硫酸铵纯化抗体
1.兔抗人IgG抗体的初步纯化
( 硫酸铵沉淀法）
一、基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯
化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
二、试剂及仪器 1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等 2. 硫
酸铵(NH4)2SO4 3. 饱和硫酸铵溶液4. 蒸馏水 5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 ) 6. 透析袋 7. 超速离心机 8. pH 计 9. 磁力搅拌器
三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液 1.将 767g (NH4)2SO4边搅拌边慢慢加到 1 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液(SAS)（4.1 mol/L, 25 ° C ）.
（二）沉淀 1.样品（如腹水）20 000 ′ g 离心 30 min ，除去细胞碎片； 2.保留上清液并测量体积； 3.边搅拌边慢慢加入等体积的
SAS 到上清液中，终浓度为 1 ： 1 。4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（4 ° C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析 1.蛋白质溶液10 000 ′ g 离心 30 min （4 ° C ）。弃上清保留沉淀； 2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48
四，应用提示
（一）先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1.
边搅拌边慢慢加SAS 到样品溶液中，使浓度为0.5:1
(v/v) ； 2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或过夜
（ 4 ° C ）；3.3000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ），保
留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次离心得到
沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 4.上清
液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀
溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 5.杂蛋白与欲纯化蛋
白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是
非常有效
（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。
纯化产物的鉴定：
（1）效价测定 : 采用间接ELISA法 (3 mg / L抗原包被 , 1∶ 1
000 开始倍比稀释)检测抗体的效价。
（2）Ig亚类 ( 型 ) 的鉴定 : 用小鼠 Ig亚类检测试剂盒鉴定杂交瘤细胞培养上清中 mA b 的类和亚类。
（3）westernblot 鉴定抗体特异性 : 取 5 μ g 人 IgG 经SDS-PAGE后 , 转移至硝酸纤维素膜上 , 用 5 0 g/L 脱脂奶粉室温封闭1 h。依次滴加封闭液稀释的 5 mg/L纯化抗体 (室温孵育2 h 或 4℃过夜 ,洗膜3次)及1∶1 000 稀释的 HRP 标记的羊抗鼠 Ig G(室温孵育1 h, 洗膜 3次)。最后加 DAB显色 ,观察结果。
（4）相对亲和力测定 : 以 IgG与抗体结合曲线上部趋于平坦的一段(平台期)的吸光度值(A)为100%, 查出 A值为 50%点的抗体的浓度,以此来表示各株的相对亲和力。
1.为什么需要用透析袋透析？用透析袋透析以彻底除去硫酸氨；
2.纯度如何简单鉴定？用BSA试剂盒测定抗体浓度，也可以用考马斯法、紫外法、双缩脲法等测定。
3.为什么要进行活性鉴定？进行活性测定可以判定抗体效价，初步确定抗体的稀释倍数，能便于找到最好的稀释倍数，避免背景深等不良影响。
5.纯化产物如何保存？注意事项？
纯化产物可以冻干保存、过滤除菌后加叠氮化钠4℃保存、或加50％甘油-20℃保存，也可直接置于液氮中保存。
抗体ProteinA纯化方法
抗体ProteinA纯化 一．P roteinA柱子的制备 1.配制溶液； 结合／洗涤缓冲液：NaCl，0.5M ；Na2HPO4，20mM ；PH8.0。 配制500ml的方法： 称取NaCl 4.383g，Na2HPO43.5814g溶解于450ml的双蒸水中。调节PH为8.0,补加双蒸水至总体积500ml。 2. 制备空柱子 （1）先打开用过的PD-10上盖，拿掉上面的盖膜。盖上盖子，摇晃，倒去里面的填料，用PBS清洗3次。 （2）用胶带固定好PD-10空柱子，要求垂直放置。 （3）在PD-10空柱子里加入2ml的Binding Wash buffer.结合缓冲液。 （4）ProteinA填料混匀，（10ml包装一小瓶）。 （5）加入5ml的ProteinA到柱子中。 （6） （7） （8） 二．纯化步骤 1.样品准备；将兔血清与结合缓冲液1：1混合，过滤（防止堵塞柱子）。 2.平衡柱子：用5-10倍体积的结合缓冲液过Protein A柱。 3.上样：将准备好的血清样品上样，根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。 4.洗脱杂蛋白：用结合缓冲液冲洗柱子，直至结合液中不含蛋白。 5.收集抗体：用洗脱液过柱，同时收集漏出液（约3-4ml/管），直至漏出液中不含蛋白。 测定各收集管中的蛋白含量，合并蛋白管。（注意：收集管中需事先加入约150ul的1M PH9.0 Tris-HCl缓冲液，防止抗体在过酸的环境下失活） 6.柱子再生：用5-10倍体积的再生液再生柱子。 7.PBS透析收集的抗体。 三．试剂的制备 1. 结合缓冲液1000ml 500ml 甘氨酸112.6g 56.3g 氯化钠175.2g 87.6g 氢氧化钠调PH至9.0 2. 洗脱缓冲液500ml
(抗体的纯化)硫酸铵沉淀法
