斑马鱼的培养及TALENs技术的应用
TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程
TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程HEREDITAS (Beijing)2013年4⽉,35(4):533―544ISSN /doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html实验指南收稿⽇期:2012?12?30;修回⽇期:2013?02?05基⾦项⽬:国家重⼤科学研究计划项⽬(编号：2012CB945101和2011CBA01000)和国家⾃然科学基⾦项⽬(编号：31110103904)资助作者简介:沈延,博⼠,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。
Tel ：010-********;E-mail:yshen@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 通讯作者:张博,博⼠,教授,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。
E-mail:bzhang@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 致谢:感谢祖尧为改进检测技术做出的贡献。
⽹络出版时间:2013-3-515:03:12URL:/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html /kcms/detail/11.1913.R.20130305.1503.002.htmlDOI:10.3724/SP.J.1005.2013.00533TALEN 构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程沈延,黄鹏,张博北京⼤学⽣命科学学院,细胞增殖与分化教育部重点实验室,北京100871摘要:类转录激活因⼦效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的⼀类新型的⼈⼯核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA 结合结构域和⾮特异性的Fok Ⅰ核酸内切酶切割结构域组成。
TALEN 能够根据⽤户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA 双链断裂,从⽽诱导该靶序列产⽣indel 突变,⽬前已成功地应⽤于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。
斑马鱼作为研究模型的应用与发展
斑马鱼作为研究模型的应用与发展斑马鱼是一种常见的淡水热带鱼，因其外观被广泛应用于美学领域，而在科学研究中也成为了重要的工具。
斑马鱼胚胎发育快、生命周期短、巨大的繁殖能力以及相对简单的遗传系统，使它成为研究发育生物学、神经生物学、药理学和遗传学等领域的优秀模型生物。
从其性状方面来看，斑马鱼的产卵较为容易，雌性斑马鱼每月可以产下300-400个卵子。
斑马鱼胚胎的发育阶段短，仅需1-2天就可以完成脊椎动物发育的最初几个小时。
它们的受精卵体积很小，可以进行高通量的药物筛选或遗传突变筛选。
正是这些方面的优势使斑马鱼成为了研究发育和遗传调控领域的研究模型。
在遗传学与基因组学研究方面，斑马鱼的基因组已经被彻底测序了。
它们仅有26条染色体，相当于人类染色体的一半。
12,000~13,000个基因与斑马鱼的身体结构、发育过程、生长和控制代谢有关。
这一基因与基因组学的基础研究为深入探究疾病、药物筛选等许多方面奠定了基石。
在对疾病的研究中，斑马鱼作为模型动物也正在逐步得到广泛应用。
例如，斑马鱼模型可以用于研究人类疾病的遗传病变，并且可以用来进行疾病模拟，如神经发育障碍、先天性心脏病等。
斑马鱼的生命力特别强，因此，可以将其用于对各种物质的毒性实验和药物筛选实验，在保证安全性的前提下，提高药物试验的效率。
此外，斑马鱼的神经系统也是其中一个备受关注的领域。
大量生理学与药理学研究利用斑马鱼的神经网络为研究平台。
例如，小鼠等作为动物模型观察老年痴呆症状是复杂的，且很难通过细胞或者神经网络的方法对其进行研究。
但是，斑马鱼的神经网络结构相对简单，例如从背根神经节开始，斑马鱼大脑仅有几百个神经元组成的而且都是浅表的，为研究神经网络提供了非常好的实验条件。
利用斑马鱼作为研究模型也有一些挑战。
