苯并[a]芘的测定
食用油中苯并(a)芘的快速检测 胶体金免疫层析法(KJ201910)
附件10食用油中苯并（a）芘的快速检测胶体金免疫层析法(KJ201910)1 范围本方法规定了食用油中苯并（a）芘的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于食用油中苯并（a）芘的快速测定。
2 原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。
样品中的苯并（a）芘经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。
通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中苯并（a）芘进行定性判定。
3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 试剂3.1.1正己烷：色谱纯。
3.1.2乙腈：色谱纯。
3.1.3二甲基亚砜（DMSO）。
3.1.4NaH2PO4•2H2O。
3.1.5Na2HPO4•12H2O。
3.1.6氯化钠。
3.1.7吐温-20。
3.1.8氢氧化钠溶液（2 mol/L）：称取80g氢氧化钠用水溶解，并定容至1L。
3.1.9PBST溶液：称取0.2965 g NaH2PO4•2H2O、2.9 g Na2HPO4•12H2O、8.76 g氯化钠与0.55 g 吐温-20用水溶解并定容至1 L。
3.2 参考物质苯并（a）芘参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均≥95%。
表1 苯并（a）芘参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量注：或等同可溯源物质。
3.3 标准溶液的配制苯并（a）芘标准储备液（0.1mg/mL）：精密称取适量苯并（a）芘标准品（3.2），置于10 mL 容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.1mg/mL的苯并（a）芘标准储备液；或可直接购买苯并（a）芘标准储备液。
0 ℃~5 ℃避光保存备用，有效期1年。
3.4 材料苯并（a）芘胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为食用油。
3.4.1金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。
动植物油脂中苯并(a)芘测定方法的制定及应用
动植物油脂中苯并(a)芘测定方法的制定及应
用
1 苯并(a)芘
苯并(a)芘（PAHs）是一类有毒多环芳香烃，包含一个或多个六元
环结构，通常以芘为主。
具有易燃性、有毒性和难降解等特点，能够
进入生物体，其中芘是16种重要的苯并(a)芘化合物之一，具有致癌、致畸、致突变、免疫毒性和其他潜在危害。
2 植物油脂中的苯并(a)芘
植物油脂中的苯并(a)芘是与农药运用、农作物栽培过程和烹调方
式有关的，可随植物油脂中脂肪吸收，存在机械污染也会使其含量增加。
而植物油脂一般都会在生活中消费，长期摄入会对人体产生危害。
3 植物油脂中苯并(a)芘测定方法
植物油脂中苯并(a)芘测定方法一般采用色谱-质谱联用仪，利用
柱质谱原理液相色谱婆罗门芘离子（m/z 212）测定植物油脂中苯并(a)芘含量。
测定方法要求用户必须熟悉色谱-质谱联用仪操作程序，准确
掌握柱层析原理及操作技术。
4 植物油脂中苯并(a)芘测定方法的使用
植物油脂中苯并(a)芘的检测标准建立后，植物油脂中苯并(a)芘
测定方法得到了广泛的应用，它可以用来监测植物油脂中苯并(a)芘的
分布，并可以帮助相关部门科学决策，防治环境污染，保护民众的健康。
苯并[a]芘的测定
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• 4、操作方法 • （1）样品提取 • 粮食及低水分含量食品 • 回流抽提，碱皂化6~8h（90下） • 皂化液趁热转移至分液滤斗 • 洗涤接收瓶（50mL95%乙醇） • 加水（100mL）振摇提取 • 静置分层 • 下层二次提取（70mL环已烷） • 合并环已烷 • 洗涤环已烷层（水，100mL×3） • 洗涤水环已烷提取（30mL×2） • 浓缩至40mL（60 ℃水浴中）
• （５）计算
• 相F 对 F荧40光6 强(度F401 F411) / 2
x
ms F
( Fi
F0 )
m V2 V1
• （二）HPLC法
• １、原理
•
用KOH-甲醇水（1:1）溶液皂化样品中脂肪，环已烷
提取多环芳烃（PAH），再经60%硫酸净化，Sephadex LH-
20色谱柱富集样品中PAH，用高效液相色谱仪检测。
• 二、食品中苯并[a]芘的来源 ➢ BaP是含碳燃料及有机化合物热解过程中的产
物，是煤、石油、天然气、木材等不完全燃烧 的产物。 • 空气中BaP含量为0.01~100μg/m3; • 地表水中BaP含量为0.03~0.1μg/L; • 土壤中BaP含量为0~400μg/kg
➢在熏烤、烘烤过程中形成 • 燃烧产物与食品的直接接触、烟尘与食品的
• 植物油
环已烷100mL
DMF40mL×3
称样20g
分液滤斗
提取
环已烷层 DMF层
环已烷40mL
DMF层
提取
环已烷层 弃去 2%硫酸钠240mL
DMF层
分液滤斗
环已烷100mL×2
混匀 提取
• 鱼、肉及其制品 • 称样， • 加无水硫酸钠（1：1或1：2）搅拌 • 环已烷抽提取 • 蔬菜 • 称样、晾干、加丙酮（150mL）捣碎， • 过滤至分液滤斗 • 加水、 环已烷提取 • 环已烷重复提取 • 环已烷层洗涤（水，125mL×2） • 浓缩至25mL
苯并[a]芘的测定
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植物油
环已烷100mL DMF40mL×3