抗体的纯化( 硫酸铵沉淀法） 一，基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 二，试剂及仪器 1 .组织培养上清液、血清样品或腹水等 2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 4 3. 饱和硫酸铵溶液（SAS ） 4. 蒸馏水 5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠) 6. 透析袋 7. 超速离心机 8. pH 计 9. 磁力搅拌器 三，操作步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。 （一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ） 1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 °C ）. 2.其它不同饱和度铵溶液的配制 （二）沉淀 1.样品（如腹水）20 000 ′g 离心30 min ，除去细胞碎片； 2.保留上清液并测量体积； 3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1 4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 °C ），使蛋白质充分沉淀。 （三）透析 1.蛋白质溶液10 000 ′g 离心30 min （4 °C ）。弃上清保留沉淀； 2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 °C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 四，应用提示 （一）先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1.边搅拌边慢慢加SAS 到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v) ； 2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或过夜（4 °C ）； 3.3000 ′g 离心30 min （4 °C ），保留上清液；上清液再加SAS 到0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 4.上清液再加SAS 到0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效 （二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1 ）；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。
抗体纯化的方法有哪些
抗体纯化的方法有哪些？ 抗体制备出来之后，需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗，既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清，而通常经过免疫制备的 硫酸铵沉淀法： 基本原理：高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分离免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别，一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。 适用于：鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA 基本操作： 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清； 2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%，静置沉淀蛋白； 3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解，用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐； 4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，PBS或硼酸盐（含0.02%叠氮钠）缓冲液洗脱； 5.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度； 6.抗体保存浓度在0.1-30 mg/mL适宜，-20℃保存不超过一个月，避免反复冻融。 亲和层析法 基本原理：基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段，将protein A和protein G结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG及其亚类与片段纯化出来。 成员介绍：protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁，分子量42 kDa，由spa 基因编码，具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域，每个结构域由三个α螺旋构成。 protein A的B结构域
protein A的各个结构域 protein A可结合多数免疫球蛋白的Fc段（尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4，豚鼠，猕猴，鼠类IgG2a、兔）以及人VH3家族的Fab段。基因工程改造的protein A通常使用大肠杆菌作为表达宿主，表达产物仍含有五个Fc结合结构域。对其结构上的改造主要是为了增加与多孔性材料的偶联性能，也有的改造protein A含有四个或六个同型Fc结合结构域，另外结构域数目较少的protein A能得到更好的抗体纯化效果。 protein G分离自G Streptococcus的细胞壁，分子量65 kDa，由spg基因编码，可结合抗体的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的protein G去掉了与白蛋白的结合位点仅仅保留Fc结合结构域，其结合力较protein A更强。 protein G的B结构域 protein G的各个结构域 还有一种protein A/G蛋白，是基因工程改造产物，是将protein A的4个Fc结合结构域与protein G的2个Fc结合结构域融合表达得到的。protein A/G结合了二者的特性，能结合人和鼠的IgG所有亚型，不结合鼠的IgA、IgM。 ①proteinA亲和层析 适用于：人（IgG3除外）、兔、豚鼠、猪的抗体； 基本操作： 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清； 2.调节pH到8.0：腹水以10倍体积pH8.0 PBS稀释、培养上清用pH8.0 PBS透析或强氧化钠调节； 3.过proteinA琼脂糖凝胶柱，pH8.0 PBS洗杂； 4.柠檬酸缓冲液洗脱抗体（小鼠IgG1用pH6.5，IgG2a用pH4.5，IgG2b和IgG3用pH3.0），并注意收集管内需加入Tris缓冲液中和滴下的抗体溶液； 5.用PBS透析；
抗体分离纯化技术的研究进展
