青蒿素分析方法的确定
青蒿素的提取
北京化工大学北方学院NORTH COLLEGE OF BEIJING UNIVERSITY OFCHEMICAL TECHNOLOGY（2013）届本科生天然产物有效成分提取大作业题目：青蒿素的提取学院：理工院专业：化学工程与工艺学号： 090101153 姓名：马鸿飞指导教师：刘雪凌教研室主任（负责人）：2012 年 6 月 5 日天然色素的提取——青蒿素提取马鸿飞化学工程与工艺化工0906班学号090101153指导老师：刘雪玲摘要提取青蒿素的工艺 ,考察了粒度、压力、温度、时研究了超临界CO2流量等影响因素.以萃取率为目标 ,综合考虑产品收率 ,优化了超临间、CO2界萃取工艺条件 ,得到较佳的操作条件:萃取压力 20 MPa ,萃取温度50 ℃,每千克原料CO质量流量1 kg/ h ,分离器Ⅰ的温度为60 ℃,压力为14 MPa.2在优化条件下萃取 4 h ,萃取率达到 95 %以上 ,萃取物纯度在 15 %以上. 关键词：青蒿素超临界二氧化碳萃取黄花蒿前言超临界流体萃取是利用处于临界温度，临界压力之上的超临界流体具有溶解许多物质的能力的性质，将SCF作为萃取剂，从液体或固体中萃取分离出特定的成分的新型分离技术由于它具有低能耗、无污染和适合于处理易热分解和易氧化物质的特性，因而在化学工业、能源工业和医药工业中引起广泛的兴趣和应用。
流体与普通的有机溶剂相比，具有明显的优SCF 萃取剂特别是超临界CO2势。
它是环境友好型溶剂，对人畜无害，不污染环境，也不会残留在产品中，而且临界温度（31。
1度）和临界压力（7.387MPa）较低，故操作条件相对较温和。
流体密度接近于液体，因而具有很大的溶解能力，而粘度却接近由于超临界CO2于气体，其扩散能力又比液体大100倍以上。
并且，其溶解能力和选择性很方便的通过改变压力和温度进行调节，萃取速率快，操作时间短，所以一直受到大家的重视。
SFE技术在食品、医药、香料和天然色素等领域的天然物提取分离上的应用研究，一直是SFE技术研究最活跃的领域，受历史和传统习惯的影响，国外这方面的研究主要集中在天然香味物、调味品和天然色素的提取上，而国内则多集中在传统中药的有效成分的提取上，以适应中药现代化的发展要求。
开题---青蒿素介绍
1.1青蒿
青蒿(Artemisia annua L.)又称黄花蒿，为常用的中草药之一。青蒿素 (artemis inin ,QHS)是中国科学工作者从青蒿中提取、分离、鉴定的一种新型抗疟药， 因其结构特殊，疗效高，而毒性很低，弓I起国内外的重视[4-5]。青蒿广泛分布于中国南
北各地，资源十分丰富。由于青蒿品种、种植条件、种植技术等的差异，从而导致青蒿 中青蒿素含量的不同⑹。一般南方地区的青蒿素含量高于北方，以南岭山脉、武夷山脉 以南为高含量区，尤其是以广西、广东以及海南北部最高。其最早出现于马王堆三号汉 墓出土的帛书《五十二病方》，而后在《大观本草》、《神农本草经》、《本草纲目》均有 收录，主要用于治疗消暑、泻热、止汗等。
石油醚，几乎不溶于水⑹。对热不稳定，易受潮、热和还原性质的影响而分解[9]。青嵩
素(Artemisi nin)是继乙氨啼唆、氣喳、伯喹之后最热的抗培特效药,尤其是对于脑型拒疾
和抗氯喹培疾，青蒿素具有速效和低毒的特点，曾被世界卫生组织称做是世界上唯一有 效的拒疾治疗药物”。它是一种含有过氧基的新型倍半蔽内酷化合物,分子式C15H22O5[10]0
效和低毒的特点，已成为世界卫生组织推荐的药品。青蒿素在原植物青蒿中含量很低， 一般只有7%左右。
青蒿素作为抗痕疾骨干药“奎宁”的替代药物，市场潜力巨大。因此,对青蒿素的提 取和应用技术引起了国内外许多研究者的极大关注[2]。目前,提取青蒿素的工艺基本成 熟,已经工业化生产，但提取效率低，青蒿原料浪费严重，成本偏高⑶。同时已有多种测定 青嵩素的方法见于文献，但都存在着一定的缺点，如分析速度慢，成本高,过程复杂等，为 了使青蒿素能够快速、高效的扩散到提取介质中，得到较高的提取效率，为了找到一种迅 速、简便、灵敏度高的青蒿素测定方法，故本实验采用正交试验研究了超声时间、超声 功率、超声温度和提取溶剂量对提取的影响， 确定了最佳提取条件，提取所得滤液经减 压浓缩，除去杂质，重结晶，干燥精制后的青蒿素纯品。
青蒿素分析方法的确定讲解
2.末端吸收[14]
色谱条件：
色谱柱Kromasil
ODSC18(416mm ×250mm, 5 μm); 流动相为乙腈-水 ( 60：40); 流速为 1.0mL/min; 检测 波长为203nm; 柱 温30℃。理论塔 板数2000.
