如何从土壤中分离出微生物
土壤微生物的分离纯化 实验：微生物的分离、培养和菌种保藏
思考题
❖ 什么叫无菌操作？分离放线菌和真菌为什么 需要分别加重铬酸钾和链霉素？
❖ 平板培养时为什么要把培养皿倒置？ ❖ 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？
Байду номын сангаас
实验七
结束
下周实验
理化因素对微生物的影响
（实验三十二、实验三十四、实验三十八）
每毫升样品中微生物细胞数=
每皿菌落平均数 × 稀释倍数 × 1/取样体积数
混匀 凝固
28～30℃ 培养
图7－4 混合法流程图
实验程序 Ⅳ——平板涂抹法（涂布法）
❖ 每人取无菌培养皿1付（每个同学做一只）。在皿底贴上标签，注明 分离菌名、稀释度、组别、班级。
❖ 取已熔化的高氏培养基，分别倒15－20ml入培养皿中，铺平，制成 平板。
养皿里。 ❖ 3.取已熔化的在水浴锅中保温500C左右的马铃薯培养基（PDA培养基），
分别倒约15－20ml入上述培养皿中，轻轻转动培养皿，使菌液、培养基 充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于28～300C恒温培养 5～6d。观察真菌菌落形态以及计数 菌落。并计算出每g土壤中真菌的数 量。即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即 得。 （见图7－4）
挑取单个菌落接种于斜面培养基 上，如果不纯，再移植纯化，最 后得到纯培养。
实验程序Ⅵ——四大类微生物菌落形态的比较和
识别
❖ 区分和识别各大类微生物通常包括菌落形态（群体形态） 和细胞形态（个体形态）两方面的观察。
❖ 菌落形态： 菌落表面湿润：细菌——薄而小，酵母菌——厚而大。 菌落表面干燥：放线菌——密而小，霉菌——松而大。
淀粉琼脂培养基 马铃薯蔗糖培养基
❖ 无菌水：带有玻璃珠装有99mL无菌水三角瓶
土壤中微生物的分离_PPT幻灯片
• 实验目的：
1、学会倒平板 2、了解土壤中微生物分离方法 3、学会稀释涂布平板计数法对微生物计数
微生物的分离及稀释平板法计数
（1）倾注平板法 (混合平板法)
（2）涂布平板法
稀释到适量浓度
倾注或涂布平板
培养
菌落计数
实验安排
• 10-710-610-5 稀释度为细菌培养,肉汤蛋白胨 培养基
• 10-5
• 10-510-410-3 稀释度为真菌培养,马丁氏培养 基
每个梯度3个平行，所以每种菌需要9块平板, 注意标记
• 培养 将细菌、真菌、放线菌培养基倒置于28度培养箱 中培养3-5d；统计所长出的菌落数；
• 挑菌（纯化） 将培养后长出的单菌落数量、形态、培养特征进 行观察，分别挑取单菌落于相应平板上划线、分离， 培养，检查菌落是否一致、单纯（也可以用显微镜 涂片染色镜检是否是单一的微生物），如有杂菌需 进一步纯化、分离。
一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示原 样品中的细胞数。
三、作业
• 利用涂布平板法对土壤样品进行活菌计数
菌落计数 ：
稀
10-4
释
度
10-5
10-6
平板中的 细 1 2 3 平 1 2 3 平 1 2 3 平
CFU数 菌
均
均
均
放 线 菌
真 菌
• 每克含菌样品中细菌/放线菌/真菌 活细胞数＝ （同一稀释度平板上菌落平均数× 10×稀释倍数× 10 ） 含菌样品克数
实验五 土壤中微生物的分离计数
（四）悬液稀释
无菌操作采用－4，－5，－6 稀释液涂布牛肉膏蛋白 胨平板;每个稀释度2个重复。每人用剩下的1个平板做 划线分离，从三角瓶中取土壤悬液作划线分离。
10-1 10克 土样
90毫升 无菌水
10-2
10-3
10-4
10-5
(五)平板涂布
Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod.