生物技术通报 ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ ·技术与方法· ２００８年第３期 收稿日期：２００７－１１－１９ 基金项目：内蒙古自治区自然科学基金重大项目（编号２００４０８０２０４０２）作者简介：侯越（１９８２－），男，硕士研究生，研究方向：动物学生物技术通讯作者：吴应积，教授 引言 抗体是一种特殊的蛋白质分子，被作为体外诊断的试剂、治疗疾病的药物、免疫亲和层析的配基等，在生命科学研究、生物技术及医学领域中有着广泛的应用。尤其是抗体作为各种免疫分析的核心试剂，对免疫分析结果的灵敏度、 特异性起着至关重要的作用。在对一些与生命体功能关系密切的新基因产物的研究中，是否拥有相应的抗体以检测与鉴定新基因的产物蛋白质，是整个研究工作能否深入开展的关键。 抗体技术是免疫学领域中的一个重要方面，广泛应用于生命科学和医学各学科。从第一代抗体———血清多克隆抗体开始，它就在疾病治疗和体外诊断中发挥了很大的作用。由于免疫动物制备血 清抗体的免疫原性和非均质性，给抗体研究和应用造成了困难［１］，激发了人们对抗体进行深入研究的热情。１９７５年Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ通过杂交瘤技术制备出针对一种抗原决定簇的抗体即第二代抗体—— —单克隆抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭｃＡｂ），是均质的异源抗体［２］。单克隆抗体具有高度均质性、高度特异性，促进了对各种传染病和恶性肿瘤诊断的准确性，是目前应用最广泛的抗体。单克隆抗体的出现，引起了生物学理论的革命，生物学技术的广泛应用提供了重要的工具［３］。２０世纪８０年代采用基因工程的手段研制抗体，并对抗体的基因进行改造和重组等，制备出第三代抗体——— 基因工程抗体（ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙＧＥＡｂ）。基因工程抗体主要对现有的鼠源性单克隆抗体进行人工改造，并 抗体分离纯化技术的研究进展 侯越 罗奋华吴应积 （内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室，呼和浩特０１００２１） 摘 要： 制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础，抗体质量的高低，将直接影响试验的成败。抗体 的制备有两个途径：一是一般通用的方法，以纯化的抗原免疫动物，获得多克隆抗体；二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体。但不论用何种技术制备的抗体都需要进行纯化。重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法。对当前的纯化方法进行了一个简要的综述。 关键词： 抗体 分离 纯化 ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＳｅｐａｒａｔｉｏｎ ＨｏｕＹｕｅＬｕｏＦｅｎｈｕａＷｕＹｉｎｇｊｉ （ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＣｈｉｎａｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００２１） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｐｏｓｓｅｓｓｅｄｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄａｆｆｉｎｉｔｙｉｓｔｈｅｂａｓｅｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓ ｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｄｅｐｅｎｄｓｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｅｐａｒｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｈａｓｔｗｏｗａｙｓ：ｏｎｅｉｓｃｏｍｍｏｎｌｙｃｕｒｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄ，ｔｏｂｅｕｓｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｖｉａｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇａｎｉｍａｌｓｗｉｔｈｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｔｉｇｅｎ；ｔｈｅｏｔｈｅｒｉｓｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｂｙｕｓｉｎｇｈｙｂｒｉｄｏｍａｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｗｈａｔｅｖｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｕｓｅｄ，ｔｈｅｐｒｅｐａｒｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｎｅｅｄｓｔｏｂｅｐｕｒｉｆｉｅｄ．Ｉｔｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｏｃｈｏｏｓｅｔｈｅｐｒｏｐｅｒｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｓｏｕｒｃｅｏｆｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗｉｓｆｏｃｕｓｅｄｏｎｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＩｓｏｌａｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
硫酸铵分级沉淀
一，基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 二，试剂及仪器 1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等 2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 4 3. 饱和硫酸铵溶液（SAS ） 4. 蒸馏水 5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠) 6. 透析袋 7. 超速离心机 8. pH 计 9. 磁力搅拌器 三，操作步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% — 50% 。 （一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ） 1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 ° C ）. 2.其它不同饱和度铵溶液的配制 （二）沉淀 1.样品（如腹水）20 000 ′ g 离心30 min ，除去细胞碎片； 2.保留上清液并测量体积； 3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1 （