1.2.4 LC-MS-MS
体内药物分析是测定体液(主要是血浆、血清或全血)中药物或其他代 谢物浓度。由于血液样品试样提供量少，基质复杂，在此混合物中分 析某种微量成分(通常为(g/mL或ng/mL水平)并加以鉴别，常常是对分 析化学家的挑战。
色谱分析条件 色谱柱: Nucleodur C18 ( 250mm ×416 mm, 5μm D) ; 流动相: 乙腈-0.1%乙酸 (50 ∶50) ; 流速: 110 mL/min ; 柱温: 25 ℃青蒿乙 素和青蒿酸用UV检测器检测, 波长为209nm; 青蒿 素用ELSD检测器检测, 漂移管温度50 ℃, 载气 (N2 )压力30 p si ( 1 p si≈ 619 kPa) , 增益值为50; 进样体积为10或30μL。
LC-MS虽然有足够的灵敏度，但遇到LC难以分离的组分，其应用受到 限制。使用LC-MS／MS可以克服背景干扰，通过MS／MS的选择反 应控制模式(SRM)或多反应检测模式(SRM)，提高信噪比，因此对复 杂样品仍可达到很高的灵敏度。
UPLC—MS MS法检测青蒿中青蒿素的含量
UPLC—MS MS法检测青蒿中青蒿素的含量摘要：采用UPLC-MS/MS法检测青蒿中青蒿素的含量，色谱柱Waters ACQUITY BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.9 μm），以甲醇和水梯度洗脱，甲醇-水体积比为40%（0 min）-70%（4.5 min）-40%（5.0 min）-40%（5.5 min），流速0.30 mL/min，柱温30 ℃，进样量3.0 μL，离子模式（ESI+）分析，青蒿素母离子为m/z=283.3。
子离子m/z=151.2，m/z=209.4。
结果表明，在上述条件下，青蒿素与杂质分离完全，无明显干扰，检出限达到0.174 ng，平均回收率为99.38%，精密度良好，青蒿中青蒿素含量为（1 045.19±27.55）mg/kg，该法适用于青蒿素分析。
关键词：UPLC-MS/MS；青蒿；青蒿素Detection of Artemisinin in Artemisia annua L. by UPLC-MS/MSAbstract：The detection of artemisinin in Artemisia annua L. was analysed by UPLC-MS/MS. The chromatographic column waters ACQUITY BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.9 μm）was used in the analysis. The elution program was 40% （methanol/water，V/V，0 min）-70%（4.5 min）-40%（5 min）-40%（5.5 min）. The isolation was preformed with 0.3 mL/min at 30 ℃，and the injection volume was 3.0 μL in ESI（+）scan. The precursor ion of artemisinin was m/z=283.3，daughter ion were m/z=151.2，m/z=209.4. The results showed that artemisinin could be detected in these conditions. The detection limit was 0.174 ng with recovery of 99.38% and good precision. The content of artemisinin in Artemisia annua L. reached （1 045.19±27.55）mg/kg. It was suitable for detecting artemisinin in Artemisia annua L..Key words：UPLC-MS/MS；Artemisia annua L.；artemisinin青蒿（Artemisia annua L.），又名黄花蒿，菊科，一年生草本，高1.5 m，全株黄绿色，有浓烈挥发性香气。
青蒿素分析方法的确定
为什么要测定青蒿素的含量
不同产地的青蒿药材中青篙素的含量差异较大，而青蒿 素是青篙截疟的主要有效成分，因此对药材中青篙素含 量的准确测定十分必要。
提取青蒿素的溶剂：
青蒿素C15H22O5 在丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷或苯中易 溶, 在甲醇、乙醇、稀乙醇、乙醚及石油醚中溶解, 在水中 几乎不溶解; 在冰醋酸中易溶。
朗伯比尔定律：A=-lgT=εbc
b，ε一定，吸光度A和溶液浓度c成正比
∴青蒿素含量=( 青蒿素样品浓度×标准浓度单位×原始 体积) / 青蒿研细粉末质量