一、实验目的：
学习微生物稀释平板计数及划线分离技术 二、实验原理: 采用适宜（选择）培养基和培养条件，或加入某种抑 制剂有利于目标微生物的生长，从而分离获得目标微
生物的纯培养：常用稀释平板分离法和划线分离法
在固体培养基上形成单个菌落。
依据一个单细胞在固体培养基上培养后可以长成一菌
落从而推算样品中含有多少细菌的活菌数目。
简单易行，但易 造成机械损伤
（六）培养：
将平板用报纸包好（每个平板方向一致），
写上班级和姓名，皿底朝上，置于培养箱 培养(温度37℃) 。
（七）细菌计数结果
稀释度 平板 10-5 1 2 10-6 度平 均菌落数
土壤中含 细菌数量
四、平皿划线 分离法
特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）
五、试管斜面接种
1.两支试管呈“V”字形 3.火焰上微烧一周
2.拔下试管塞
4.接种环灼烧、冷却 6.塞上塞子，灼烧接种环
5.接种、划线
六、思考题
(1) 要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关 键?为什么?
(2)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而
土壤中的微生物分离纯化和菌相分析
（二）平板划线分离法
1.倒平板 2.划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环， 挑取待测菌悬液一环在平板上划线。划线的方法很 多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将 样品在平板上进行稀释，培养后能形成单个菌落。
划线方法 方法一：用接种环按无菌操作挑取土壤悬液一环， 先在平板培养基的一边作第一次平行线3-4次，再 转动平板约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷 却后挑取悬液穿过第一次划线部分进行第二次划线， 再用同样的方法穿过第二次划线部分进行第三次划线 或再穿过第三次划线部分进行第四次划线。划线完毕 后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。 方法二：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连 续划线，完毕后，盖上培养皿盖，温室培 养。
二、实验原理
三、实验器材
1.土壤 2.培养基： 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（营养琼脂）（50μg/mL制霉菌素 乙醇溶液） 高氏一号琼脂培养基（10滴100g/L石碳酸和50μg/mL制霉菌 素乙醇溶液） 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（1000mL培养基中加入2mL氯霉素） 3.溶液与试剂： 9mL或4.5mL无菌水的试管，90mL无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶
这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。 但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各 种因素的影响。
二、实验步骤（方法一）
1.编号：取无菌培养皿6套，分别用记号笔表明 10-4、10-5、10-6各2套。另取6支4.5mL无菌水 的试管，依次表明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6。 2.稀释：用1mL无菌吸管准确吸取0.5mL已充分混匀 的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合培养液，加入标 有10-1字样的试管中，此为10倍稀释，吸管中多余的菌 液放回试管中。将10-1试管在手掌中或置于振荡器上振 荡，使菌液充分混匀。另取一支1mL吸管插入10-1试管 菌液中吸取1mL，精确的放0.5mL菌液于10-2试管中， 此为100倍稀释……其余依次类推直至所需倍 数。
实验土壤中细菌的分离与纯化