例如，由于其种群自我更新时间相对较长，斑马鱼不能胜任复杂的进化研究，因此其遗传模型的适用范围也受到一定的限制。
另外，另一个方面是在斑马鱼研究中可能出现的生态中断现象。
斑马鱼模型动物的应用与前景
斑马鱼模型动物的应用与前景斑马鱼是一种小型热带淡水鱼类，常见于水族箱中。
而近些年来，斑马鱼模型在动物研究领域中被广泛应用。
斑马鱼模型是指将斑马鱼作为实验模型，通过人工操控、基因编辑等方法，研究其生命现象和机制，并应用到医学、药物研发、神经研究、毒理学、转化医学等领域。
一、斑马鱼模型在医学领域中的应用在医学领域中，斑马鱼模型被广泛运用到疾病模型的建立和药物筛选上。
其相较于哺乳动物模型具有价格低廉、生长迅速、繁殖能力强、体型小、幼鱼可透明等优势。
可以通过基因编辑技术将人体疾病相关的基因改变植入斑马鱼模型，从而模拟人体疾病。
如甲状腺激素缺乏症、舌咽神经痛等。
另外，通过药物筛选，可以快速选择出具有治疗作用的药物，为后期的药物研发提供重要的参考。
二、斑马鱼模型在神经研究领域中的应用斑马鱼模型还可以应用到神经研究领域中。
斑马鱼的中枢神经系统结构简单，同时具有高度透明性，可以直接观察到神经系统的发育和变化。
因此，斑马鱼模型被广泛应用到神经元的迁移、突触形成、神经细胞凋亡等神经发育研究上。
以突触发育为例，斑马鱼模型的发育周期较短，可以在较短的时间内观察到突触发育的变化，从而为更深入的神经系统研究提供基础。
三、斑马鱼模型在毒理学研究中的应用近些年来，毒理学研究中，对于环境污染物和化学物质的评估，始终是一个难点。
而且，对于大多数化学物质分析，动物实验又过于昂贵、耗时且对动物损伤较大。
因此，斑马鱼模型的应用被引入到毒理学研究中，成为一种有效、可预测且实用的模型。
其以短期、高通量的特点得到毒理学研究领域的广泛关注。
斑马鱼胚胎在短时间内就能产生反应，快速评估化学物质的毒性，从而增强毒性评估的先进性和准确性。
四、斑马鱼模型在转化医学中的应用斑马鱼模型具有高度的相关性，同时不受哺乳动物模型的限制，因此可以应用到转化医学领域中。
转化医学的概念是将基础研究和临床研究紧密结合，将实验室的研究成果快速转化为临床诊疗效应的新型医疗领域。
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧引言：转基因技术是现代生物技术的重要组成部分，通过改变生物体的基因组，使其具有新的特性或功能。
斑马鱼作为一种常见的实验动物模型，被广泛应用于生物学研究中。
本文将介绍转基因斑马鱼胚胎养殖技巧，帮助研究者顺利进行相关实验。
一、斑马鱼胚胎的获取斑马鱼胚胎的获取是进行转基因实验的第一步。
通常情况下，斑马鱼胚胎可以通过自然产卵或人工授精获得。
为了提高产卵的效率，可以将斑马鱼置于特定的环境条件下，如适宜的水温和光照条件。
此外，还可以使用药物刺激促进斑马鱼产卵。
对于人工授精，可以将雄性和雌性斑马鱼分别放入相同的容器中，利用它们的自然产卵和受精过程来获得胚胎。
二、胚胎的培养获得斑马鱼胚胎后，需要进行胚胎的培养。
首先，将胚胎转移到培养皿中，添加适宜的培养液，如E3培养液。
E3培养液中含有必需的营养物质，可以为斑马鱼胚胎提供所需的营养。
同时，保持培养皿中的水温和光照条件也非常重要，通常将其保持在28-30摄氏度，并提供适量的光照。
三、转基因技术的应用在斑马鱼胚胎培养的基础上，可以进行转基因技术的应用。
目前，常用的转基因技术包括转基因敲除和转基因过表达。
转基因敲除是通过将外源基因导入斑马鱼胚胎，使其失去特定基因的功能。
而转基因过表达是将外源基因导入斑马鱼胚胎，使其在特定生理条件下过度表达。
这些转基因技术可以帮助研究者研究特定基因的功能和调控机制。
四、转基因斑马鱼胚胎的鉴定进行转基因实验后，需要对转基因斑马鱼胚胎进行鉴定。
常用的鉴定方法包括PCR、荧光显微镜观察和基因测序等。
PCR是一种常用的分子生物学技术，可以通过检测特定基因的存在来鉴定转基因斑马鱼胚胎。
荧光显微镜观察则是通过检测转基因斑马鱼是否发出特定颜色的荧光来鉴定。
基因测序则可以直接确定转基因斑马鱼胚胎中特定基因的序列，从而进行准确的鉴定。
五、转基因斑马鱼胚胎的进一步研究鉴定转基因斑马鱼胚胎后，可以进行进一步的研究。
例如，可以观察转基因斑马鱼胚胎在不同生理条件下的表型变化。
斑马鱼作为模式生物在发育生物学和遗传学研究中的应用
斑马鱼作为模式生物在发育生物学和遗传学研究中的应用自从19世纪开始，科学家们一直在通过选定某些模式生物，如斑马鱼、小鼠、果蝇等来深入研究生命的奥秘。
这些模式生物被广泛用于从发育生物学到遗传学的研究领域。
其中，斑马鱼由于拥有发育速度快，透明度高，繁殖周期短等优点，为科学家们提供了理想的实验材料。
本文将详细探讨斑马鱼在发育生物学和遗传学研究中的应用。