UV法总结
UV法测定青蒿素是依据青蒿素在碱性条件下生成的青蒿 素衍生物 Q292在292 nm波长处有较强的紫外吸收来定量 的，其优点是操作简单，对仪器设备的要求不高，其缺点 是不能排除青蒿素类似物等物质的干扰。因此，UV法测 定青蒿中青蒿素的含量实际反映的是药材中青蒿素及其类 似物的总量。陈靖等[5]报道，青蒿中青蒿素类似物青蒿 酸、青蒿素B、3α-羟基-1-去氧青蒿素的平均含量分别为 0.47％ 、0.05％、0.005％，对青蒿中青蒿素含量的测定 影响较大，使得测定结果偏高。
1.3.1 HPLC-ELSD法
蒸发光散射检测器(ELSD) 为通用型的质量检测器, 对结构相似物质可给出几乎相同的响应因子,响应 值大小取决于物质浓度及检测条件下物质颗粒的 大小, 而不依赖于紫外吸收, 因此适合于青蒿素及 双氢青蒿素的含量测定。
例：HPLC-ELSD 法测定复方双氢青篙素片中双 氢青篙素的含量
IR、MS、NMR HPLC
(UV、ELSD、SPD...) UPLC
LC-MS/LC-MS-MS 高效毛细管电泳 CE
定量分析
1.1 青蒿素的IR定性分析
双氢青蒿素dihydroartemisinin
柱层析提取法提取青蒿素的工艺研究
柱层析提取法提取青蒿素的工艺研究罗嘉玲;李青嵘;张雅文;陈亚飞;倪贺;李海航【摘要】研究开发了一种柱层析提取法提取青蒿素的新工艺.将干燥粉碎的黄花蒿植物材料用提取溶剂V石油醚∶V95％乙醇=2∶8按m料∶V液=1.0∶3.5湿法装入层析柱中,静置lh后洗脱.少量和放大提取实验都显示:收集3.50、4.75、7.00和10.50倍体积洗脱液时,青蒿素的提取率分别超过90％、95％、97％和99％.结果表明:该提取方法工艺简单、提取率高、溶剂用量少、节能环保、设备和生产成本低,适合工业上提取制备青蒿素.%A new column chromatographic extraction (CCE) method was developed for the extraction of artemisinin from Artemisia annua.Dried material was loaded into a column using 3.5-fold (V/m) extraction solvent of petroleum ether:95％ethanol (2∶ 8).After 1 h when artemisinin is fully dissolved,the column was eluted with the extraction solvent.The extraction efficiency in both small-scale and enlarged-scale experiments reached more than 90％,95％,97％ or 99％when collecting 3.50-,4.75-,7.00-or 10.50-fold eluent,respectively.The results indicated that the CCE method is simple and highly efficient;and the extraction process can be completed in a column at room temperature at low equipment and production costs.It can be used for industrial extraction of artemisinin.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(050)002【总页数】5页(P65-69)【关键词】黄花蒿;青蒿素;柱层析提取;混合溶剂【作者】罗嘉玲;李青嵘;张雅文;陈亚飞;倪贺;李海航【作者单位】华南师范大学生命科学学院∥广东省植物发育生物工程重点实验室,广州510631;华南师范大学生命科学学院∥广东省植物发育生物工程重点实验室,广州510631;华南师范大学生命科学学院∥广东省植物发育生物工程重点实验室,广州510631;华南师范大学生命科学学院∥广东省植物发育生物工程重点实验室,广州510631;华南师范大学生命科学学院∥广东省植物发育生物工程重点实验室,广州510631;华南师范大学生命科学学院∥广东省植物发育生物工程重点实验室,广州510631【正文语种】中文【中图分类】Q819青蒿素(Artemisinin)是20世纪70年代从菊科艾属的草本植物黄花蒿( Artemisia annua L.)中分离得到的一种具有过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物[1]. 青蒿素是最有效的抗疟疾药物之一，具有高效、速效和低毒等特点[2-5]. 也有研究[6-7]通过青蒿素的结构修饰，合成出了系列活性更高的青蒿素衍生物，如双氢青蒿素、蒿甲/乙醚和青蒿琥酯等. 