western blotting 注意事项
免疫印迹实验注意事项
免疫印迹实验注意事项一、实验概述免疫印迹（Western blot）是一种重要的蛋白质检测技术，在生物医学研究中被广泛应用。
该实验通过将蛋白质样品经电泳分离，并将其转移到膜上，最终使用特异性抗体探测目标蛋白质。
然而，为了确保实验结果的准确性和可靠性，实验过程中需要注意以下事项。
二、实验仪器和试剂准备在进行免疫印迹实验之前，需要准备合适的仪器和试剂。
以下是一些注意事项：1. 仪器准备•确保电泳仪、转印仪和成像仪等仪器的功能正常，并进行必要的校准和测试。
•清洁仪器，避免污染和干扰实验结果。
2. 试剂准备•使用优质的试剂，并根据说明书正确配制试剂溶液。
•为避免批次差异，建议每次实验使用同一批试剂。
•试剂保存在适当的温度和条件下，以保证其稳定性。
3. 溶液准备•使用无菌、纯净的水和试剂配制实验所需的溶液。
•确保溶液的 pH 值正确，并进行必要的调整。
•溶液保存在适当的温度和条件下，避免污染和变质。
三、实验操作注意事项在进行免疫印迹实验时，需要注意以下操作事项：1. 样品处理•样品的制备和处理应严格按照实验要求进行，以确保样品的完整性和稳定性。
•样品处理过程中应尽量避免使用可能影响蛋白质结构和功能的试剂和条件。
2. 蛋白质的电泳分离•样品电泳前，必须对电泳胶进行适当的处理和准备，确保其质量和性能。
•样品电泳条件的选择要考虑样品性质和目标蛋白质的分子量等因素。
•电泳过程中，要严格控制电流和电压，避免产生异常结果。
3. 转膜过程•使用合适的滤纸和膜材料，并按照正确的方法和条件进行转膜操作。
•转膜时间和电压的选择要根据蛋白质的分子量和转膜效率进行调整。
4. 抗体探测和成像•使用具有较高亲和力和特异性的抗体进行探测，以提高结果的准确性和可靠性。
•抗体的浓度和反应时间应根据需要进行调整，避免产生过度或不足的信号。
•成像过程中，要确保暗室环境的光线充足、胶片或成像仪的参数设置正确。
5. 数据分析和结果解读•在进行数据分析和结果解读时，应使用合适的软件和方法，确保结果的准确性和可靠性。
WesternBlot（步骤简略,但注意事项经验总结基本原理很全面）
Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面）1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL 调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用T ris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH 太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gT ris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。
Western Blotting操作指南
Western Blot 操作指导一：蛋白提取1、组织蛋白提取1）所需器材：制冰机、标记笔、两套1.5ml EP管（最好高温高压处理）、一个大冰盒、一个1.5ml EP管盒、手套、眼科剪（最好高温高压处理）、新鲜组织或保存于-80℃冰箱组织、保存于4℃冰箱的PBS（最好高温高压处理）、移液枪、吸头（最好高温高压处理）、两套研磨棒（最好高温高压处理）、掌上离心机、滤纸、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一种蛋白酶抑制剂，剧毒）、离心机、烧杯、2×SDS凝胶上样缓冲液、二硫苏糖醇（DTT）、震荡器、泡沫板。
2）操作步骤：a.制冰机制冰；b.标记笔将两套EP管做好标记；c.将大冰盒、EP管盒装上冰，一套标记笔做好标记的EP管放置于大冰盒中，另一套标记笔做好标记的EP管放置于EP管盒中，戴好手套，带上EP管盒、眼科剪剪取黄豆大小（约100mg）新鲜组织或保存于-80℃冰箱组织；d.取出保存于4℃冰箱的PBS，往EP管中滴加1ml PBS，眼科剪剪碎组织（动作快），掌上离心，弃上清，再往EP管中滴加1ml PBS，研磨棒研磨，3000转离心10分钟，弃上清，滤纸尽可能吸干管口残留液体，估算EP管中沉淀物体积，以上步骤尽可能在冰上操作；e.从4℃冰箱取出三去污裂解液，-20℃冰箱中取出PMSF置于大冰盒中，往EP管中滴加沉淀物3-5倍体积的三去污裂解液（一般为5倍）,再加入PMSF （二者比例为94：6）,研磨棒研磨（冰上充分裂解20-30分钟），以上步骤均需在进行；f.离心机预冷，将充分裂解后的组织液4 ℃、10000转离心10分钟；g.将烧杯用自来水洗净，倒入单蒸水，电炉上煮沸；h.备好2×SDS凝胶加样缓冲液（存放于常温），取出保存于-20℃冰箱的DTT,置于大冰盒中，将离心后的上清液用移液枪定量吸至另一套EP管中（勿吸掌上离心，然后小心将EP管插入泡沫板，投入已煮沸的烧杯中煮6-8分钟（电炉功率不要调太大，以免管盖爆开）；i. 将泡沫板用镊子取出，置大冰盒中冷却10分钟，掌上离心，再放入-20℃冰箱保存备用。
Westernblot实验步骤及注意事项_WesternBlotting_易生物
Westernblot实验步骤及注意事项_WesternBlotting_易⽣物Western blot实验步骤及注意事项2009-05-25 23:46:38来源：易⽣物浏览次数：0 ⽹友评论 0条关键词：Westernblot⼀.实验步骤1. 组织块称重2. 利⽤液氮、研钵粉碎组织块3. 加⼊RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30µl，10 mg/ml PMSF），利⽤Polytron进⼀步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加⼊PMSF（每克组织30µl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移⼊离⼼管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进⾏Bradford⽐⾊法测定蛋⽩质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋⽩质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸⽔浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜⽤丽春红染⾊，胶⽤考马斯亮蓝染⾊14. Westernblot 试剂盒显⾊15. 分析⽐较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋⽩质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，⽤5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的⽓泡。
2）在凝胶/滤膜外再包⼀张3mm滤纸（预先⽤转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有⽓泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照⼚家建议⽅法放⼊电泳装置中，凝胶⾯向阴极。
4）将上述装置放⼊缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照⼚家所⽰接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基⿊中快速染⾊，直⾄分⼦量标准显现时取出，记录下标准位置。
