western-blot实验方法
western-blot实验步骤
Western bolt一、实验目的通过实验了解western blot技术的原理和操作。
二、实验原理SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。
NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。
第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。
第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。
化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。
显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。
二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。
三、实验器材1.电泳槽，胶板架子2.转膜仪3.NC膜4.电泳电源5.滤纸6.摇床7.X射线摄影暗匣8.X射线胶片9.塑料薄膜四、实验试剂1.runningbuffer5xrunningbuffer(1L)Tris 15.1gGlycine 94.0gSDS 5.0gddH2O 定容至1L使用前稀释5倍2.Transfer buffer10×Transfer buffer(1L)Tris 30.3gGlycine 144.0gddH2O 定容至1L使用前稀释10倍，加入1/4体积的甲醇3.TBS10×TBS(500mL)Tris 12.1gNacl 40.0gddH2O 定容至500mL用HCl调节溶液的pH值至7.64.TBST(1L)1×TBS:Tween-20=1000:1ddH2O定容至1L5.5%的脱脂奶粉溶液(50ml)脱脂奶粉 2.5gTBST 定容至50ml6.一抗溶液7.二抗溶液8.显影液现配现用，溶液A：溶液B=1:1配置。
Western Blot实验指导教程
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot，WB）一、蛋白提取与样本制备（一）操作步骤1.提前解冻RIPA（蛋白裂解液），一定要完全融化；2.根据样本数配制混合溶液：PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）：RIPA=1：100，现用现配）；3.裂解组织：每个样品称取50mg，加1ml混合液，在冰上用组织剪剪减为碎屑，电动匀浆后4 ℃静置2h使其充分裂解，离心12000g，4 ℃15min，取上清；4.蛋白定量：1)取少量上清稀释10倍：2ul上清，加18ul生理盐水；2)标准品按5ug/ul至0.3125ug/ul的梯度进行倍比稀释（制作平行样的标准曲线：5mg/ml标准品取80ul + 生理盐水80ul）；3)配制显色剂BCA混合液：a液：b液=50:1。
配制量=200ul*（孔数+6）；4)加入稀释完成的各样到酶标板的孔中及BCA混合液200ul/孔；5)贴上封口胶，37℃震荡混匀30min；6)562nm波长处测吸光度OD；7)根据数据制图、添加趋势线、方程及R2。
5.样品OD值带入方程，计算出各样本原液蛋白浓度；6.样本蛋白浓度均一化（一般样品蛋白浓度为3-4mg/ml）；7.100℃变性5min。
8.分装并存于-20 ℃，避免反复冻融。
二、配置相关试剂（一）10%的SDS（戴口罩称取）：试剂剂量SDS （g）10双蒸水（ml）80用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。
室温保存，如在长期保存中出现沉淀，加温溶化后，仍可使用。
（二）1.5M Tris/HCl（pH8.8）试剂剂量Tris base （g）18.17双蒸水（ml）80用浓盐酸调至pH 8.8，最后定容至100ml。
室温下保存。
（三）0.5M Tris/HCl（pH6.8）试剂剂量Tris base （g） 6.06双蒸水（ml）80用浓盐酸调至pH6.8，最后定容至100ml。
室温下保存。
（四）丙/双丙（戴口罩称取）试剂剂量丙烯酰胺（Acr）（g）75亚甲双丙烯酰胺（g） 2去离子水（ml）230加热溶解后，定容至250ml，4℃棕色瓶避光保存。
维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项
WesternBlot实验方法及注意事项实验原理：WesternBlot印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。
如果转印膜上含有靶蛋白，经X光片曝光、显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。
实验材料：分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、1×Tris・Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物、1×SDS电泳缓冲液、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件、0.75mm封边垫片、0.75mm样品梳子、50μl微量加样器、恒流电源常用试剂：1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。
小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
2）4×Tris・Cl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至8.8,补加H2O至体积500ml。
用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
3）4×Tris・Cl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至6.8,补加H2O至体积100ml。
蛋白质印迹法westernblot
蛋白质印迹法蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。