青蒿素及其衍生物除抗疟疾外，还有抗肿瘤、抗孕、抗纤维化、抗血吸虫和弓形虫等寄生虫、抗心律失常和治疗各种皮肤病等作用[8-9].青蒿素主要是从青蒿植物材料中提取. 青蒿素在青蒿中的含量很低,不同产地青蒿中青蒿素含量差异显著，最高可达干质量的1%～2%[5]. 目前提取青蒿素通常采用有机溶剂浸泡法,超声或微波辅助的浸泡提取法，也有用超临界CO2 萃取法. 王轶[10]以青蒿叶干粉为原料, 用95%乙醇搅拌提取青蒿素，通过正交实验得到的最佳提取条件为: 原料粒度0.25 mm，溶剂量60 mL/g, 提取温度50 ℃，提取时间120 min，青蒿素提取率可达78.2%. 黄荣岗等[11]用 70%甲醇在5 ℃下低温提取青蒿素3 h，青蒿素的提取率最高达到82.5%. 钱国平等[12]用超临界CO2提取法提取青蒿素，提取率达到95%以上，提取物纯度可达10%以上. 赵兵等[13]在50 ℃下用超声波辅助的石油醚提取青蒿素，提取率可达83%. 郝金玉等[14]用乙醇、三氯甲烷、环己烷、正己烷、石油醚、120#溶剂油和6#溶剂油等不同溶剂提取青蒿素，比较了微波辅助提取与索氏提取、超临界CO2提取和加热搅拌提取法的效果，表明微波辅助萃取可大大提高提取速率,6#油的提取率最高，达到92.1%.目前工业上提取青蒿素主要以汽油等为溶剂加热提取，存在溶剂用量大、能耗高、提取率低和安全性差等问题. 本实验室开发了一种提取天然药物的柱层析提取新方法[15-16]，本研究利用该柱层析提取法开发和优化从黄花蒿中提取青蒿素工艺，旨在为青蒿素的工业化生产提供更安全、低成本的方法.1 材料与方法1.1 实验材料与试剂干燥粉碎的黄花蒿植物材料和青蒿素标准品由广州斯威森科技有限公司提供. HPLC所用甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯试剂，购自本地试剂公司.1.2 青蒿素HPLC定性定量分析方法的建立用95%乙醇将青蒿素标准品配成质量浓度为312.5 mg/L的溶液， UV759分光光度计(上海精科实业有限公司)测定青蒿素的紫外吸收光谱和吸收峰. 以实验确定的紫外吸收峰为检测波长，用LC-20AT高效液相色谱(日本岛津公司)系统对青蒿素进行定性与定量分析. 所用色谱柱为C18 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为V甲醇∶V水=75∶25，流速为1 mL/min，进样量10 μL. HPLC分析样品经过0.45 μm的膜过滤. 样品中青蒿素的保留时间为青蒿素标准品保留时间. 用10mg/mL的青蒿素标准品溶液，配制成不同质量浓度的溶液[16]，制作青蒿素质量浓度与峰面积之间的定量曲线，计算样品中青蒿素含量.1.3 柱层析法提取青蒿素方法的优化柱层析提取法是将植物材料用最少体积的提取溶剂装入层析柱中，待成分充分溶解后，用同样的溶剂、按柱层析洗脱的原理和方法，将材料中的青蒿素从层析柱中洗脱出来，整个过程在室温下进行. 因此，需要筛选出溶解青蒿素的最佳溶剂，然后测定青蒿材料吸收该溶剂达到饱和时所需要的最小体积的溶剂(Minimum Volume，MV)[15]，材料中青蒿素充分溶解(达到溶解平衡)所需要的时间已事先测定为0.5h.1.3.1 提取溶剂最佳配比的确定干燥的黄花蒿茎叶粉末过42.5 μm筛，作为提取材料. 提取溶剂为不同比例的V石油醚∶V95%乙醇混合溶剂(10∶0、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8、0∶10). 在5 mL提取溶剂中加入1 g材料，浸泡0.5 h后，离心取上清液，HPLC测定提取液中青蒿素的含量，选择青蒿素含量高的溶剂作为提取溶剂.1.3.2 材料饱和吸液最小体积(MV)的确定在10 mL提取溶剂中加入1 g提取材料，在25 ℃下、200 r/min分别震荡浸泡0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，过滤，测定剩余提取液的体积(V余)，1 MV=10-V余.1.3.3 柱层析法少量提取青蒿素方法的建立称取青蒿材料9 g，按比m料∶V液=1.0∶3.5加入提取溶剂，按柱层析湿法装柱的方法，装入层析柱. 静置0.5 h，待青蒿素充分溶解后，以1.0 MV/h的流速洗脱. 依次按1.0、0.5、0.5、1.0 MV的体积收集洗脱液，共收集4份、总体积3 MV 的洗脱液. 残渣用10倍体积的提取溶剂超声辅助的浸泡提取1次,超声功率为240 W、频率为40 kHz，时间为1 h. HPLC测定每份提取液中青蒿素的含量，计算提取率(以收集的3 MV和残渣中的青蒿素总量作为100%，计算各部分的提取率). 每个实验重复3次，结果为3次重复的平均值，计算重复之间的标准差(Standard Error，SE).1.3.4 柱层析法大量提取青蒿素方法的建立用直径为8 cm，柱高为80 cm的层析柱放大80倍进行实验，填料质量为750 g. 