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告一、实验目的免疫印迹（Western blotting）是一种广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫学等领域的技术，用于检测和定量特定蛋白质在样品中的表达水平。
本次实验的目的是通过免疫印迹技术检测目标蛋白在不同样品中的表达情况，以验证实验假设并为进一步的研究提供数据支持。
二、实验原理免疫印迹实验基于抗原抗体特异性结合的原理。
首先，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质样品按照分子量大小分离。
然后，将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上。
接着，膜与特异性抗体进行孵育，使抗体与目标蛋白结合。
最后，通过检测抗体的存在来确定目标蛋白的表达水平。
检测抗体的方法通常包括使用酶标记的二抗结合底物产生显色或发光信号，或者使用荧光标记的二抗通过荧光检测系统进行检测。
三、实验材料和设备1、材料细胞裂解液蛋白酶抑制剂蛋白标准品一抗（特异性针对目标蛋白）二抗（酶标记或荧光标记）化学发光底物（或荧光检测试剂）预染蛋白分子量标准硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜电泳缓冲液转膜缓冲液封闭液（如脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶液）洗涤液（含吐温 20 的磷酸盐缓冲液）2、设备电泳仪和电泳槽转膜装置摇床冰箱酶标仪（或荧光检测仪器）四、实验步骤1、蛋白样品制备收集细胞或组织样本，加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解一定时间。
离心收集上清液，即为蛋白样品。
2、 SDSPAGE 电泳制备 SDSPAGE 凝胶，根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度。
将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性。
上样，进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。
3、转膜电泳结束后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中平衡。
按照“三明治”结构组装转膜装置，依次为阴极、滤纸、凝胶、膜、滤纸、阳极。
在冰浴或冷室中进行转膜，根据蛋白分子量和转膜条件确定转膜时间。
4、封闭转膜结束后，将膜放入封闭液中，在摇床上孵育一定时间，以封闭非特异性结合位点。
WesternBlot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查
WesternBlot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查Western Blot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查第一部分 WB操作中需要注意事项一、蛋白样品的准备1、样品质量所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。
这会直接影响到样品浓缩的效果。
此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。
2、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB一般5×106就足够3、小分子量蛋白10KD需要的注意点1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE 体系2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可4、大分子量蛋白200KD需要的注意点1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高二、制胶1、凝胶质量不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。
因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。
2、在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下三、加样1、点样样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
Western blot检测蛋白质的表达实验的结论通常包括以下几个方面：
1. 蛋白质的表达水平：通过比较目标蛋白质与内参蛋白质的信号强度，可以得出目标蛋白质在样本中的表达水平。
2. 蛋白质的分子量：通过比较标准蛋白的分子量和目标蛋白质的分子量，可以确定目标蛋白质的分子量。
3. 蛋白质的特异性：通过比较阳性对照和阴性对照的信号强度，可以确定目标蛋白质的特异性。
在Western blot检测蛋白质的表达实验中，需要注意以下事项：
1. 样本制备：确保样本的质量和数量，避免样本降解或污染。
2. 抗体选择：选择特异性好、灵敏度高的抗体，避免出现非特异性反应。
3. 实验条件：保持实验条件的稳定和一致性，避免影响实验结果的可重复性。
4. 数据分析：对实验数据进行准确的分析和解释，避免误导实验结果。
总之，Western blot检测蛋白质的表达实验是一种常用的生物化学技术，可以用于研究蛋白质的表达、功能和相互作用等方面。
在实
验中需要注意细节和规范操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
1. 引言1.1 概述Western blot技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测、定量和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达和相互作用。
它具有高灵敏度、高特异性和较为准确的测量能力，因此在医学科研领域中得到广泛应用。
1.2 文章结构本文将详细介绍Western blot技术的原理、方法、注意事项以及在医学科研中的应用。
首先，我们将阐述免疫检测原理、蛋白质分离与转移原理以及免疫染色与检测原理，帮助读者全面了解该技术的基本原理。
其次，我们将描述样品制备与电泳条件设置、蛋白质转移与固定方法以及免疫染色及可视化方法，为读者提供详细的实验步骤。
随后，我们将介绍实验室操作要求及安全措施、样品处理和保存注意事项以及技术参数调整和结果解读注意事项，以保证实验的准确性和可重复性。
最后，在医学科研领域中的应用方面，我们将以蛋白质表达水平检测、蛋白质亚细胞定位分析以及蛋白质相互作用和功能分析为例，展示Western blot技术在疾病诊断和药物研发等方面的重要应用。
1.3 目的本文的目的是为读者提供对Western blot技术全面了解，并指导其在医学科研中正确应用该技术。
通过详细介绍该技术的原理、方法和注意事项，读者将能够准确地进行实验操作并正确解读结果，同时也能够认识到其在医学科研中的重要性和广泛应用价值。