一、斑马鱼在发育生物学方面的应用1.1 受精和胚胎发育斑马鱼的成熟期很短，仅需3个月，且在水中繁殖，雄鱼和雌鱼在不经过人工干预的情况下会自行交配，产下千万个卵子。
这些特点使得斑马鱼成为了研究受精和胚胎发育的理想模式生物。
斑马鱼发育周期短，且在受精后仅需数小时即可胚胎发育，科学家们可以直观地观察到受精的过程和胚胎早期的变化过程。
这为我们对于生命的起源和胚胎形成等领域提供了独特的视角和参考。
1.2 器官发育斑马鱼器官发育过程也是发育生物学领域的一个重要研究方向。
研究人员可以通过基因改造，观察到不同基因表达出来对器官发育的影响。
例如，一项研究表明，在一个发育的胰腺中，Pdx1基因是发展为稳定胰岛细胞所必不可少的基因。
通过改变Pdx1的表达模式，科学家们成功地发现Pdx1对稳定胰岛细胞数量的影响，加深了我们对器官发育的了解。
1.3 神经发育斑马鱼神经系统发育与脊椎动物的其他模式生物非常相似，与小鼠等模式生物相比，斑马鱼生长速度快，且在早期神经系统发育阶段仍较为简单，因此可以更好地研究这些阶段中神经系统的构建和运作。
在神经发育领域中，斑马鱼的应用包括但不限于研究神经元的分布序列、神经细胞的形态和运动状态、神经元的自发活动等方面。
二、斑马鱼在遗传学方面的应用2.1 遗传显微镜在斑马鱼遗传学领域，另一个被广泛使用的是遗传显微镜。
这个显微镜是一个用于斑马鱼早期胚胎研究的特殊显微镜。
这个显微镜可以放大数倍，帮助科学家在斑马鱼胚胎中发现突变。
该显微镜的广泛使用在突变分析方面取得了重大成果，帮助我们在独特的水平上研究生命的启动机制。
斑马鱼模型以及其在遗传学实验研究中的应用
斑马鱼模型以及其在遗传学实验研究中的应用斑马鱼（Danio rerio）是一种小型热带淡水鱼类，广泛应用于生物医学研究领域。
它的快速发育、高繁殖能力和透明胚胎等特点，使得斑马鱼成为研究人类疾病和遗传学的理想模型生物。
在遗传学实验研究中，斑马鱼被广泛用于探索基因功能、疾病模拟、药物筛选、发育生物学等诸多方面。
斑马鱼模型的优势主要体现在以下几个方面。
首先，斑马鱼的特征使其成为遗传学研究的理想模型。
斑马鱼的基因组在许多方面与人类的基因组高度保守，大约70%的人类基因具有斑马鱼的同源基因。
这意味着，通过研究斑马鱼的基因功能，我们可以更好地理解人类基因以及与之相关的疾病。
其次，斑马鱼的胚胎发育速度极快。
斑马鱼的胚胎在受精后仅需24小时便可以孵化。
另外，斑马鱼胚胎的发育过程可以在显微镜下清晰可见，这意味着我们可以轻松观察到发育过程中的变化，并进行更加精确的实验观察。
此外，斑马鱼的胚胎透明，这一特点使得研究人员能够直接观察到内脏器官和神经系统的发育。
通过应用各类荧光探针或特定标记物，我们可以在斑马鱼胚胎中对特定基因或基因产物进行定位和可视化，从而更深入地研究其功能和作用机制。
斑马鱼模型在遗传学实验研究中有着广泛的应用。
首先，斑马鱼模型可以用于探索基因功能。
在遗传学研究中，研究人员可以使用各种基于遗传学、分子生物学和转基因技术的方法来扰乱或改变斑马鱼基因的功能，从而了解特定基因对发育和疾病的影响。
其次，斑马鱼模型可以用于疾病模拟。
斑马鱼的遗传相似性和发育过程相似性使其成为研究人类疾病的理想模型。
通过模拟人类遗传病或疾病相关基因突变，我们可以研究这些疾病的发病机制、生理学变化和潜在治疗策略。
此外，斑马鱼模型还可以用于药物筛选。
研究人员可以将药物添加到斑马鱼培养液或胚胎中，然后观察斑马鱼的发育、行为和生理特征，以评估药物的毒副作用和药效。
这种药物筛选方法可以加速药物开发和筛选过程。
最后，斑马鱼模型在发育生物学领域也有广泛应用。
斑马鱼的实验室养殖方法及其实验应用
及其在以上研究领域的应用。
关键词: 斑马鱼; 实验室; 养殖; 应用
中图分类号: Q 95-331
文献标识码: A
Zebra fish laboratory culture techniques
ZH O U Yin1, ZH AN G H ong-ling2 ( 1. Departm ent o f B io log ical and Pharm aceutical Eng ineering, W uhan Po lytechnic Un iversity, W uhan 430023, Ch ina;
14
武汉工业学院学报
2 010 年
斑马鱼的雌雄鉴别较为容易。雄性体侧的银蓝 色条纹偏黄, 间以柠檬色条纹; 雌鱼的体侧条纹偏蓝 而且鲜艳, 身体比雄鱼丰满粗壮, 尤其在性成熟后雌 鱼的腹部膨大。笔者在饲养过程中体会到在分别斑 马鱼雌雄时除了注意上述区别外, 还应注意斑马鱼 臀鳍和尾鳍的颜色, 一般说来雄斑马鱼的臀鳍和尾 鳍偏黄。 1. 2 生活习性