4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 ° C ），使蛋白质充分沉淀。（三）透析 1.蛋白质溶液10 000 ′ g 离心30 min （4 ° C ）。弃上清保留沉淀； 2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 ° C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 四，应用提示 （一）先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1.边搅拌边慢慢加SAS 到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v) ； 2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或过夜（4 ° C ）； 3.3000 ′ g 离心30 min （4 ° C ），保留上清液；上清液再加SAS 到0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 4.上清液再加SAS 到0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1 ）；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。 今天作的实验是利用硫酸铵沉淀蛋白质，从之前作过的经验知道，这一个步骤是有名的烦，要慢慢用敲的把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。 相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到，与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入硫酸铵，会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的离子容很大，所带的电子数也多(NH4+, SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合。 蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域，水分子会在这些非极性区的表面聚集，形成类似『水笼』的构造(请见下图)，以便把蛋白质溶入水中。一旦蛋白质溶液加入硫酸铵，后者吸引了大量水分子，使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸引，因而沉淀下来。因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就越容易用硫酸铵沉淀下来。 在计算所添加的硫酸铵的重量方面，找到了一个不错的网站——硫酸铵计算机 这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这四个数值，就可以得到需要添加的硫酸铵克数，以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积，算是一个很不错的网站。 此外另一个比较值得提的，是我有用两种方式加入硫酸铵，第一种是固体的硫酸铵模碎加入，另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入，各有各的优缺点，比较如下： 1.造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵>硫酸铵饱和溶液 利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成变质(没试过用倒入的)。不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白质就坏了(溶液有致密的白色气泡产生)。 2.操作的容易度：硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵 固体硫酸铵最大的缺点就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以当你要溶解的蛋白质很多时，这是很累的步骤。然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分，要先加热让它饱合后，回到操作温度让它过饱和，最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。
抗体纯化
一、抗体纯化部分 1、腹水/血清的亚型测定完成后，IgG亚型的腹水/血清使用Protein G 抗体纯化柱纯化；IgM 亚型的腹水/血清则使用饱和硫酸铵沉淀法沉淀。 1.1 Protein G 抗体纯化步骤： （1）新柱子先用DDW 5ml过柱； （2）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （3）抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上； （4）继续10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （5）5倍柱体积甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.7）洗脱结合位点上的抗体，并加入Tris-HCI(pH 9.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性； （6）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （7）5倍柱体积20%乙醇溶液过柱，于4℃条件下保存纯化小柱； （8）将洗脱的抗体用聚乙二醇浓缩并透析，以彻底去除不相干离子。 其中所用试剂配方： DDW：超纯水 Binding Buffer（100ml）：A液，0.2M磷酸氢二钠61ml B液，0.2M磷酸二氢钠39ml 磷酸氢二钠4.37g 磷酸二氢钠1.22g 甘氨酸-盐酸缓冲液：0.1M甘氨酸溶液加浓盐酸调pH 2.7 Tris-HCL缓冲液：1M Tris溶液加浓盐酸调pH 9.0 1.2 饱和硫酸铵沉淀法步骤： （1）配制饱和硫酸铵溶液，再用氨水调节pH至8.5 （2）沉淀：a、腹水/血清离心去除细胞碎片，保留上清液并测定体积； b、边搅拌边逐滴滴入等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋白充分沉淀； c、上述蛋白质溶液经过离心弃上清取沉淀，并用PBS溶液（pH 7.0）溶解； d、继续向上一步蛋白溶液中滴入1/2体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋 白充分沉淀； e、继续离心沉淀弃上清去沉淀，用PBS溶液（pH 7.0）溶解； （3）透析：每隔3-6小时换一次透析液，以彻底去除硫酸铵。 其中所用试剂配方： PBS缓冲液（1L pH 7.0）：氯化钾0.2g 磷酸二氢钾0.2g 磷酸氢二钠3.35g 氯化钠8g