青蒿素的提取及检测方法与柱层析少量提取法相同.2 结果与分析2.1 青蒿素定性定量分析青蒿素在190～400 nm的紫外光范围内只有一个显著的吸收峰(图1A)，吸收峰波长为208 nm，选择该波长为HPLC的检测波长. 图1B为青蒿素标品HPLC图谱，根据青蒿素标准品的保留时间，确定提取液中青蒿素保留时间为8 min. 在质量浓度为1～6 g/L范围内，青蒿素与其峰面积之间有良好的线性关系(图1C). 在采用的实验分析条件下，提取液中的青蒿素能与杂质达到基线分离(图1D)，可准确测定溶液中的青蒿素含量.图1 青蒿素HPLC定性定量分析方法的建立Figure 1 Qualitative and quantitative analysis of artemisinin by HPLC2.2 柱层析法提取青蒿素的最佳条件确定2.2.1 提取溶剂的筛选通过浸泡实验测定了不同比例的石油醚与95%乙醇组成的混合溶剂对青蒿素提取的影响. 结果表明(图2)，在V石油醚∶V95%乙醇在10∶0到0∶10范围内，青蒿素的提取率随 95%乙醇比例的增加而提高；在V石油醚∶V95%乙醇为2∶8时，青蒿素提取率最高；此后再增加提取液中95%乙醇的比例，青蒿素提取率逐渐下降. 因此，确定青蒿素在该溶剂系统中的最佳提取溶剂为V石油醚∶V95%乙醇=2∶8.图2 提取液不同配比对青蒿素提取效率的影响Figure 2 Effect of ether and ethanol proportions in the extraction solvent on the extraction efficiency of artemisinin2.2.2 植物材料饱和最小吸液体积的测定植物材料1 g在浸泡0.5～5.0 h后，吸收的提取液体积基本一样，介于3.0～3.5 mL/g之间(图3)，表明材料吸收提取溶剂的速度很快，浸泡0.5 h已达到吸收饱和. 因此，确定青蒿材料对最佳提取溶剂的饱和吸液时间为0.5 h，材料的饱和最小吸液体积为3.5 mL/g，即1 MV=3.5. 根据以上结果，确定从植物材料中提取青蒿素的条件为：提取液V石油醚∶V95%乙醇=2∶8. 按m植物材料∶V提取液=1.0∶3.5将植物材料装入层析柱中，放置0.5 h后，再用该溶剂将层析柱中的青蒿素洗脱出来.图3 植物材料饱和吸液最小体积(MV)的确定Figure 3 Determination of minimum volume (MV) of solvent for the plant material fully absorbed2.3 柱层析法提取青蒿素条件的优化及其放大提取实验收集的4份(1.0、0.5、0.5、1.0 MV)提取洗脱液和残渣浸泡提取液其青蒿素质量分数分别为92.3%、4.3%、1.4%、1.8%、0.2%(图4A). 结果表明：收集前1.0、1.5 MV的提取液(分别为材料干质量的3.50倍和4.75倍体积的溶剂)，青蒿素的提取率可分别达到92.3%和96.6%. 收集3 MV体积的提取液时(即材料干质量的10.5倍体积提取液)，青蒿素的提取率可达到99.8%，残渣中的青蒿素质量分数只有0.2%.实验室条件下，将以上提取实验放大80倍，步骤和试剂不变，收集前4份、总体积3 MV的提取液和残渣的浸泡提取液，分析结果如图4B所示. 前1.0 MV和1.5 MV 的提取液中青蒿素提取率分别达到90.2%和95.1%，收集3 MV体积的洗脱液，青蒿素的提取率可达到99.4%，植物材料中残留的青蒿素为0.6%. 为了减少提取液的体积和节省提取时间，生产中可以只收集前1.5 MV提取液，青蒿素的提取率均可达到95%以上.图4 柱层析法提取青蒿素的提取效果Figure 4 Extraction efficiency of artemisinin by the columnchromatographic extraction柱层析法提取的青蒿素，经过减压浓缩回收溶剂，蒸干后得到提取物. 实验所用的植物材料中青蒿素的质量分数为1.85%，经柱层析浓缩后，提取物少量提取实验和放大提取实验中青蒿素的质量分数达22.5%.3 讨论与结论传统的青蒿素提取方法主要是用有机溶剂浸泡或加热回流提取，或同时加超声波、微波辅助提取，通常需要经过多次提取才能达到比较高的提取率. 这些方法存在溶剂用量大、操作复杂、能耗高等问题[17]. 而超临界CO2萃取法的设备成本和提取物生产成本高，在工业上的应用受到限制.本研究用最新开发的柱层析法提取青蒿素，具体工艺流程为：干燥粉碎的黄花蒿植物材料用提取溶剂(V石油醚∶V95%乙醇=2∶8)按m料∶V液=1.0∶3.5的量，湿法装入层析柱中，静置1 h后，用提取溶剂洗脱. 收集前1.5 MV提取液，青蒿素的提取率可达到95%以上. 文中选用的青蒿素提取的溶剂为石油醚与 95% 乙醇组成混合溶剂系统. 该系统可通过 2 种不同极性有机溶剂之间的不同比例，配制从低极性的石油醚到高极性的95%乙醇呈不同极性的混合溶剂. 该提取液可直接或加入少量水后即可使石油醚相与醇水相自动分离，达到不同目标成分的分离；同时，2 种有机溶剂都可以分离回收和重复使用[18]. 此外，柱层析提取法的所有操作都在室温下完成，避免了青蒿素的受热分解，降低了能耗.综上所述：用柱层析提取法提取青蒿素，工艺简单、提取率高、溶剂用量少、节能环保、设备和生产成本低，适合工业上大量制备青蒿素.参考文献：[1] HSU E. 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青蒿素化学结构鉴定的经过