实验土壤中细菌的分离与纯化
细菌是微生物中最常见和广泛分布的，它们对人类和自然界都起着重要的作用。
在研究不同类型的细菌时，需要从土壤样品中细菌的分离和纯化。
这可以通过多个步骤来完成。
第一步是样品的准备。
准备好样品是关键的第一步。
需要从所需的环境中收集样品，例如，在花园中收集土壤样品，神经外科手术时，需要收集体内的样品。
样品收集后，需要将其保存在适当的容器中，并避免过度处理。
第二步是制备培养基。
为了孵化细菌，需要准备不同种类的培养基，例如，对光和氧气敏感的厌氧菌需要使用厌氧培养基。
还需要选择颜色，形状和口感不同的特殊培养基，以区分不同种类的细菌。
第三步是分离和纯化细菌。
需要采取逐步流程来分离和纯化细菌。
首先，需要将土壤样品分散在培养基中，并容纳在瓶子或平板上。
然后，将样品暴露于光线和空气下，以让细菌开始生长。
细菌的生长取决于培养基的条件，例如，温度，pH，光线等。
为了获得单个细胞，需要通过挑选法或分离检查板来分离细菌。
挑选法是一种分离单个细菌的技术，其中使用草地绿和某些特定镜头。
经过一些练习和专业技能，可以使用这种方法分离出单个细菌。
为了区分不同种类的细菌，还可以在不同的特殊条件下进行培养。
最后，需要使用不同的方法来检验细菌的纯度。
例如，可以使用静电鉴别法来检测细菌的标记。
通过这种方法，细菌可以在电场的方向下移动，并根据它们的大小，形状，颜色等特征进行分类。
细菌的分离和纯化是细菌学研究的关键步骤。
通过这些方法，可以提取不同种类的细菌，进而进行更深入的研究。
分离土壤中微生物的方法
分离土壤中微生物的方法
《分离土壤中微生物的方法》
一、离心分离法
1、离心分离法是一种快速、简便、有效的土壤微生物分离方法，主要用来分离大量的土壤和沉淀物中的微生物。
原理是利用离心力将土壤中的微生物悬浮液中的水分剥离出来，浓缩悬浮液，然后采用制备的高标准分析液（如硫酸铵）搅拌悬浮液，将微生物转移到新的液体中，最终将微生物和悬浮液分离。
2、离心分离的步骤包括：
（1）采集土壤样品
（2）将土壤样品放入备有清水的容器中，并予以搅拌，搅拌时间1-2min。
（3）将搅拌后的样品置于离心机中，用适当速度及时间进行离心分离，离心结束即可得到悬浮液。
（4）将离心后的悬浮液加入制备好的高标准分析液中，并搅拌。
（5）将混合液再次置入离心机中，离心一段时间，即可将高标准分析液和悬浮液分离开来，从而完成土壤中微生物的分离。
二、膜过滤法
1、膜过滤法是一种分离土壤中微生物的有效方法。
原理是将土壤中的微生物悬浮液置于膜滤器上，通过该膜滤器，微生物悬浮液中的水分可以通过滤膜留下，膜滤器上的微生物则由于大小不同而滞留在膜滤器上，最终完成分离。
2、膜过滤分离的步骤包括：
（1）采集土壤样品
（2）将样品放入备有清水的容器中，并搅拌于汤匙，搅拌时间1-2分钟；
（3）将搅拌后的悬浮液置于膜滤器上，以适当的速度滤过，最终完成分离。
（4）完成后，将膜滤器上的微生物收集用来进行后续操作。
从土壤中分离微生物
平板划线分离法示意图
平板划线 分离法 培养结果
5. 稀释混合倒平板
肉汤培养基融化备
用；用1 ml无菌吸管加菌悬液于无菌平皿
中；以无菌操作将冷却至45℃左右的培养
基倒入上述平板内，旋转混合均匀。 6. 恒温培养箱培养 马丁、高氏培养基
平板于28 ℃倒置培养5天，肉汤培养基平板
于37 ℃倒置培养28小时后观察结果。
土壤是微生物生活的大本营，它所含 微生物无论是数量还是种类都是极其丰富 的。因此，土壤是微生物多样性的重要场 所，是发掘微生物资源的重要基地，可以 从中分离纯化得到许多有价值的菌株。
三、主要器材
牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培
养基、马丁培养基、移液管、三角瓶、
无菌水、接种环、酒精灯、土壤悬液、
无菌培养皿、玻璃刮铲、恒温培养箱等。
分离纯化方法很多，基本原理相似， 即将待分离样品进行适当的稀释，使微生 物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在， 然后使其长成一个个纯种单菌落。 挑取某个单菌落转接到斜面试管即得 纯培养的微生物菌种。
将微生物的培养物或含有微生物的样 品移植到培养基上的操作技术称之为接种。 接种的关键是要严格地进行无菌操作。
实验七 从土壤中分离微生物
一. 实验目的