辛酸硫酸铵纯化抗体
辛酸-硫酸铵法从人血清中纯化IgG 一、 实验目的 1初步掌握从血清中提取纯化 IgG 的方法步骤。 2、了解辛酸-硫酸铵法纯化IgG 的原理。 二、 实验原理 辛酸-硫酸铵法分两步进行。第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下 可沉淀血清或腹水中的白蛋白或其他非 Ig 蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将 Ig 沉淀下来, 操作步骤如图3-10所示。经SDS-PAGE 电泳检测能得到电泳纯度较高的 Ig 。 _______ ?沉淀(白蛋白和其他ir igG 蛋白质) 匕消液(igG) 硫酸钱沉淀 T 沉淀(IgG) T 溶解沉淀 图3—竹辛酸一硫酸谖法从血漬中纯化IqG 操作流程 三、仪器、原料和试剂 1、仪器 磁力搅拌器、离心机、低温冰柜。 2、原料 抗血清(兔抗鸡血清)。 血清或腹水 丫酸沉淀
3、试剂 (1) 乙酸-乙酸钠缓冲液：60mmol/L, pH4.0。 (2) 10X磷酸盐-NaCI 缓冲液(PBS : 100mmol/L PBS pH7.4。称NaCI 80g、Ns fe HPO12H2O 29g、KCl 2g、KHPQ 2g,加蒸馏水溶解，加入100mmoI/L EDTA 20ml，用去离子水定容至1000ml 。 (3) 透析液10mmol/L Na 2HPQKH2PQ缓冲液，含15mmol/L NaCl，pH7.2。 (4) 硫酸铵。 ⑸辛酸。 四、操作步骤 1、抗血清用4倍体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，用0.1mol/L NaQH调至血清稀释液为pH4.5。 2、室温下边搅拌(磁力搅拌器或电功搅拌器)，边缓慢滴加辛酸( 25ml/L血清稀释液)， 滴加完后继续搅拌30min。 3、离心(10000r/min , 30min)，收集上清夜，弃去沉淀。 4、上清液用多层纱布过滤。 5、按1/10 体积加入10X PBS 用5mol/L NaQH 调至PH7.4。 6、上清液4 C预冷，计算溶液总体积，在4C按277g/L加入硫酸铵粉沫(45%包和度)，边 加边搅拌，加完后继续搅拌30min。 7、离心(5000r/min , 15min))，弃去上清液。收集沉淀。 8、沉淀用少量透析液溶解(一般为血清体积的1/10 ),透析并更换两次透析液或用Sephadex G-50脱盐。 9、Ig溶液在50?55C水浴中加热20min，离心(5000r/min , 20min),上清液-20 C保存或冻干保存。
硫酸铵沉淀
在计算所添加的硫酸铵的重量方面，找到了一个不错的网站——硫酸铵计算机 这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这四个数值，就可以得到需要添加的硫酸铵克数，以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积，算是一个很不错的网站。 此外另一个比较值得提的，是我有用两种方式加入硫酸铵，第一种是固体的硫酸铵模碎加入，另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入，各有各的优缺点，比较如下： 1.造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵>硫酸铵饱和溶液 利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成变质(没试过用倒入的)。不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白质就坏了(溶液有致密的白色气泡产生)。 2.操作的容易度：硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵 固体硫酸铵最大的缺点就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以当你要溶解的蛋白质很多时，这是很累的步骤。然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分，要先加热让它饱合后，回到操作温度让它过饱和，最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。 3.蛋白质溶液的体积放大程度硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵 这是使用硫酸铵饱和溶液最头痛的部分，举例来说，要让100 ml的硫酸铵百分比从0%到25%，如果是加入固体的硫酸铵，只会让溶液从100 ml变成107 ml左右，但若是加入硫酸铵饱和溶液，会让溶液变成125 ml！而且若是要提高到50%，须加等量的硫酸铵饱和溶液，所以会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。 因此在加入硫酸铵时，若是低百分浓度可以利用硫酸铵饱和溶液，然而如果是高百分浓度的，除非不在意蛋白质溶液体积的放大(反正都要离心离下来)，否则还是用固体硫酸铵来的好。 所以今天从0%拉到25%及从25%拉到50%时，都是利用硫酸铵饱和溶液，但是当要从50%拉到75%时，我选择利用固体硫酸铵，因为如果用硫酸铵饱和溶液，离心机无法离那么多的溶液体积。
硫酸铵沉淀
硫酸铵沉淀: 有生物活性的蛋白一般在做硫胺沉淀的时候要小心一点。最保险的做法就是,把硫酸铵配成饱与溶液,把蛋白溶液置于冰浴上,再把饱与硫胺溶液一滴一滴的加到您的蛋白溶液中,最好边加边搅拌,避免局部硫胺浓度过高,但搅拌的时候注意不要搅出气泡。按照您的比例加完之后,最好放冰箱静置至少2h,充分沉淀后离心即可。 4M的硫酸铵pH值为4、6,在这个酸度下可能会有一些蛋白质变性,要小心。硫酸铵会破坏蛋白质水化层,最好就是缓与地加入。边加入边搅拌,如果在磁力搅拌器上搅拌,小漩涡中心有很多泡沫就表示蛋白质变性,使得溶液粘度增加,泡沫难破,那就很难保证您的蛋白质有没有变性了。 溶解度,在一定温度下,某固态物质在100g溶剂中达到饱与状态时所溶解的质量, 其单位就是“g/100g水”。在未注明的情况下,通常溶解度指的就是物质在水里的溶解度。 溶液饱与度(化学) 某种溶液的饱与度就是指在100g该溶液中溶质在溶液中所占质量分数、一般情况下,一种溶液的饱与度在同一温度下不会变、要想使不饱与溶液饱与度增加可以选择增加溶质、在刚好有晶体析出的时候就就是溶液刚好饱与的时候、溶液饱与度不会出现100% 加固体比较好,加得越慢越好。如果加快了,会造成局部浓度过大,造成意想不到的沉淀。