1. 1 形态特征 斑马鱼的体型呈纺锤形, 成鱼体长约 4) 6 cm,
体侧有与斑马类似的纵向银蓝色条纹, 背部为橄榄 色, 在臀鳍和尾鳍上也有与体侧相似的条纹。
收稿日期: 2010-06-03. 作者简介: 周寅 ( 1986-) , 男, 硕士研究生, E-m ai:l zhyyw fm@ 126. com. 通讯作者: 张红菱 ( 1965-) , 女, 教授, E-ma i:l zh lw jb@ s ina. com.
斑马鱼的繁殖和饲养技术
斑马鱼的繁殖和饲养技术1 斑马鱼斑马鱼（Zebra fish,Danio rerio）,又名蓝条鱼，花条鱼，斑马担尼。
斑马鱼，是淡水水族箱观赏鱼，原产于亚洲，体长约4公分，具暗蓝与银色纵条纹。
斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm，对水质要求不高。
斑马鱼的雌雄不难区分：雄斑马鱼鱼体修长，鳍大，体色偏黄，臀鳍呈棕黄色，鱼纹显著。
雌鱼鱼体教肥大，体色较淡，偏蓝，臀鳍呈淡黄色，胚卵期鱼腹膨大明显。
斑马鱼属卵生鱼类，4月龄进入成熟期，一般用5月龄繁殖较好。
2 斑马鱼饵料及其营养成分斑马鱼对饵料的要求不高，人工配合饵料及各种鲜活饵料均可。
但为保证斑马鱼较好的繁殖和生长，最好多种饵料结合投喂，人工饵料可以用软颗粒饲料或者全价硬颗粒饵料。
所用配合饵料的蛋白质含量要高于40%，粗脂肪高于3.5%，水分低于4%，钙、磷含量分别为0.9%-1.6%和0.8%-1.4%。
如果培育亲鱼，配合饵料中应添加一些促进性腺发育的元素，如Va、Vd、Ve以及微量元素锌、铁等。
在不同的发育时期选用鲜活饵料的种类不同。
在斑马鱼仔鱼阶段，可以投喂草履虫、轮虫、酵母等作为其开口饲料；在幼体阶段，可以投喂卤虫的无节幼体；随着斑马鱼的长大，饵料也变得丰富起来，可以投喂大型的浮游动物类以及桡（rao）足类，或者是蝇幼虫、摇蚊幼虫、水蚯蚓等，也可以投喂捣碎的小鱼小虾。
活体饵料对斑马鱼的性腺发育可以起到一定的促进作用，因此在亲鱼培育时，适量增加活体饵料会缩短其性腺发育周期。
3 斑马鱼的繁殖斑马鱼亲卵亲鱼的培育：斑马鱼在繁殖时通过光周期作用，在日出后产卵，为促进斑马鱼的成熟，我们在水族箱内按照雌雄1：2-1：3的比例放入斑马鱼，控制光周期为14：10（光照14h,黑暗10h），如有必要可以用黑布水族箱罩住，增加水体温度至28.5摄氏度，增加投喂次数，可以由原来的每天投喂2-3次增加为4次，并且增加鲜活饵料的投喂。
（1）自然产卵：斑马鱼一般10-12周可达到性成熟，但最好用17-18周的亲鱼进行大规模繁殖，斑马鱼为异体体外受精，繁殖周期短（一般7d左右），温度适合时一年四季都可产卵，卵量300-1000粒，为非粘性沉型卵。
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“斑马鱼的培养及TALENs技术的应用”预习报告一、实验原理1、TALENs实验技术原理类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶, 它由特异性的 TALE DNA 结合结构域和非特异性的 FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。
TALEN 能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列, 造成 DNA 双链断裂, 从而诱导该靶序列产生 indel突变。
2、斑马鱼的生活习性以及作为模式生物的优势斑马鱼是生长在印度、巴基斯坦淡水河流中的一种硬骨鱼（鲤鱼），成年鱼全身仅长4－5厘米，因全身横向分布着一道一道褐色的斑马线而得名。
斑马鱼很容易在实验室饲养，一般3个月就可以达到生殖成熟期，雌鱼每次产卵200枚左右，一生可产卵数千枚，斑马鱼所产之卵经24小时即可胚胎发育成熟，仔鱼期只有1个月。
更独特的是，斑马鱼的卵是透明的，整个胚胎发育在体外完成，也是透明的。
优势：显著优势在于体积小( 3cm～4 cm)，可在较小的空间大量繁殖；产卵量高(每周200多个)；发育快，许多组织在受精后24 h开始形成；成熟周期短；体外受精且胚胎透明，可在体视解剖镜下观察；单倍体、雌核发育二倍体的制作和突变体的获得均较容易；精子可以冷冻保存。
所有这些特点都使斑马鱼非常适合于遗传学的研究。
斑马鱼的基因组中大约含有30000个基因，这个数目与人类差不多，而且它的许多基因与人类存在一一对应的关系。
它的神经中枢系统、内脏器官、血液以及视觉系统，在分子水平上85%与人相同。
二、实验目的通过本实验可以了解TALENs实验技术的基本原理，熟悉其几个关键实验步骤的操作，学习显微注射技术，从而能够独立应用这些技术进行相关学术研究。