2. Western blot技术原理2.1 免疫检测原理Western blot技术是一种常用于检测特定蛋白质的免疫学方法。
它基于抗原与抗体的特异性结合关系，通过将蛋白质溶液经过电泳分离、转移到固体载体上，并使用特异性抗体识别目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质的定性和定量检测。
在Western blot中，首先需要将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。
然后，通过将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶或其他固体载体上，在固相载体上形成一个被称为“Western blotting”的蛋白质模式。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
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Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP（辣根过氧化酶）标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到H RP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后40C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1 mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后40C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH太低时，聚合反应受到抑制。
10%(w/v)过硫酸胺溶液。
提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6、 SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12. 8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。
临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
9、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。
使用后应予以废弃。
10、脱脂奶粉5%(w/v)。
11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、过氧化物酶标记的第二抗体。
15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、 100mmol/L NaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
四、主要步骤五、实验常见的问题指南根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：2. 针对样品的常见问题C. 细胞水平要做Western Blot，多少细胞提的蛋白够Western Blot？解答：一般地5* 106就足够了。
D. 同一样品能同时提RNA又提蛋白吗，这样对Western Blot有无影响?解答：能，没有问题，我们做过。
E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－1 0％甲醇。
H. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6％，Stacking Gel 3.5％。
I. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。
一般地，超载30％是不会有问题的。
如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的comb。
J. 蛋白变性后可以存放多久？解答：－80℃，一两年没有问题。
最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
K. 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
L. 接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．M. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？解答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。
开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。
要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。
所以拿到好的结果不容易。
N. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。
还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ（抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；）和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。
如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。
1. PMSF剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。
为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。
凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。
2. PMSF在水溶液中不稳定。
应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。
3. PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。
pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。
PMSF 的储存：2-8℃可以存放数月之久。
欲长期保存，可冻存在-20℃ 。
O. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
P. 有什么方法可以提高上样量？解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。
Q. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了。
如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。
42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
R. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过0.3μg/mm2。