硫酸铵沉淀的时候应该要注意pH值的变化,就我的实验来说,一株产淀粉酶曲霉固态发酵之后用超纯水浸泡离心,得到含有酶的上清液的pH值为6、5,但就是淀粉酶能耐受pH4、5,为了去除更多杂质蛋白质,我把硫酸铵浓度调节到2摩尔每升的同时会控制pH值为4、5,4度过夜之后离心取上清液再调节到pH值7、0,4度放置,离心,又去除一部分杂质蛋白质,上清液直接用pH7、0的疏水层析系统来纯化。 一个纤维素酶的纯化我也用类似的方法,只不过第一步就是用4、0。 硫酸铵就是酸式盐,2M时pH值约为5,4M时更低,用来沉淀蛋白质的时候情况就更复杂了,所以最好知道自己需要的蛋白质的耐受情况,不要搞死了。 透析之前要选用一个不影响自己想要的蛋白质的pH值,硫酸铵沉淀与透析都要保持一致,才能使损失减少。透析时候产生的沉淀不知道就是不就是您想要的蛋白质,不过下次做最好谨慎一点,做我说过的预备实验。 分段盐析的方法 对分离目的蛋白的盐析,最好采用分段盐析。由于不同的蛋白质其溶解度与等电点不同,沉淀时所需的pH值与离子强度也不相同,改变盐的浓度与溶液的pH值,可将混合液中的蛋白质分批盐析分开,这种分离蛋白质
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抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 ·组织培养上清液、血清样品或腹水等 ·硫酸铵（NH4）SO4 ·饱和硫酸铵溶液（SAS） ·蒸馏水 · PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一) ·透析袋 ·超速离心机 · pH计 ·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS） 将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25°C）； 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1；
二、沉淀 1、样品（如腹水）20 000′g 离心30 min，除去细胞碎片； 2、保留上清液并测量体积； 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）； 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min（4°C）。弃上清保留沉淀； 2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v)； 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）； 3、3000′g 离心30 min（4°C），保留上清液； 4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨； 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的； 二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）； 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。 参考文献 1、Burd, R.S., Raymond, C.S., Ratz, C. A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAE – disk. Hybridoma
抗体纯化常见问题回答
用 户园地Q & A 30 鉴于亲和层析技术的发展,抗原抗体之间的特异性相 互作用，使得抗体的纯化相对来说比较简单,一步亲和层析 即可达到90%以上的纯度, 这为科研和实验室使用的抗体 纯化提供很好的解决方案。然而要得到高质量高纯度的抗 体，需要我们从样品处理，纯化介质的选择以及纯化方法 上悉心考虑，这里我们就这些大家常见的问题来讨论。 1，对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品， 有哪些样品处理的方法？ 在纯化前，合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高 纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱，延长使用寿 命。对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂 蛋白，酚红，小分子污染物等等。 腹水中经常含有高浓度的脂蛋白，这些脂蛋白和脂 类物质会堵塞层析柱，最好能在纯化之前去除。方法一是 在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋 白，沉淀可以通过离心除去；方法二PVP能产生一个pH值 依赖的沉淀效应，PVP在pH＝7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球 蛋白。很多时候，可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释 腹水，不仅保证样品的结合pH，还有利于降低黏度。 酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂，虽然 并不直接的影响纯化，但是酚红可能结合到某些纯化介质 上，应该尽可能早的被除去，可以使用脱盐柱除去酚红。 对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除，如 硫酸铵沉淀，羊脂酸沉淀的方法。 最后利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐，把样品换到 合适的缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处的小分 子。更多详细的方法可以参考《抗体纯化手册》。 2，实验室需要纯化小鼠的IgG1，我是选择ProteinG 还是ProteinA？ 首先我们要根据不同的种属亚型参考“相对结合强 度”表（图1）来获取选择哪种配基的指导，针对小鼠的 IgG1， ProteinA结合相对弱，可以选择ProteinG配基的介 质。但由于Protein G结合力较强，因此有时需要pH低于2.0 才能有效洗脱，容易导致某些对酸敏感的抗体聚集沉淀。 此时可以考虑结合力相对较弱的protein A填料，结合缓冲 液中需要加入0.5~3M 的氯化钠以增加结合能力，目标抗体 在pH4.5左右就可以被温和的洗脱。 若实验室有AKTA系统，那么Hitrap ProteinG HP是高分 辨率方便快捷的首选。 若没有AKTA系统，MabTrap抗体纯化试剂盒可以给你 带来最大的快捷和便利，试剂盒含有一个Hitrap ProteinG HP1ml的预装柱，结合，洗脱和中和的缓冲液，一个具有 接头的注射器、以及经过优化的纯化操作规程。 