基因的改造，然而自然情况下基因重组效率极低，且细胞核移植技术费时费力[1，2]，严重制约了基础研究和临床应用。
因此，在不断寻求高效、简便的基因编辑方法过程中，人工核酸内切酶（engineered endonuclease.EEN）介导的基因定点编辑技术快速发展成为一种主流方法。
人工核酸内切酶进行基因编辑的第一步是在修饰位点诱导产生DNA双链断裂缺口（doublestrand breaks，DSB）。
核酸酶诱导产生的DSBs可借助非同源末端连接（non homologous end-join-ing，NHEJ）机制或同源重组（homologous recombi-nation，HR）机制进行修复。
NHEJ将断裂的双链末端直接连接起来，可有效地引起基因的插入/缺失突变，即inclel突变，从而使基因的功能遭到破坏。
当引入模板DNA序列时，可通过同源重组修复（HR），插入或删除特定的基因序列。
通过人工核酸内切酶介导的DSBs，基因突变的几率大于1010，有时甚至超过50%[3] ，因此，人工核酸内切酶被称为“DNA剪刀”。
基因组编辑技术CRISPRCas9原理及应用
基因组编辑技术CRISPRCas9原理及应用CRISPR-Cas9基因组编辑技术：原理、应用与前景引言：近年来，CRISPR-Cas9基因组编辑技术引起了广泛的关注，并被誉为“基因编辑的革命”。
由于其高效、精准、廉价、简便等特点，CRISPR-Cas9已被广泛应用于生命科学研究、疾病治疗、农业改良和生物制药等领域。
本文将首先介绍CRISPR-Cas9的原理，然后探讨其在不同领域的应用，并展望其未来发展前景。
一、CRISPR-Cas9基因组编辑技术的原理：CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种常见于细菌和古菌的基因组中存在的一类短重复序列，它们的间隔区域（spacers）存在与外源侵略元素（例如噬菌体、质粒）的序列（protospacers）相对应的片段。
CRISPR系统通过将外源侵略元素的DNA序列整合到自身基因组中，形成新的spacer，从而构建了一种免疫记忆系统。
Cas9是一种细菌来源的蛋白质，具有剪切DNA双链的能力。
当发生外源侵袭时，CRISPR系统将受到侵略元素的DNA序列转录成非编码的crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA），以及一个编码Cas9的mRNA。
这些RNA分子最终会结合形成成熟的gRNA （guide RNA），并与Cas9蛋白质形成复合体。
gRNA通过与目标DNA序列的互补配对，引导Cas9蛋白质与目标DNA序列结合，并且Cas9蛋白质的核酸酶活性将目标DNA双链切割成两段。
二、CRISPR-Cas9技术在生命科学研究中的应用：1.基因功能研究：通过CRISPR-Cas9技术，可以有效地靶向特定基因的编码区域进行敲除、靶向特定位点进行基因突变，从而揭示基因在生物系统中的功能和调控机制。
这种基因编辑技术的高效性和精确性，使得科学家们能够更加准确地研究基因与表型之间的关联，有助于解析复杂疾病的发病机制。
crisprcas9技术的原理与运用
crisprcas9技术的原理与运用CRISPR-Cas9技术是一种革命性的基因编辑工具，它允许科学家以前所未有的精确度对DNA进行修改。
这项技术的原理基于细菌的自然免疫系统，特别是一种称为Cas9的酶，它能够识别并切割特定的DNA序列。
CRISPR是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”的缩写，它是一种在细菌基因组中发现的重复序列。
这些序列是细菌用来识别并抵抗病毒入侵的机制。
当病毒攻击细菌时，细菌会将病毒的DNA片段整合到自己的基因组中，形成CRISPR序列。
这些序列旁边通常伴随着Cas基因，它们编码的酶能够识别并切割病毒DNA。
Cas9酶的工作原理是通过一个导向RNA（gRNA）来识别目标DNA序列。
gRNA与目标DNA序列互补，能够引导Cas9酶精确地定位到特定的基因位点。
一旦定位成功，Cas9酶就会切割DNA双链，产生一个双链断裂（DSB）。
细胞的DNA修复机制随后会被激活，以修复这个断裂。
CRISPR-Cas9技术的应用非常广泛。
在基础研究中，它可以用于研究基因功能，通过敲除或敲入特定的基因来观察其对细胞或生物体的影响。
在医学领域，CRISPR-Cas9技术有望用于治疗遗传性疾病，例如通过修复导致疾病的基因突变来治疗囊性纤维化或镰状细胞性贫血。
此外，CRISPR-Cas9技术在农业领域也有巨大潜力。
通过编辑作物的基因，可以提高作物的抗病性、耐逆性和营养价值，从而提高农业生产力。
例如，科学家已经成功地使用CRISPR-Cas9技术来提高水稻的抗虫性和小麦的抗旱性。
然而，CRISPR-Cas9技术也存在一些挑战和争议。
例如，基因编辑可能导致非目标效应，即在非目标基因位点产生意外的DNA突变。
此外，基因编辑技术在伦理和法律方面也存在争议，尤其是在人类生殖细胞的编辑方面。
总的来说，CRISPR-Cas9技术是一种强大的基因编辑工具，它在基础研究、医学和农业等领域具有广泛的应用前景。
CRISPR-Cas9基因编辑技术简介