青蒿素化学结构鉴定的经过屠呦呦的小组先后在北京医学院林启寿教授（已故）和中国医学科学院药物研究所梁晓天教授（已故）的指导下，用分离到的青蒿素进行过元素分析、红外光谱、质谱、核磁和部分化学反应的研究，分子中没有氮原子，推测此化合物是一种具有倍半萜结构的新型的抗疟药。
由于研究力量和仪器设备薄弱，难以单独完成全部结构鉴定研究，因此和上海有机化学所协商。
经“上海地区523办公室”协调，由周维善教授主持，吴照华和吴毓林负责，并同意中药所派一人参加。
自1974年2月起，中药所先后派出倪慕云、刘静明和樊菊芬到上海，短时期和有机所的研究小组共同工作。
屠呦呦本人没有参加有机所的研究。
尽管这些工作是在上海有机所进行，但是梁晓天教授也为青蒿素的结构研究做了很多贡献，并通过屠呦呦和她组员的通话，为上海的研究提出参考意见。
1974-1975年在有机所的主持下，研究了青蒿素一系列的化学反应，其中最有价值的四组反应，一是与碘化钠作用生成碘的颜色反应和三苯磷的还原反应证实青蒿素中过氧基团的存在；二是用盐酸羟胺反应和氢氧化钠滴定证明青蒿素有一个内酯基团；三是用NaBH4可将其内酯基还原成半缩醛，而保留过氧基团不变，这个产物开始称其为“还原青蒿素”，在青蒿素的化学结构确定后，才称之为“双氢青蒿素”；四是青蒿素的氢化反应，用钯－碳酸钙催化，生成脱氧青蒿素。
这些化合物为以后的构效关系研究和青蒿素衍生物的制备奠定了基础[刘静明、倪慕云、樊菊芬、屠呦呦（北京中医研究院中药研究所）、吴照华、吴毓林、周维善（中国科学院上海有机化学研究所），青蒿素（Arteann uin）的结构和反应，化学学报1979,37(2):129－143]。
在红外光谱、核磁共振氢谱，质谱、圆二色谱数据和化学反应的基础上，有机所的专家推定出青蒿素的部分结构。
药化-青蒿素
提取
从青蒿中提取青蒿素的方法以萃取原理为基础， 主要有乙醚浸提法和溶剂汽油浸提法。
投料—加水—蒸馏—冷却—油水分离—精油； 非挥发性成分主要采用有机溶剂提取，柱层析
及重结晶分离， 干燥—破碎—浸泡、萃取（反复进行）—浓缩
提取液—粗品—精制。
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青篙素为无色针状结 晶 , 属倍半萜内脂, 熔点为156一157℃， 分子式C15H22O5
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抗疟药
氯喹（choroguine）：
人工合成的4-氨喹啉类衍生物对各种疟原虫的红 细胞内期裂殖体有杀灭作用，可迅速控制症状。也可 用于症状抑制性预防。其特点是疗效高，生效快。对 红细胞外期无效。因其影响DNA复制和RNA转录并致氨 基酸缺乏而抑制疟原虫的分裂繁殖。 常规剂量不良反应少且轻微，大剂量可引起视力 障碍及肝肾损害。
中药按加工工精品艺课件 分为中成药、中药材。
近年来，随着国际中医、针灸事业的不断发展，各 国相继成立了官方或民间的研究机构，开展中医药、针 灸的理论及临床研究，并应用10多种文字，出版了60多 种中医、针灸学术刊物和一些专著。
目前世界上已有120多个国家和地区设立了中医药 机构，全球采用中医药、针灸、推拿治疗疾病的人数， 已占世界总人口的三分之一以上，中医药、针灸的疗效 已得到各国政府及人民的信任和不同程度的支持。
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药学遗产的一项重大科研成果，是在中西医结合科研 领域中的又一重大成就。 为实现中药现代化 , 首先应明确中西医药学的 优势和劣势; 现代科学化中药应保留现有的宏观优 势 , 再获微观优势 ,从而确定现代科学化中药的标 志。 现代科学化中药不等于由现有中药而研制的具现 代科学内容的新西药。只有现代科学化中药才可能使 中药走向世界 , 当前着力点应在中药先走遍中国 , 在中国占主导地位。从现有中药而得现代科学化中药 固然为途径之一 , 但实现起来艰难 , 而西药中药化 则为得现代科学化中药的另一途径 , 且可能为捷径。 总之 , 明确前提 , 分清误识 ,中药现代科学化才能 早日实现。
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2.末端吸收[14]
色谱条件： 色谱柱Kromasil ODSC18(416mm ×250mm, 5 μm); 流动相为乙腈-水 ( 60：40); 流速为 1.0mL/min; 检测 波长为203nm; 柱 温30℃。理论塔 板数2000.