Ab Spin Trap是预装了100ulProteinGHP填料的离心 柱，和标准的小离心机一起使用，仅用20分钟就可以完成 一次小规模的抗体纯化。 ProteinG HP MultiTrap96孔板适用于高通量的筛选。 3，面对ProteinA如此多的配基形式，它们有何区别 和应用？ 蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株 系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结 构域，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他 杂蛋白流穿，具有极高的选择性，通常一步亲和层析就可 达到超过95%的纯度。 ProteinA sepharoseCL-4B，是将从金黄色葡萄球菌表 达纯化出蛋白A通过CNBr的方法偶联在sepharose CL-4B的 介质上，可以纯化体液或细胞培养液中的免疫球蛋白。 nproteinA sepharose4FF，nprteinA即为天然 (Native Protein A)，表示其在生产过程中没有引入任何动物来源的组分。 rproteinA sepharose4FF，重组的蛋白A (rProtein A)， 经基因工程改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位 点定向偶联于琼脂糖骨架上，有效降低空间位阻，增加了 与IgG 的结合能力。同时配基在发酵和纯化过程中没有引 用人源的IgG，避免了人源IgG的污染风险。 rmpProteinA，多位点附着的技术，保证更低的配体 的脱落。一步高度纯化单抗和多抗。 2005年我们推出了新一代的MabSelect ，是第一个使 用高流速琼脂糖凝胶 ( High ?ow Agarose) 作为骨架的新型 蛋白A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计。相比传统 抗体纯化常见问题回答
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抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 ·组织培养上清液、血清样品或腹水等 ·硫酸铵（NH4）SO4 ·饱和硫酸铵溶液（SAS） ·蒸馏水 · PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一) ·透析袋 ·超速离心机 · pH计 ·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS） 将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25°C）； 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1；
二、沉淀 1、样品（如腹水）20 000′g 离心30 min，除去细胞碎片； 2、保留上清液并测量体积； 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）； 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min（4°C）。弃上清保留沉淀； 2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v)； 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）； 3、3000′g 离心30 min（4°C），保留上清液； 4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨； 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的； 二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）； 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。 参考文献
硫酸铵沉淀
硫酸铵沉淀： 有生物活性的蛋白一般在做硫胺沉淀的时候要小心一点。最保险的做法是，把硫酸铵配成饱和溶液，把蛋白溶液置于冰浴上，再把饱和硫胺溶液一滴一滴的加到你的蛋白溶液中，最好边加边搅拌，避免局部硫胺浓度过高，但搅拌的时候注意不要搅出气泡。按照你的比例加完之后，最好放冰箱静置至少2h，充分沉淀后离心即可。 4M的硫酸铵pH值为，在这个酸度下可能会有一些蛋白质变性，要小心。硫酸铵会破坏蛋白质水化层，最好是缓和地加入。边加入边搅拌，如果在磁力搅拌器上搅拌，小漩涡中心有很多泡沫就表示蛋白质变性，使得溶液粘度增加，泡沫难破，那就很难保证你的蛋白质有没有变性了。 溶解度，在一定温度下，某固态物质在100g溶剂中达到饱和状态时所溶解的质量，叫做这种物质在这种溶剂中的溶解度。固体的溶解度是指在一定的温度下，某物质在100克里达到饱和状态时所的克数，用字母s表示，其单位是“g/100g水”。在未注明的情况下，通常溶解度指的是物质在水里的溶解度。 溶液饱和度(化学) 某种溶液的饱和度是指在100g该溶液中溶质在溶液中所占质量分数.一般情况下，一种溶液的饱和度在同一温度下不会变.要想使不饱和溶液饱和度增加可以选择增加溶质.在刚好有晶体析出的时候就是溶液刚好饱和的时候.溶液饱和度不会出现100%
加固体比较好，加得越慢越好。如果加快了，会造成局部浓度过大，造成意想不到的沉淀。 硫酸铵沉淀的时候应该要注意pH值的变化，就我的实验来说，一株产淀粉酶曲霉固态发酵之后用超纯水浸泡离心，得到含有酶的上清液的pH值为，但是淀粉酶能耐受，为了去除更多杂质蛋白质，我把硫酸铵浓度调节到2摩尔每升的同时会控制pH值为，4度过夜之后离心取上清液再调节到pH值，4度放置，离心，又去除一部分杂质蛋白质，上清液直接用的疏水层析系统来纯化。 一个纤维素酶的纯化我也用类似的方法，只不过第一步是用。 硫酸铵是酸式盐，2M时pH值约为5，4M时更低，用来沉淀蛋白质的时候情况就更复杂了，所以最好知道自己需要的蛋白质的耐受情况，不要搞死了。 透析之前要选用一个不影响自己想要的蛋白质的pH值，硫酸铵沉淀和透析都要保持一致，才能使损失减少。透析时候产生的沉淀不知道是不是你想要的蛋白质，不过下次做最好谨慎一点，做我说过的预备实验。 分段盐析的方法
抗体纯化的方法有哪些
