菠菜叶中DNA的提取

中央民族大学生命与环境科学学院
化学综合性设计实验报告
年 月 日
菠菜叶中DNA 的提取 Extract DNA from the leaf of spinach
菠菜叶中DNA的提取
马鹏举
（中央民族大学北京100081）
摘要：采用CTAB方法从菠菜叶片中提取DNA,通过琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA进行定性分析和综合比较。

研究提取缓冲液用量、水浴时间、蛋白质沉淀剂(氯仿-异戊醇)用量、DNA沉淀剂(异丙醇)用量等条件对DNA提取效率和纯度的影响。

关键词：菠菜叶基因组DNA提取DNA检测提取方法琼脂糖凝胶电泳法
Extract DNA from the leaf of spinach
MA Peng- ju
Minzu univercity of China，Beijing，100081
Abstract：Using CTAB method to extract DNA from spinach leaves, through agarose gel electrophoresis of DNA extracted by the qualitative analysis and comprehensive comparison. Study extraction buffer consumption, water bath time, protein precipitator (chloroform, isoamyl alcohol) dosage, DNA precipitation agent (isopropyl alcohol), such as the dosage of DNA extraction efficiency and the influence of purity
Keywords: Spinach leavesGenomic DNA extraction DNAtesting Extractionmethod Agarose gel
electrophoresis
前言
制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。

在DNA提取过程中为尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，主要采用CTAB方法，其他的方法还有物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法；化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法；生物方式:酶法。

根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等。

CTAB是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

1.1仪器
微量移液器、台式高速离心机（20000r/min）、高压灭菌锅、常用玻璃仪器及滴管、10ml 离心管、研钵、凝胶成像分析系统、琼脂糖凝胶电泳系统
1.2材料
菠菜叶
1.3试剂[1]
CTAB溶液（ CTAB—20g/L ，NaCl—1.4 mol/L，EDTA—10 mmol/L，Tris—100 mmol/L，pH 8.0）
TE 缓冲液（EDTA——1 mmol/L，Tris——10 mmol/L，pH 8.0）
氯仿，异戊醇，巯基乙醇，苯酚，异丙醇，液氮，无水乙醇
1.4方法[2]
（1）将CTAB分离缓冲和巯基乙醇液置于65℃水浴中预热；
（2）称取菠菜叶1g，置于的研钵中，倒入液氮，尽快研碎，在液氮挥发完后停止研磨；（3）取适量粉末加入10ml的EP管中，加入1ml预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻晃动使之混匀；
（4）样品于65℃水浴中保温40分钟，并在保温过程中不断摇晃；
（5）冷却2min后，加入1ml的酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），充分震荡，使两者混合均匀，4℃ 12000 r/min离心10 min；（蛋白质溶解在酚中，DNA溶解在水相中，氯仿和异戊醇有加速分层，有助于分离，）
（6）取上清液至10 mL的离心管中，加入2ml的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻颠倒离心管，混匀，4℃ 12 000r/min离心10 min；
（7）小心取上清液置于一个新的10mlEP管中（尽量避免吸取中间层）,加入2.5ml的异丙醇（-20℃预冷），将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合室温放置15min至能见到DNA絮状物；（沉淀DNA）
（8）10000r/min离心10分钟,小心倒去上清液；
（9）用400ul无水乙醇洗涤DNA沉淀直至无色，4℃ 10000r/min离心10分钟；（洗涤DNA 出去分离过程中残留有机溶剂和离子）
（10）倾去上清液向下层离心物中加入100μLTE缓冲液进行溶解；
（11）在室温下使DNA沉淀干燥；
（12）取DNA溶液做0.8%的琼脂糖电泳；
（13）称取0.4g电泳用凝胶糖，放至三角烧瓶中，加入50mL0.5*TBE缓冲液，混匀后，将烧瓶放入微波炉中加热，看琼脂糖沸腾则停止加热，反复3次；
（14）取一PE手套，准备电泳样品，用移液器混匀，吸取样品依次加入点样孔中；
2.实验结果
2.1下图为凝胶层析分离的成像效果
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
A B
图1菠菜叶DNA凝胶层析分离的成像效果图
2.2 A组实验所加试剂
表1 A组试剂中各槽所加试剂含量
2.3 B组实验所加试剂
表2 B组试剂中各槽所加试剂含量
3.实验结果分析讨论
1.从图1可以看出我们提取到了DNA但色带尾部不干净，说明DNA不纯
2.由电泳图可以看到我们的mark出现了问题，有一些拖拉，我分析是由于在加入其它样品时有一些样品“漂”了出来，进入了mark的槽里，电泳后便出现了这样的结果，不过我们可以清楚的看到mark有六条比较平的色带，理论上有七条才对，我分析是由于我们所用的mark量太少。

3.观察DNA溶液的色带，色带拉长的范围较大，色带表面参差不齐，说明提取的DNA片段不纯，分析原因可能有以下几点；
（1）在研磨菠菜叶时研磨过度，将DNA破坏。

（2）向样品孔中加样品时，出现了样品加飞以及戳破样品孔的错误操作。

（3）我们所用仪器未经灭菌，可能有其它生物的DNA混入。

（4）在分离提取DNA的过程中存在少量杂质未被除净。

4.我们的实验没有明显的梯度出现。

5.对比A和B的成像，我们可以清楚的看到B图的效果要比A图的差，B图色带拉长的范围很大，这是由于我们在加样时有严重的外泄。

因此要格外注意样品加入时的操作，避免样液加出，或戳破凝胶。

6.在实验中要防止DNA的化学降解，过酸或过碱的环境都会使DNA降解，一般pH保持在8.0左右为宜。

7.实验过程中要防止DNA的物理降解，提取过程操作过于剧烈，DNA会被机械打断，因此操作过程要尽量简便、温和，减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。

8.DNA的二级结构和双链易受多种因素的影响，应避免强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等变性条件的出现。

4. 实验结论
我们在菠菜叶中，通过CTAB法提取出了较纯的菠菜DNA，但含有杂质。

致谢：
感谢王老师对我们这一学期以来耐心的课堂教育以及实验技巧的灌输，教会我们专业知识和技术还有学习方法，同样感谢实验准备老师为我们提供的实验仪器和实验试剂，方便我们学习使用。

参考文献
参考文献附例：
[1] 王巍杰,贾晓冬. 菠菜叶中叶绿素a和其他有效成份的分离提纯[J]. 河北理工学院学报. 2006 (02)
[2] 曲媛媛,周集体,王竞,夏元化,柳广飞,谭靓. 活性污泥基因组DNA快速提取新方法及其指纹分析[J]. 大连理工大学学报. 2006 (03)。