1. 了解微生物分离和纯化的原理 ； 2. 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯 化接种培养的基本操作技术，进一步巩 固微生物的无菌操作技术。
二、实验原理
微生物在自然界中呈混杂状态存在， 要获得所需菌种，必须从中进行分离。在 保藏菌种时不慎污染时也需予以分离。
五、实验报告
（一）实验结果
三种培养基平板上长出的菌落分别属于 哪个类群？简述其菌落特征。 （二）思考题 1. 如何确定平板上某个菌落是否为纯培 养？请写出试验的主要步骤。 2. 如果一项科学研究内容需从自然界中 筛选到能产生高温蛋白酶的菌株，你将如何 完成？请写出简明的实验方案。
分离土壤中微生物的方法
分离土壤中微生物的方法土壤中的微生物是土壤生态系统中非常重要的组成部分，对土壤的物质循环、生态功能以及农田生产等都有着重要的影响。
因此，分离土壤中的微生物并进行研究是了解土壤微生物群落结构和功能的重要手段。
下面将介绍一些常用的分离土壤中微生物的方法。
1.稀释涂平法：稀释涂平法是最为常用的一种分离培养微生物的方法。
首先，将土壤样品稀释成一定的浓度；然后，将适量的稀释液均匀地涂布在培养基平板上；最后，将培养基平板的菌落进行分离鉴定。
优点是简单易行，适用于常见的土壤微生物；缺点是只适用于可培养的微生物。
2.筛选技术：筛选技术通过筛选和培养特定类型的微生物，实现对土壤微生物的分离。
常用的筛选技术有选择性培养基筛选、酶基因筛选、菌落形态和色素筛选等。
优点是可以选择性培养其中一类型的微生物；缺点是存在选择性偏倚和培养基有限性。
3.海绵法：海绵法通过悬浮土壤样品，利用海绵吸附和负压吸附的原理，分离土壤中的微生物。
首先，将土壤样品加入海绵中；然后，通过一定的操作将海绵中的微生物分离出来；最后，对分离出的微生物进行鉴定。
优点是可以分离植物根际微生物和陆地微生物；缺点是操作复杂。
4.聚合物链式反应（PCR）和16SrRNA基因测序：PCR和16SrRNA基因测序是一种通过分子生物学手段分离和鉴定微生物的方法。
首先，从土壤中提取微生物的DNA；然后，利用PCR方法扩增16SrRNA基因片段；最后，对扩增产物进行测序并分析。
优点是可以快速分离和鉴定微生物，无需进行培养；缺点是依赖于标准数据库的准确性。
5.激光共聚焦显微镜技术：激光共聚焦显微镜技术可以直接观察土壤中的微生物，并通过分析其形态特征对微生物进行分类和分离。
优点是可以快速直观地观察微生物；缺点是无法进行鉴定和培养。
综上所述，分离土壤中微生物的方法有许多种，分别适用于不同的研究目的和需求。
可以根据具体情况选择适合的方法。
同时，需要注意的是，单一的方法可能无法完全反映土壤微生物多样性，因此最好结合多种方法进行研究，以全面了解土壤中微生物的群落结构和功能。
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如何从土壤（污水）中分离出微生物
把污水加蒸馏水分别稀释10，100，1000倍，然后加入培养基中培养，如果培养出来菌落重合，菌非常多，无法分离，就加大稀释倍数，直至获得清晰可分离的菌落，有时甚至是非常小的菌落，要用倒置显微镜操作。
而培养基则根据要分离的菌的营养类型进行配置，若要获得多种微生物就要配置多种培养基进行如上操作。
对于土壤加水溶解，对溶解液进行如上操作，不溶的部分就不用管了
1.取以少许土壤（一地表以下10cm处为宜）与适量无菌水混匀备用
2.做浸出液的梯度稀释
3 .涂平板
4.划线分离
5.接平板，接斜面
6.检测
从土壤中分离微生物
环境工程（1）班
一、试验目的
1..学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。
2初步掌握从土壤中分离细菌的基本技术。
二、实验原理土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件．所以土壤中微生物的数量和种类都很多。
它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。
此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。
因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑
是十分必要的。
三、实验器材