1.2.4 LC-MS-MS
体内药物分析是测定体液(主要是血浆、血清或全血)中药物或其他代 谢物浓度。由于血液样ห้องสมุดไป่ตู้试样提供量少，基质复杂，在此混合物中分 析某种微量成分(通常为(g/mL或ng/mL水平)并加以鉴别，常常是对分 析化学家的挑战。 LC-MS虽然有足够的灵敏度，但遇到LC难以分离的组分，其应用受到 限制。使用LC-MS／MS可以克服背景干扰，通过MS／MS的选择反 应控制模式(SRM)或多反应检测模式(SRM)，提高信噪比，因此对复 杂样品仍可达到很高的灵敏度。 药物的是用来预防、诊断及治疗疾病的一类特殊物质，与人们的健康 和生命安危有极其密切的关系，杂质检查及其限度控制是保证药品质 量的一个重要方面。使用LC-MS／MS可以简便地对药物中杂质加以 监控.
1.青蒿素标准品0.1g+95%稀释成0.001%的标准品溶液
2.0.001%标准溶液0.5 ml加入95% 乙醇4.5ml, 再加入 0.2% NaOH 20ml定容至25ml, 50℃水浴加热30min, 取 出快速冷却。
3.分别取0.5、1.0、2.0ml 的.001%青蒿素标准溶液, 分别加入95% 乙醇4.5、4.0、3.0ml, 再各加入0.2% NaOH 20ml定容至25ml, 配成 浓度分别为2×10- 5%、4×10- 5%、8×10- 5%的标准溶液, 50℃ 水浴加热30min, 取出快速冷却, 在已经确立的最适波长下分别测吸 光度。
HPLC chromatograms of reference (A, B) and the extract from Herba Artemisiae Annuae (C, D).A, C: UV； B, D: ELSD; 1: Arteannuin B; 2: Artemisinin; 3: Artemisinic acid
为什么要测定青蒿素的含量
不同产地的青蒿药材中青篙素的含量差异较大，而青蒿 素是青篙截疟的主要有效成分，因此对药材中青篙素含 量的准确测定十分必要。
提取青蒿素的溶剂：
青蒿素C15H22O5 在丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷或苯中易 溶, 在甲醇、乙醇、稀乙醇、乙醚及石油醚中溶解, 在水中 几乎不溶解; 在冰醋酸中易溶。
1.3.2 HPLC-UV-ELSD
同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法 青蒿素只有很弱的末端紫外吸收,一般不用UV法进行精确 定量分析,故选择用ELSD法检测。用ELSD法也可检测青蒿 乙素和青蒿酸,但由于其灵敏度低,对这两个成分含量低的青 蒿药材来说,该法同时测定3种成分较困难,故采用灵敏度较 高的UV法对青蒿乙素和青蒿酸进行定量测定。UV检测器 对所测成分性质无任何影响, 据此可使用HPLC-UV-ELSD 同时测定青蒿中3种成分。
双氢青蒿素 dihydroartemisinin
TLC 紫外分光光度法 IR、MS、NMR
定性分析
HPLC (UV、ELSD、SPD...) UPLC LC-MS/LC-MS-MS 高效毛细管电泳 CE
定量分析
1.1 青蒿素的IR定性分析
双氢青蒿素dihydroartemisinin
3376 O-H;1227 C-O ; 1025 C-O-C;2925 -CH3; 总结：IR专属性强，一般做标准谱图对照法
例：复方双氢青篙素片（含双氢青篙素32 m g , 磷酸呱哇 0.32g , 甲氧苄啶90 m g )中青蒿素含量的测定 1.对照品溶液:精密称取D H A 对照品适量, 置50 m L 量瓶 中, 加乙睛适量,40 ℃ 超声处理5 min。放冷至室温, 定容, 即得1.28 m g/m L的对照品储备液。再精密量取此储备液 适量, 用水稀释制成256 mg/m L的对照品溶液。 2.对照品溶液:取复方双氢青篙素片10 片, 剥去薄膜衣, 精 密称定, 研细, 精密称取适量, 置25 m L量瓶中, 加乙睛适量, 40 ℃ 超声处理5 min。放冷至室温, 定容。摇匀, 滤过, 取 续滤液2 mL 加水稀释至10 mL。
4.样液的制备 取青蒿待测样品研细粉末0.5g, 加入95%乙醇10ml 浸泡, 50℃水浴 加热60min 进行提取, 取出样品振摇、冷却、过滤, 取滤液1ml, 加入 95%乙醇14ml, 再加入0.2% NaOH 10ml, 配制成青蒿素样品溶 液,50℃水浴加热30min。在已经确立的最适波长下分别测吸光度,对 浓度作图, 建立标准曲线。
1.3 HPLC法
原理：利用流动相与组分间的亲和力，通过组分、流动相 和固定相三者间的相互作用来实现分离。
