Western blot 实验技巧精要
WesternBlot（步骤简略,但注意事项经验总结基本原理很全面）
Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面）1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL 调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用T ris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH 太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gT ris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。
westernblot精华
纯净水（ddH2O）
聚丙烯酰胺
（Arc-Bis） SDS
凝胶成份
Tris-HCL
四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯
酰胺的聚合）
过硫酸铵(APS)（提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基）
常用凝胶配臵比例
分离胶（12%） 浓缩胶（4%）
待瘤长至一定重量，处死裸鼠 称重，拍照 取出肿瘤 称重，拍照 保存于福尔马林中 液氮中冻存5min
保存于-80℃冰箱
MTT法筛选活性药物
取96孔板，每孔加100ul培养基
细胞悬液计数
每孔加约3000个细胞 孵育24h
加药
倍比稀释 法配药
加药
孵育72h
加MTT
570nm
ddH2O Arc-Bis
Tri-HCl 10%-SDS
4.95ml 6ml
3.75ml（PH=8.8） 150ul
3.05ml 0.67ml
1.25ml（PH=6.8） 50ul
10%-APS
TEMED
150ul
15ul
50ul
10ul
检漏 配分离胶，加水液封30min 待胶凝后，弃水，配积层胶，插梳子 胶凝后，加阴极液，拔梳子 上样（蛋白样品各10ml,Mark为2ml） 加阳极液，电泳
一抗、二抗孵育
封一抗，4 ℃时过夜。 加入二抗溶液，摇床上缓慢摇动2h PBST洗膜2次，每次10min，PBS洗膜10min。
用底物发光法：将两种显色底物1：1等体 积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用 保鲜膜把膜包起来，马上在暗室中将X光片 覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡 量），显影、定影。 注意：发光法检测的时候曝光时间要恰到 好处，过短会导致曝光不彻底， 影响条带亮度，过长会导致荧光信 号衰弱，也会使背景颜色加深。
western blot实验技术要点
03
膜的保存
TBST浸泡、4℃ 可保存1-3天
常见问题与原因分析
背景不干净
A
杂带太多 F
B 条带不均一
条带不完整 E
C 条带模糊不清
D
条带歪斜
T 谢谢观看 HANK YOU!
Western blot（WB）实验技术要点
太和医院检验部
WB操作流程
样品处理
A
转印与封闭
C
蛋白检测
E
B
SDS-PAGE电泳
D
抗体孵育
失败！
理想的WB图片
1
2
3
背景干净 条带清晰
条带均一 间距相同
内参一致 差异突出
01 Part One 蛋白处理要点
蛋白处理至关重要
蛋白酶抑制剂
01
防
降
02
占据蛋白未结合位点 TBST溶解脱脂牛奶或BSA
室温1h或4℃过夜
04 Part Four
抗体孵育
抗体孵育
抗体稀释
孵育条件
注意事项
脱脂牛奶 BSA
抗体稀释液
室温1-2h
或 4℃过夜
抗体比例 充分洗涤 摇床速度
05 Part Five 蛋白检测
蛋白检测
01
显影剂孵育
均匀、快速滴加
02
曝光时间
避免过度曝光
分离蛋白范围 >150KD
100-150KD 60-100KD 20-60KD
<20KD
两个目的蛋白分子量相差较小，可以适当降低胶浓度
03 Part Three 蛋白转印与封闭
转印技术要点
膜与滤纸要干净、保持湿润
A
发热问题 F
Western blot实验技术全攻略!附详细操作步骤
随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。
本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。
Western blot实验技术全攻略第一步：制备样品Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。
一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。
提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。
第二步：电泳分离蛋白质将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。
电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。
SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。
非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。
第三步：转移蛋白质将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。
转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。
湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。