CRISPR-Cas9基因编辑技术简介中学生物科学登录CRISPR-Cas9基因编辑技术简介一林黄叶731 人赞同了该文章来源｜公众号：中学生物科学CRISPR-Cas9基因编辑技术简介/s?__biz=MzUzMjE2ODkxOA==&mid=224749 0541&idx=1&sn=1db981f771aab1bf6ff57f070d35f468&chksm =fab63254cdc1bb4243bd7e781027a571dd3a76f2355e38eff36b 5bd2635ad5636e8ea9fe914c&token=1724268749&lang=zh_CN #rdCRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。
一、什么是CRISPR-Cas系统CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统。
某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为CRISPR 的存储空间。
当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。
C RISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。
1、CRISPR（/'krɪspər/）是原核生物基因组内的一段重复序列。
CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）。
分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。
（注：生活在深海的火山口、陆地的热泉以及盐碱湖等极端环境中，有一些独特结构的细菌，称为古细菌）CRISPR基因序列主要由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成。
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利用CRISPR-Cas9技术定点突变链霉菌rpsL基因链霉菌(Streptomyces)是活性产物的重要来源,其次级代谢产物应用广泛,可作为抗真菌药物、抗病毒药物、抗肿瘤药物、抗高血压药、免疫抑制剂以及抗生素等。
近年来从链霉菌发现新化合物的几率不断下降。
但是基因组学研究结果显示链霉菌含有编码20个或更多潜在次级代谢物的基因,其中仅一部分在发酵过程中表达,说明链霉菌含有大量沉默基因,在新化合物发掘和新药研发方面仍有巨大潜力。
本文期望通过CRISPR-Cas9技术靶向链霉菌rpsL基因引入K88E和P91S突变,改变核糖体稳定性,激发链霉菌自身次级代谢物合成潜能,即通过核糖体工程打开链霉菌次级代谢产物的合成途径。
在模式菌株天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor 1147中K88E和P91S 突变是激活效果较为明显的两种突变。
CRISPR-Cas9技术在链霉菌中的应用是相对新颖的课题,最早的见刊文献在2014年年末。
建立高效、普遍适用的基因组编辑系统对于后续唤醒沉默基因及优化菌株都具有极其重要的意义。
本文首先针对链霉菌建立了一套CRISPR-Cas9系统,人工合成了 pCas9-1质粒,对11株海绵共附生链霉菌进行遗传操作。
测试了质粒含有的热敏元件pSG5 rep、筛选标记阿布拉霉素抗性基因(acc)和硫链丝菌素抗性基因(trs),结果显示均能正常工作,并对各培养、筛选、质粒清除等条件进行了优化。
利用该质粒定点突变链霉菌rpsL基因没有获得阳性结果。
然后由pCas9-1质粒衍生出两种不同的质粒,分别命名为pCas9-2和
pCas9-3。
这三种质粒含有相同的sgRNA(用于靶向同一位点)和相同的同源重组(HR)模板,区别在于sgRNA和Cas9元件的启动子不同。
利用这两种质粒再次对海绵共附生链霉菌开展操作,依然没有阳性结果。
之后针对陆生链霉菌S.coelicolorAS4.242操作,pCas9-2质粒成功实现了定点突变,阳性率在50%以上,且多次重复显示该系统能稳定工作。
在海绵共附生链霉菌中,三种质粒均无法成功实现定点突变,我们怀疑CRISPR-Cas9系统在目标宿主中工作异常,尤其是sgRNA和Cas9元件。
即使在陆生链霉菌S.coelicolor AS4.242中,也只有pCas9-2能成功编辑。
我们通过半定量RT-PCR方法比较陆生链霉菌S.coelicolor AS4.242转化三种质粒后的sgRNA和Cas9的表达水平,结果显示pCas9-2的sgRNA和Cas9表达量介于两者之间,且sgRNA表达量高于Cas9。
因此推测在海绵共附生链霉菌的基因组编辑操作中应当仔细调配sgRNA和Cas9的表达量,且合适的sgRNA和Cas9的摩尔比约为13:1。
另外Cas9表达量不宜太高,否则很可能会伤害到宿主。
这些推测需要引入Real-time RT-PCR等更精确的定量方法,对多种宿主开展更多实验验证。
论文最后对rpsL K88E和P91S突变的S.coelicolor AS4.242突变株进行了初步的活性检测。
结果显示,突变后的菌株对链霉素耐受性提高:从<2 μg/mL 上升至70-80 μg/mL,表明对S.coelicolor AS4.242的核糖体工程操作成功。
但目前还没有检出突变株的抑菌活性,可能实验比较初步,发酵和萃取等步骤没有优化,设计更精密的实验后才能判断是否有次级代谢基因簇因定点突变而被激活。