三、实验器材1、实验仪器超净工作台(细菌操作用)、细菌培养摇床、台式离心机、凝胶电泳仪、凝胶电泳槽、凝胶成像仪、水浴锅、恒温培养箱、漩涡振荡器(Vortex) 、 NanoDrop(ND-1000 Spectro pho tometer)、PCR 仪，体视显微镜、恒温培养箱、配鱼缸、台式冷冻离心机 1.3.2 耗材细菌培养皿、移液枪、移液枪枪头、Eppendorf 离心管、PCR 管、显微操作仪，倒置显微镜，拉针仪，胶头滴管，胶固定板。
2、实验试剂NEB 限制性内切酶：BstNI-HF、KpnⅠ、NheⅠ-HF、NotⅠ-HF 或 SacⅡ、SpeⅠ-HF。
试剂盒：DNA 连接试剂盒(TaKaRa, D6020)、微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、快速 DNA 产物纯化试剂盒、SP6mMESSAGE mMACHINE Kit(Ambion, AM1340)(用于体外转录 TALEN mRNA)、T 载体试剂盒(pMD®18-T,TaKaRa, D101A) 琼脂糖、DNA marker、1×TAE、氨苄青霉素、 LB 琼脂培养基、LB 液体培养基、2×Taq MasterMix (含染料)、碱性磷酸酶(CIAP,TaKaRa, D2250)、1 mol/L Tris(pH 8.0)、50 mmol/L NaOH、70%乙醇、超纯水(ddH2O, 18 MΩ)，酚红3、实验材料大肠杆菌，斑马鱼胚胎，TALE单体质粒系列，pCS2-0.5TALE-FokⅠ表达载体系列四、实验步骤1、TALE片段的设计（参考基因：HSF4）https:///files/filenLMQK0.txt【示例 1】斑马鱼基因HSF4 TALEN 靶点信息基因名左半位点长度(bp) Spacer 长度(bp) Spacer 中的内切酶右半位点长度(bp)Hsf41815BstNI(CCWGG) 19(加下划线) (加下划线)5′-t GCACGCGCGTCCCCGCTG cccaacgaagcctgg GTCGCGTTGCGCCGCCGCC a-3′3′-a CGTGCGCGCAGGGGCGAC gggttgcttcggacc CAGCGCAACGCGGCGGCGGt-5′2、TALEN片段的克隆（写出详细的操作步骤）2.1酶切（第一次）（质粒的结构、种类、酶切体系、过程等）1）向离心管中加入组装好的 TALE 重复序列载体 pMD-TALE，用 SpeⅠ和 NheⅠ双酶切；向离心管中加入 pCS2-T-PEAS载体，用 NheⅠ分别单酶切。
1．新提的质粒，在10uL的体系中进行处理，即：体系I 体系II10μL 0 TALE 重复序列载体pMD-TALEpCS2-T-PEAS载体0 5μL 10×缓冲液2μL 1μLSpeⅠ1μL 0NheⅠ 1μL 1μL6μL 3μLddH2O2．37℃，保温2-3h。
3．加入1/10体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。
各酶解样品于冰箱中贮存备用。
2.2琼脂糖电泳（1）琼脂糖凝胶的制备称取1.0g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入100mL TBE缓冲液，瓶口倒扣一小烧杯，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为1％。
（2）胶板的制备将有机玻璃内槽洗净、晾干。
取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。
注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。
将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
室温下静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。
将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。
(3)加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，以免造成限制酶被污染。
加样时，吸头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右。
(4)电泳加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。