它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot蛋白免疫印迹Western Blot类似方法1 Southern Blot 杂交方法类似方法2 Northern Blot 杂交方法使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴原理与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
⑴分类Western Blot 显色的方法主要有以下几种:i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下(二抗用HRP标记)：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRR 即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
Western_blot实验步骤
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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
电泳注意： （1）所有蛋白样品定量一致，体积以一致，不够的用裂解液补满，样品两 侧 的 泳 道 用 等 体 积 的 1×loading buffer 上 样 ， Marker 也 用 1×loading buffer调整至与样品等体积，这样可以避免最边上的孔道电泳时出现扩散， 使最边上的孔道电泳出现误差。 （2）Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、 上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸 条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背 景也就出来了。 （3）浓缩胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离 胶 ，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而 在分离是理论上小电压长时间分离的效果会更好，浓缩胶80v，分离胶100v 就能跑得很好，同时制胶前一定要使胶混匀，双蒸水隔离时，一定要比较轻 地加上去，避免稀释上层的分离胶，使胶不均匀。
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Western Blot基本实验步骤
1、蛋白质提取：WIP或RIPA裂解细胞或研磨组织，离心，收集上清。 2、蛋白定量：先总蛋白定量，western后在依据内参定量。 3、电泳：依据需要检测蛋白的分子量选取胶的浓度，制胶，电泳。 4、转膜：半干或湿转，应用半干法转膜需防止短路。 5、封闭：5%脱脂奶粉或BSA封闭过夜或室温1小时。 6、一抗孵育：5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时或4 度过夜，1x TBST洗膜3次，每次5分钟。 7、二抗孵育：5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时， 1x TBST，洗膜3次，每次5分钟。 8、显影(ECL法)：将A、B发光液按比例稀释混合均匀滴在膜上。置于保鲜 膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝 光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定 影液中至底片完全定影，清水冲净晾干。 9、图片分析：标定Marker，进行分析与扫描 。
wb实验原理及步骤
wb实验原理及步骤
WB实验是WesternBlot实验的缩写，是一种常用的蛋白质检测方法。
该实验可以通过检测目标蛋白在蛋白样本中的存在和数量来确定其表达水平。
以下是WB实验的原理及步骤：
一、实验原理
WB实验基于蛋白质的电泳分离和免疫学检测。
首先将蛋白质样本通过SDS-PAGE电泳分离，然后将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接着使用一种特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过酶标记的二抗和显色底物来检测目标蛋白。
二、实验步骤
1. 样品制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。
2. 转移：将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
3. 阻断：将聚丙烯酰胺凝胶膜与含有蛋白质的阻断液进行接触，以防止非特异性结合。
4. 抗体反应：将目标蛋白结合的特异性抗体添加到聚丙烯酰胺凝胶膜中，并在室温下或4℃下进行孵育。
5. 二级抗体反应：添加酶标记的二级抗体，与特异性抗体结合。
6. 显色检测：加入显色底物，通过显色反应确定目标蛋白在样品中的存在和数量。
以上是WB实验的原理及步骤，该实验在生物医学研究中广泛应用，为疾病的诊断和治疗提供了有力的支持。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
western-blot步骤
western-blot实验流程：一、裂解细胞：1、收集细胞。
1000rpm,5min.弃上清，加1ml PBS,混匀，移至EP管。
2、4℃，1000rpm,5min。
弃上清，加1ml PBS，4℃，1000rpm,5min再洗一次。
3、配制裂解液（见附录一）：WB buffer 500μlNa3VO4 5μl配方一：Na4P2O7 5μlPMSF 5μlCocktail 5μl1×107/ml裂解液，冰上孵育15min（每隔3~5分钟混匀一次），13000rpm(或16000rpm)，4℃，离心10min.分装上清液（裂解蛋白），－20℃保存。
（一般另取5μl，作蛋白定量用）配方二：RIPA配方三：Nuc Buster TM protein extraction Kit二、蛋白定量（BCA法，Bio-Rad）：1、工作液的准备每ml A试剂中加入20ul的S试剂（此工作液在1周之内稳定，但在配制1天后会形成沉淀。