常见检测器: 1. UV 2. DAD（二极管阵列检测器） 3. FD（荧光检测器） 4. RID(示差折光率检测器) 5. ECD(电化学检测器) 6. ELSD（蒸发光散射器检测器）
文献报道同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙 素、青蒿酸的方法有HPLC-UV-ECD法（高 效液相色谱紫外电化学检测法）、HPLCMS/MS法,采用ELSD法（蒸发光散射检测 法）检测仅有很弱紫外吸收的青蒿素、UV 法检测青蒿中含量较低的青蒿乙素和青蒿 酸。
1.3.1 HPLC-ELSD法
蒸发光散射检测器(ELSD) 为通用型的质量检测器, 对结构相似物质可给出几乎相同的响应因子,响应 值大小取决于物质浓度及检测条件下物质颗粒的 大小, 而不依赖于紫外吸收, 因此适合于青蒿素及 双氢青蒿素的含量测定。
例：HPLC-ELSD 法测定复方双氢青篙素片中双 氢青篙素的含量
ELSD检测器检测时少量溶解的甲氧苄啶峰及a异构体峰与β异构体峰 均能达到完全分离, 三者的分离度分别为2、8 和4, a异构体与β异构 体保留时间分别约为5 . 7 m in和7 m in , 理论板数按a异构体或β异 构体峰计均不低于6000。SPD扫描图谱显示最先流出的成分为甲氧 苄啶, 与后面的a异构体及β异构体完全分离, 不影响测定。
青蒿素分析方法的确定
主讲人：丁晨
青蒿
青篙为菊科一年生草本植物黄 花篙干燥地上部分，性寒，味苦、 辛，归肝胆经，可清热解暑、除 蒸、截疟，主要分布于重庆、四 川、云南、广西等地。目前青篙 素系列药物已取代奎宁成为治疗 疟疾的最安全有效的药物。青蒿 素是青蒿抗疟的有效成分，也是 合成青蒿素系列药物的起始原料， 它的需求量很大。
朗伯比尔定律：A=-lgT=εbc
b，ε一定，吸光度A和溶液浓度c成正比
∴青蒿素含量=( 青蒿素样品浓度×标准浓度单位×原始 体积) / 青蒿研细粉末质量
UV法总结
UV法测定青蒿素是依据青蒿素在碱性条件下生成的青蒿 素衍生物 Q292在292 nm波长处有较强的紫外吸收来定量 的，其优点是操作简单，对仪器设备的要求不高，其缺点 是不能排除青蒿素类似物等物质的干扰。因此，UV法测 定青蒿中青蒿素的含量实际反映的是药材中青蒿素及其类 似物的总量。陈靖等[5]报道，青蒿中青蒿素类似物青蒿 酸、青蒿素B、3α-羟基-1-去氧青蒿素的平均含量分别为 0.47％ 、0.05％、0.005％，对青蒿中青蒿素含量的测定 影响较大，使得测定结果偏高。
1.衍生化法[13]：
色谱条件：色谱柱: LichrospherC18 ( 4. 6mm×250mm, 5 Lm) ; 流动 相: 甲醇-缓冲液(体积比50：50; 0. 01mo l/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲 液) ; 流速: 0. 8mL /m in; 柱温: 30 e ; 灵敏度: 2. 000 AUFS; 检测波长: 260 nm; 进样量: 20μL。
高液相色谱-质谱联用法测定人血浆双氢 青蒿素浓度[24]
分析条件
色谱条件 色谱柱为RESTEK Pinnacle C18 柱(150 mm ×2. 1 mm , 5μm) ; 流动相为甲醇-水-10 mmol/L乙酸胺( 80: 10 :10 ) ; 流速 200μl/min ;柱温:室温。 质谱条件 电喷雾ESI 源; 喷雾电压IS 为4 000 V;雾化温度400 ℃; 雾 化气NEB ( GAS1) 为12 L· - 1 ;加热辅助气AUX( GAS2) 为7 min L/min ;帘气CUR 为6 L· - 1 ;碰撞气CAD 3L· - 1 ;检测方式为正 min min 离子多离子反应监测(MRM) ,用于定量分析的离子分别为m/z 302. 3 →m/z 163. 3 (DHA) 和m/z 300. 2 →m/z 209. 3(内标ART)
1.2紫外分光光度法
原理：
1.由于青蒿素药物分子结构中母核不具有共轭体系，其紫 外吸收光谱的主要是末端吸收。但C-10位由于取代基不同 具有一定的吸收特征。 2.青蒿素由于具有过氧桥和缩醛结构, 对酸碱不稳定, 对 强碱极不稳定, 热至熔点以上即迅速分解。采用0.2%氢氧 化钠50℃水浴加热30min 进行水解, 水解后的波长扫描结 果显示青蒿素在紫外区有最大吸收峰Kmax=290.5nm, 由 此确定最适波长为292nm。（青蒿素衍生化，酸化后亦可作 HPLC-UV检测）
在选定的检测条件下,DHA 和内标ART 生成的基峰离子 为其加NH4+ 离子[M +NH3 ] + ,将其基峰离子作为母离子进 行产物离子扫描分析,得到二者的全扫描及子离子扫描图。