在低压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。
当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停止电泳。
(5)染色将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。
染色20min后，用大量水冲洗。
2.3割胶回收（试剂盒名字、过程）名字：普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）过程：使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
(1）柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使用当天处理过的柱子）(2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
(3）向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 µl，则加入100 µl PN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解 (若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。
注意：对于回收<300 bp的小片段可在加入PN 完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。
(4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
注意：吸附柱容积为800 μl，若样品体积大于800 μl可分批加入。
(5）向吸附柱CA2中加入600 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW 加入后静置2-5 min再离心。
(6）重复操作步骤5。
(7）将吸附柱CA2放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g )离心2 min，尽量除尽漂洗液。
将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
(8）将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。
12,000 rpm (~13,400×g )离心2 min收集DNA溶液。
注意：洗脱体积不应小于30 μl，体积过少影响回收效率。
洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。
若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH 值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
DNA也可以用缓冲液(10 mM Tris-Cl, pH8.0) 洗脱。
为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2 min，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，将DNA溶液收集到离心管中。
2.4酶连（体系的设计、操作过程）（1）pCS2载体骨架CIAP去磷酸化, 快速DNA产物纯化试剂盒回收后备用（2）将上述去磷酸化的pCS2载体骨架与双酶切后回收的 TALE 重复序列片段混合，加入连接酶连接2.5转化（操作过程及对照组实验设计）(一)大肠杆菌感受态细胞的制备1．从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃振荡培养过夜，直至对数生长期。
将该菌悬液以1：50接种于50mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养3～4h。
2．取5mL培养液放入离心管中，在冰上放置10min，于4℃5000rpm离心10min。
3．可用加样器将残余液体尽量去净，用1mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30min。
4．于4℃，5000rpm离心10min。
5．弃上清，加入200μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态细胞悬液。