若有沉淀形成，加热并旋涡混匀使沉淀溶解，勿用Tip吸取沉淀）若样品中不含去垢剂，此步骤可省略，直接使用试剂A。
2、将蛋白标准液稀释，浓度从0.2mg/ml至1.5mg/ml。
稀释液与样品的溶解液相同。
3、待测蛋白做相应的稀释。
（一般稀释2.5或5倍）4、每孔加入5ul标准蛋白溶液和待测蛋白溶液。
5、每孔加入25ul的试剂A或试剂A’6、每孔200ul试剂B，轻轻混匀，室温放置15分钟，650-750NM检测吸光度。
三、配胶：10% (10ml，1小板) 8% (50ml，1大板) 分离胶：40% Acr-Bis 2.5ml 10. ml1.5M Tris-HCl PH8.82.5ml 12.5 mlH2O 4.8ml 26.5 ml10%SDS 100ul 500ul10% AP（H2O现配）100ul 500ulTEMED 4ul 30ul 注：大板——> 0.3cm梳子（大齿）50ml;0.5cm梳子（小孔）65ml.浓缩胶：(5ml, 1小板)40% Acr-Bis 625ul1.0M Tris-HCl PH6.8 625ulH2O 3.7ml10%SDS 50ul10%AP 50ulTEMED 5ul四、样品处理：配方一：sample buffer：0.5M Tris-HCl, PH6.8 1.0ml5×Glyceral 0.8ml（8ml）10%SDS 1.6ml二巯基乙醇0.4ml0.05%溴酚兰（用水配）0.4mlH2O 3.8ml配方二（常用）：电泳样品：25μg/孔。
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western-blot实验方法
1、试剂耗材的准备：
（1）转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl，39 mM 甘氨酸，0.037% SDS，20%甲醇）：
（2）10 ×丽春红染液：
（3）TBS 缓冲液：
（4）TBST 缓冲液（含20%Tween20 的TBS 缓冲液）：
（5）封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液）：
（6）一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或TBST 进行稀释。
（7）底物显色液
ECL，4℃避光保存，现用现配。
（8）显影液和定影液
用水稀释10 - 20 倍于铝盒中，可多次使用。
室温避光存放。
2、实验步骤：
（1）蛋白样品制备：用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度。
（2）取1 mg 蛋白进行SDS-PAGE。
（3）转膜：（转膜缓冲液4 ℃预冷备用，冷却装置于- 80 ℃冰箱冷冻备用）。
（4）将2 张海绵垫、2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。
（5）戴上手套，剪一张与凝胶尺寸相近的PVDF 膜（83 mm × 75 mm），左上角剪一缺口作为标记，浸泡在盛有20 mL 甲醇的平皿中约15 sec，直到膜变半透明。
用纯水冲洗膜2 次。
浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。
（6）SDS-PAGE 结束后，小心地剥下两块凝胶，一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。
海绵垫、滤纸、PVDF 膜及凝胶的预平衡时间在15 min - 1 hr 之间。
（7）将转膜夹子打开，使黑的一面保持水平。
按照海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸和海绵垫的先后顺序铺垫，制备凝胶转移夹层。
将膜与凝胶对齐。
用玻璃棒赶走气泡。
（8）将夹子夹起来，扣紧，小心不要移动内层。
放入电转槽中。
使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。
（9）将电转槽放在冰水盒中。
将预冻的冷却装置放入槽内。
缓慢倒入约650 mL转膜缓冲液。
（10）盖好盖子，接上电源。
根据蛋白分子量来调节工作电流，一般使用100 V（350mA），转移60 - 90 min。
（11）转膜结束后，断开电源，拆卸转膜夹子，逐一掀去各层。
将膜用1 ×丽春红染色5 min，用水冲洗3 次，观察蛋白转印是否完全。
同时也可将凝胶用考马斯亮蓝染色，胶上无蓝色条带则说明蛋白转印完全。
（12）免疫反应：
I 封闭：用镊子将膜移至含有25 mL 封闭液的平皿中，用脱色摇床室温缓慢摇匀2 hrs，或
4 ℃过夜。
封闭完用TBST 冲洗
5 sec。
用吸水纸吸去残余液。
II 一抗孵育：按照一抗说明书的推荐比例稀释一抗，使用TBST 或封闭液稀释。
在一容器中，将PVDF 膜浸没在抗体溶液里，室温下2 hrs 或4 ℃过夜，摇床缓慢摇匀。
III 一抗孵育完后，用TBST 室温下在摇床上洗3 次，每次10 min。
IV 二抗孵育：同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下摇床缓慢摇匀1 -2 hrs。
V 二抗孵育完后，用TBST 室温下在摇床上洗3 次，每次10 min。
（13）显影和定影：
I 将ECL Plus 显色液的A 液和B 液在容器里体积混合，根据膜的大小来确定显色液的量，
1 min 后，将膜与显色液充分接触。
II 反应1 - 5 min 后，吸去膜上残余液，将膜转移至一干净保鲜膜上，包好，放入压片夹中。
III 剪一张比膜尺寸稍大的X 光片，打开压片夹，将X 光片放在膜上，一旦放上，便不能移动。
关上压片夹，开始计时。
IV 根据信号强弱调整曝光时间，一般1 - 5 min，也可选择不同时间多次压片以达最佳效果。
V 曝光结束后，打开压片夹，将X 光片迅速浸入备好的显影液中显影，待出现明显条带后，终止显影。
一般1 - 2 min（20 - 25 ℃）。
VI 显影结束后，用水冲洗X 光片，放到定影液中，定影时间一般为5 - 10 min，以胶片透明为止。
VII 用水冲洗去底片上残留的定影液，室温下晾干。