(—)培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌）高氏一号琼脂培养基（培养放线菌）查氏培养基（培养霉菌）
(二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养皿。
(三)土壤样品、天平、称旦纸。
（四）恒温箱、气体流量计
四、试验程序
1、倒平板将培养基加热融化，待冷至55—60℃时，混合均匀后倒平板；
2、制备土壤稀释液准确称取土样10g，加入装有90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。
用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-
3、10-
4、10-
5、10-
6、等一系列稀释菌液
3、涂布将无菌平板编上10-
4、10-
5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液
各lml放入编号10-4的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。
再用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌玻璃涂棒，更换稀释度时需将玻璃涂棒灼烧灭菌。
在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换涂棒。
4、培养在28℃条件下倒置培养3—5天。
5、挑菌落将培养后生长出的单个菌落分别挑取少量细胞划线接种到平板上。
28℃条件下培养3—5天后，再次挑单菌落划线并培养，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物，如果发现有杂菌，需要进一步分离、纯化，直到获得纯培养。
五、注意事项
1.制备混合液平板时，不要再注入培养基前让链霉素液与土壤稀释液相混。
2.制备混合液平板时，倾注的培养基温度不能太高，过高的温度会烫死微生物。
六、培养过程及革兰氏染色观察成果
1.培养24h后的情况：马铃薯葡萄糖培养基长出菌种，经判断为细菌，马铃薯蔗糖培养基长出菌种，为酵母菌。
其他培养基没长菌种，拍照如下
当天操作：划线法纯化马铃薯葡萄糖培养基和马铃薯蔗糖培养基长出来的菌种到马铃薯葡萄糖培养基和牛肉膏蛋白胨
琼脂培养基
2.培养2d后的情况：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基和高氏一号培养基均没有长菌落，马铃薯蔗糖培养基长出霉菌一天前纯化培养的菌种拍照如下
3.培养5d后的情况高氏一号培养基长出菌落，经判断为细菌而非放线菌。
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基一直没培养出菌落，拍照如下
4.革兰氏染色结果
细菌革兰氏染色
七、思考题
1.分离放线菌和真菌为什么要加重络酸钾和链霉素？
答：重络酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，链霉素主要用于抑制细菌。
所以加入重络酸钾和链霉菌的主要作用是抑制杂菌生长，使更易于分离放线菌和真菌。
2.平板培养时为什么要把培养皿倒置？
答：1.防止皿盖上的冷凝水污染培养基。
2. 防止培养基水分蒸过快发，培养基变干，无机盐析出，营养成分浓度变大，不利于微生物的生长。
八、总结实验通过微生物的分离与纯化技术从土壤中分离微生物，经分离纯化培养后用革兰氏染色观察所得菌种。
通过对实验的总结，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基一直没能长出菌种，而其他组的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基则能长出菌种，考虑到土壤的来源都是一样的，可以
判断牛肉膏蛋白胨琼脂培养基被污染。
马铃薯蔗糖培养基经过24h的培养后长出了大量细菌菌落，而经过培养2d后长出了霉菌，由于先前长了大量细菌导致霉菌菌落少，挑取细菌与霉菌纯化培养。
马铃薯葡萄糖培养基经过24h培养后长出菌落，判断为酵母菌，经过纯化培养后用革兰氏染色观察。
高氏一号培养基经过5d培养没能长出放线菌，但有少量细菌。