抗体纯化的方法有哪些？ 抗体制备出来之后,需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗,既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料就是腹水与细胞培养上清,而通常经过免疫制备 : 抗体非还原型PAGE/kDa 还原型PAGE/kDa IgG 150 50,25 IgM 900 65,25 IgM单体180 65,25 硫酸铵沉淀法: 基本原理:高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜,降低球蛋白的溶解性,就是分离免疫球蛋白的常用方法,而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别,一般用来分离抗体的硫酸铵饱与度在33~50%。 适用于:鼠抗所有亚类、其她种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA 基本操作: 1、过滤、离心腹水或者培养上清得上清; 2、加入饱与硫酸铵至终浓度45%,静置沉淀蛋白; 3、沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解,用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐; 4、过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱,PBS或硼酸盐(含0、02%叠氮钠)缓冲液洗脱; 5、电泳检测分子量大小,分光光度法测定抗体浓度; 6、抗体保存浓度在0、1-30 mg/mL适宜,-20 ℃保存不超过一个月,避免反复冻融。 亲与层析法 基本原理:基因工程改造的protein A与protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段,将protein A与protein G结合到柱料上,通过亲与层析的方式,可将IgG及其亚类与片段纯化出来。 成员介绍:protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁,分子量42 kDa,由spa基因编码,具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域,每个结构域由三个α螺旋构成。 protein A的B结构域
辛酸硫酸铵纯化方法
所需溶液配制： 1.0.06mol/L pH=4.8醋酸盐缓冲液：无水醋酸钠0.29g，冰醋酸0.141mL，纯水定容至100mL。 2.2mol/L氢氧化钠溶液：16g氢氧化钠固体用于200ml纯水中。 3.2mol/L盐酸溶液：取33m L36.4%的浓盐酸定容至200mL纯水中。 4.0.1mol/L PBS缓冲液：80.0 NaCl，KCl 2.0g，Na2HPO4· 12H2O 29.0g，KH2PO4 2.0g， 加超纯水定容至1L。 单克隆抗体采用辛酸-硫酸铵方法纯化，具体步骤如下： （1）将腹水从-20°C冰箱拿出室温解冻。腹水用双层滤纸过滤，初步除去杂质、脂肪及细胞碎片。4°C,12000r/min，离心15min，收集上清，弃沉淀。精确定量腹水体积。 （2）一份体积的腹水与2-4份体积的醋酸盐缓冲液磁力搅拌混匀，用2mol/L HCL 调PH至4.5-4.8。 （3）磁力搅拌下缓慢加入正辛酸，33μL/mL腹水，加完后室温磁力搅拌半小时，后置4°C静置2h以上。 （4）4°C ,12000r/min，离心5min，收集上清，双层滤纸过滤，收集滤液。 （5）量取滤液体积，加入1/10体积的0.1M pH=7.4 的PBS,用2mol/L NaOH（记录NaOH 体积）调pH至7.4。 （6）将上清冰浴预冷，加硫酸铵固体至0.277g/mL，边加边搅拌，并于30min内加完，置4°C过夜。 （7）12000r/min，离心15min，弃上清。用一定体积的0.01mol/LPBS溶解沉淀。用PB 透析两天后换0.01mol/LPBS 透析两天。收集透析液，12000r/min，离心15min，取上清，置-20°C预冻后真空冻干成粉保存。 张道宏师姐版本：用1/10原腹水体积的0.01mol/L pH值7.4 PBS溶解沉淀；对0.01mol/L pH值7.4的PBS透析一天，离心去掉不溶杂质，用纯水进行透析，优球蛋白析出后离心收集澄清抗体溶液，置于-20°C预冻；冻干保存。
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抗体的纯化? 第一节硫酸铵沉淀法? 基本原理? 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。? 试剂及仪器 · 组织培养上清液、血清样品或腹水等 · 硫酸铵（NH4）SO4? · 饱和硫酸铵溶液（SAS） · 蒸馏水 · PBS(含L叠氮钠) (见附录一) · 透析袋 · 超速离心机 · pH计 · 磁力搅拌器? 实验步骤? 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。? 一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS） 将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（mol/L, 25°C）； 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1；?
二、沉淀 1、样品（如腹水）20 000′g 离心30 min，除去细胞碎片； 2、保留上清液并测量体积； 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）； 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。? 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min（4°C）。弃上清保留沉淀； 2、将沉淀溶于少量（10-20ml）L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对L 叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。? 应用提示? 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为:1 (v/v)； 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）； 3、3000′g 离心30 min（4°C），保留上清液； 4、上清液再加SAS到:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨； 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的； 二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）； 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。? 参考文献? 1、 Burd, ., Raymond, ., Ratz, C. A and Dunn, (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAE – disk. Hybridoma 12,