第四步：阻断和孵育将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。
然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。
第五步：检测和成像将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。
二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
下面是Western blot实验的详细操作步骤：1. 蛋白质提取：将待测样品（如细胞、组织等）进行裂解，以获得蛋白质样品。
2. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行电泳分离，以分离不同大小的蛋白质。
Western Blot 实验技术操作及注意事项,实验准备,样品制备,实验技巧
常用的转移膜主要有PVDF膜( Polyvinylidene-
Fluoride)和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白质的结
合能力高,灵敏度高,不易破碎,同时也适用于再次标记
(PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中以增加膜的亲水性)。
✓其他注意事项
而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。
1. 从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤
✓膜标记正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用
有色分子量 Marker或转膜后在膜上稍微剪断一个角(可 自由决定剪断方向),会有利于判断膜的方向。 ✓其他注意事项 1. 封闭时间不宜过长，封闭时间过长会抑制抗原抗体
反应及标记抗体的酶活性。 2. 注意避免让膜变干。
4.一抗反应
✓一抗的选择 抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别
1 × TBST缓冲液配制：TBS粉末，溶于2L蒸馏水中，再加入2mL TWEEN - 20。
9. Western Blot实用小技巧
9. Western Blot实用小技巧
谢谢大家
组织取绿豆粒大小（30~50 mg ）组织，加入预冷的RIPA裂解液，按照质量 体积比1：10 比例加入RIPA 裂解液（PMSF和PIC 1:100 v/v ）。然后予以组织匀 浆机处理，全程在冰上操作。匀浆结束后，将所有样本静置于冰上30 min，
上述裂解液离心，4 ℃ 12 000 rpm 离心 20 min 收集上清（即蛋白原液），避 免吸到沉淀。吸取10uL蛋白用于定量，剩余蛋白加入5 x loading buffer 进行充分 混匀（5 loading buffer和蛋白组织液比1:4），在98 ℃条件下加热10 min，然后进 行分装后保存于-20 ℃冰箱中。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
western blot实验技术要点
分离蛋白范围 >150KD
100-150KD 60-100KD 20-60KD
<20KD
两个目的蛋白分子量相差较小，可以适当降低胶浓度
03 Part Three 蛋白转印与封闭
转印技术要点
膜与滤纸要干净、保持湿润
A
发热问题 F
E
转印时间控制
凝胶不能扭曲
B
C 正负极方向问题
D
气泡问题
封闭
封闭目的 封闭试剂 封闭条件
02 Part Two SDS-PAGE电泳
基本原理
低
高
电
电
压
压
A 浓缩
B 分离
低浓度胶
高浓度胶
A
电荷 量
B
分子 量
电泳技术要点
蛋白分子量
选择合适浓 度的分离胶
样品混匀 浓缩胶足够 目的带之间分开
上样要求 浓缩与分离
试剂的纯度 缓冲液 气泡
影响电泳的 因素
胶浓度的选择
凝胶浓度 6% 8% 10% 12% 15%
03
膜的保存
TBST浸泡、4℃ 可保存1-3天
常见问题与原因分析
背景不干净
A
杂带太多 F
B 条带不均一
条带不完整 E
C 条带模糊不清
D
条带歪斜
T 谢谢观看 HANK YOU!
低温、快速操作
解
避免反复冻融
03
蛋白处理至关重要
保证浓度足够高
01
调
（细胞、裂解液的量）
浓
02
浓度测量要准
（混匀、稀释、复孔）
度
浓度调一致
03
最佳上样量经验总结
1.5mm玻璃板、10孔梳子，上样量：15-25μl 1.0mm玻璃板、10孔梳子，上样量：10-20μl 上样尽可能不超出每孔总体积的一半 内参10ug左右，即可清晰显出
Western Blot 实验步骤及注意事项
Western Blot 实验步骤及注意事项western blot的实验步骤及注意事项一、实验步骤1.缓冲液配制(1) Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS（可不加）, 200ml Methanol（临用前加）,ddH2O to 1L(2)10×TBS: 1 M Tris・HCl（pH 7.5）100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L (3)TBST: 1×TBS中加入1/1000的Tween (4)封闭液：脱脂奶粉5%(w/v),用TBST配制 2. SDS-PAGE电泳电压：积层胶电泳电压80V左右，分离胶电泳电压110V~120V 3.免疫印迹(1) SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳结束后，将胶放至转移缓冲液中浸泡15m in，切6张Whatman 3mm滤纸和1张PVDF膜，与凝胶大小相符合。
将PVDF膜事先用甲醇浸泡，再用转移缓冲液浸泡。
(2) 将凝胶及PVDF膜以“三明治”状(即3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸)逐层铺于转印仪上，凝胶一面连接阴极，100 V转移40 min（根据转移蛋白的分子量确定转移时间）。
(3) 将膜放入小盒中，加入5 mL封闭液，摇床上温育1 h。
(4) 以1/1000的比例，加入5 μL第一抗体，4 ℃温育过夜。
(5) TBST溶液洗膜10 min，轻倒，重复3次。
(6)加入 5 mL TBST溶液，以1/2000的比例，加入2.5 μL第二抗体，温育1 h。
(7) TBST溶液洗膜5min，轻倒，重复3次。
(8)加入2 mL显色底物温育3 min，将薄膜封入保鲜袋中，压平，尽可能不留空气，滤纸吸干显色底物。
放入夹板中。
(9)配制显影液和定影液。
暗室操作：将X光片放入夹板中，曝光5 s（根据荧光强度确定），然后放入显影液中，至出现明显的条带取出，水洗后放入定影液中，定影一段时间，取出用水冲洗干净。
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Western blot 实验技巧精要
Western blot 方法在SCI 文章中出现的频率非常高，漂亮的WB 电泳图可以给文章增色不少。
但是WB 实验的步骤琐碎，细节颇多，要想得到令人满意的结果还是需要花费很多时间和精力去摸索实验技巧的。
一、样品准备部分
我们不应该太过重视WB 电泳部分的操作技巧，样品准备才是整个WB 实验中最重要的一个环节（没有之一）。
否则WB 电泳技术再高也无法得到好的结果。
小编认为以下3 点值得大家重点关注：
1. 注意孵育、终止时间
如果想得到漂亮的梯度条带，无论是不同处理时间的样品，还是不同给药浓度的样品，在处理过程中都一定要严格按照设计的时间来孵育和终止，尤其是对于磷酸化蛋白，哪怕1 秒也不要提前或耽搁。
2. 抑制蛋白降解
这是样品制备中最需要注意的部分。
抑制样品蛋白降解的方法主要有两种：
(1) 使用蛋白酶抑制剂
罗氏公司（Roche）的蛋白酶抑制剂Cocktail 片剂，效果不错。
再与PMSF 共同使用，可以很好地抑制蛋白降解。
(2) 全程低温操作
提前预冷PBS、裂解液甚至枪头等，从收集细胞开始一直到煮样的全过程都应该尽可能的保持在冰上操作。
除了使用冰盒，大多数操作都是在4℃冷房中进行的，虽然有点麻烦和辛苦，但是效果非常好。
3. 裂解液用量
将收集好的细胞加入裂解液进行裂解在操作上是非常简单的，所以这一步的重要性很容易被大家忽视。
裂解液的用量直接决定了细胞裂解程度以及裂解后的蛋白浓度。
如果加入的裂解液不足，蛋白浓度太高，会造成与上样缓冲液反应不充分，电泳后会出现多条条带，条带形状也不好。
做磷酸化蛋白检测时为了在每个胶孔中尽可能多上样，所以用体积较少的裂解液制备了浓度很高的蛋白，结果就得不偿失了（见下图）。
这种情况的补救方法是给样品继续补加上样缓冲液，煮样，再跑胶。
直接给已经煮过样的样品补加上样缓冲液再煮样，跑胶后的效果也会好很多（见下图）。
如果加入的裂解液过多，蛋白浓度太低，会导致在胶孔中的上样量不足，条带不清晰。
那么加入多少体积的裂解液最好呢？小编认为，加入细胞团体积的10 倍体积的裂解液是一个比较好配比，当然也可以根据目标蛋白进行调整。
二、WB 电泳部分
得到了高质量的样品就已经很接近成功了，小编接下来为大家介绍一些WB电泳部分的注意事项。
1. 制胶
如果自己配置母液，就请注意pH 值。
制胶部分最重要的是在配浓缩胶前不要着急将分离胶上面的水弃掉，先配好浓缩胶，在加TEMED 之前再弃掉水。
小编虽然没有亲自试过，但是如果弃掉水后5 分钟之内还没有加上浓缩胶，这块胶最好还是不要用了。
2. 上样
小编的经验是上样的总蛋白量一般是20-70ug，这个要根据检测蛋白的含量而定，需要摸索。
计算后每个样品的上样体积如果比较小，用枪头直接上样是完全可以的，如果上样量超过20ul，最好还是用微量注射器来上样。
上样确实是需要多多练习和体会的，上样技术高可以多上10ul 样品而不溢出。
如果需要上样的体积太大，也可以先上一部分，然后跑几分钟电泳，再停下来继续上样，这是完全可以的，经过下一步的调整，是不会影响效果的。
3. 电泳
每个孔的上样量参差不齐没关系，在样品还没有达到分离胶时用≤60V 的电压可以很好的将样品排列整齐，不容易跑出弧线或者不齐的线。
当样品达到分离胶后，通常会改成100V 继续电泳，小编认为如果时间充足，电压低一点效果不错。
注意：电压改一次就好，不要多次调整。
4. 转膜
转膜环节最重要的，也是最容易被大家忽视的一步是：预冷电转液。
大家一定感觉到过，电转液加入甲醇后温度会迅速上升，所以建议跑上电泳就配电转液，加入甲醇后放入4℃冰箱预冷。
当然，也不要忘了赶气泡，赶气泡时方向不要太随意，也不要太用力，否则可能会使胶变形，尤其是边缘部分，然后你的条带就会……比较有艺术感了……（见下图）
最后别忘了膜需要先在甲醇中浸泡一下，然后在电转液中洗一洗再使用。
5. 封闭、一抗、二抗
很多WB 技巧介绍都会根据曝光后的电泳图的效果指出需要降低或提高一抗的稀释倍数，延长或减少二抗孵育时间等等。
只要按照说明书上推荐的比例做就没有问题。
出现各种条带不好的情况，更大的可能是前面步骤中出现了问题，而不是这一步。
如果是用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，建议大家在放入膜后，将杂交袋中的TBS-T 赶出来，然后再加入一抗或二抗，这样一抗和二抗就不会被膜上残留的TBS-T 稀释了。
6. 曝光
当电泳图上的条带不够好时，曝光相关参数也是经常被认为是需要调整的部分。
曝光不是关键的步骤，前面做好了，曝光是很简单的。
小编用的是ECL 发光液曝光法。
这种方法最需要注意的就是ECL 要在条带上分布均匀。
小编用的是普通自封袋，将膜放在一片自封袋上，加上发光液后，再盖上一片自封袋，用手指赶一下，发光液就会比较均匀，效果不错。