称样20g
分液滤斗
提取
环已烷层 DMF层
环已烷40mL
DMF层
提取
环已烷层 弃去 2%硫酸钠240mL
DMF层
分液滤斗
环已烷100mL×2
混匀 提取
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鱼、肉及其制品 称样， 加无水硫酸钠（1：1或1：2）搅拌 环已烷抽提取
蔬菜 称样、晾干、加丙酮（150mL）捣碎， 过滤至分液滤斗 加水、 环已烷提取 环已烷重复提取 环已烷层洗涤（水，125mL×2） 浓缩至25mL
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加工环节的污染 设备管道 酱油、醋、酒、饮料 包装材料 糖果、面包、冷饮包装用蜡纸 润滑油等
工业废水、废气的污染 三废的排放 沥青的利用（沥青中苯并芘含量为2.5~3.5%）
细菌、原生生物、淡水藻类及某些高等植物的组织内 合成 藻类、水生植物BaP含量为0.005 μg/kg 植物BaP含量0.01~0.02μg/kg
（５）计算 相对荧光强度
F F406 (F401 F411) / 2
x
ms F
( Fi
F0 )
m V2 V1
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（二）HPLC法 １、原理
用KOH-甲醇水（1:1）溶液皂化样品中脂肪，环已烷提 取多环芳烃（PAH），再经60%硫酸净化，Sephadex LH20色谱柱富集样品中PAH，用高效液相色谱仪检测。 ２、操作方法 （１）皂化
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3、仪器 脂肪抽提器 层析柱（10cm×350cm） 层析缸 K-D浓缩器 紫外灯 荧光分光光度计
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4、操作方法 （1）样品提取 粮食及低水分含量食品
空气质量 苯并[a]芘测定 高效液相色谱法
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2 3
(如图所示) 将采集到固体颗粒物用滤纸包住，置于提取器 3 中，提取器的下端勺 盛有溶剂的圆底烧瓶相连，上面接回流冷凝管 1。园底烧瓶置于恒温水浴 中，使溶剂沸腾，蒸气通过提取器的支管上升，被冷凝后滴入提取器 3 中，溶剂和固体接触进行萃取，当溶剂面超过虹吸管 2 的最高处时，含有 萃取物的溶剂虹吸回烧瓶，因而萃取出一部分物质。 实验时能够观察到,随着回流的进行,当提取筒中回流下的溶剂的液 面稍高于索氏提取器的虹吸管顶端时,提取筒中的溶剂发生虹吸并全部流
4
本标准样品处理采用了索氏提取的方法。被测样品通过有机溶剂在恒 温的条件下反复浓缩提取，被测样品被充分的抽提浓缩出来，提高了分析 的灵敏度和精密度。
四、国内外相关标准现状
目前国内外研究测定B[a]P含量的方法很多，我国大气中B[a]P的方 法有荧光分光光度法、气相色谱法、液相色谱法。荧光法灵敏度高，但是 需要纸层析，分离能力差。气相色谱法使用毛细管进行分离，具有很高的 分离度，尤其是使用色质联用仪可以同时进行定性和和定量分析，适合测 定复杂样品中PAHs的分析，HPLC法由于使用紫外检测器，具有高的灵敏度 和检测限，已成为B[a]P的首选方法。
烧或使用的地方都有可能产生 B[a]P, B[a]P 污染物已成为环境污染物中
极其重要的物质。由于环境标准及对检测方法的要求，我们对环境空气中
3
B[a]P 的检测尤其重要。 因为B[a]P的测定结果的准确性受到样品采集和样品的处理过程诸多
因素的影响，而目前我国现行的标准《环境空气 苯并[a]芘测定 高效液 相色谱法》（GB/T 15439-1995）因为样品处理方法有一定的局限性，一些 条款表述不清等因素，开展《环境空气 苯并[a]芘测定 高效液相色谱法》 （GB/T 15439-1995）的修订工作，将对环境空气污染调查和控制研究提 供基础数据，对保护环境、保障人民健康都具有重大意义。
食品中苯并[a]芘的测定
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环已烷重复提取
环已烷层洗涤（水，125mL×2）
浓缩至25mL
（2）净化 装柱 加样吸附 洗脱（苯30mL） 减压浓缩至0.1~0.5mL
（3）分离 点样 展开（95%乙醇：二氯甲烷=2：
1） 观察（紫外灯照射） 剪下斑点，加苯浸泡溶解。
（4）测定
食品中苯并[a]芘的测定
一、苯并[a]芘的结构与性质
简称为BaP
针状结晶，沸点310~320℃
溶解特性：水中溶解度为0.004~0.012mg/L
烷、苯、甲苯、
易溶于石油醚、环已烷、已
二甲苯、丙酮
稍溶于乙醇、甲醇
化学性质：稳定，常温下不与硫酸作用，能与硝酸、
高氯酸 反应
碱性条件下稳定
荧光特性：紫外线（360nm）下产生典型紫色荧光
欧共体
0.03ug/kg
调料
德国
1.0ug/kg
肉及肉制品
意大利
食品及饮料
荷兰
1.0ug/kg
肉制品
北欧国家 肉制品
1.0ug/kg
3、一些国家的每日允许摄入量(ug)
0.03ug/kg
五、防治措施 ➢ 加强环境治理 ➢ 改变生产方式 ➢ 改进烹调和加工方法 ➢ 改变饮食习惯 ➢ 去毒处理
六、测定方法
苯并[a]芘标准液
苯并[a]芘标准贮备液：100ug/mL
3、仪器
脂肪抽提器
层析柱（10cm×350cm）
层析缸
K-D浓缩器
紫外灯
荧光分光光度计
4、操作方法 （1）样品提取 粮食及低水分含量食品 回流抽提，碱皂化6~8h（90下） 皂化液趁热转移至分液滤斗 洗涤接收瓶（50mL95%乙醇） 加水（100mL）振摇提取 静置分层 下层二次提取（70mL环已烷） 合并环已烷 洗涤环已烷层（水，100mL×3） 洗涤水环已烷提取（30mL×2） 浓缩至40mL（60 ℃水浴中）
大气中苯并检出方法及检出限
大气中苯并(a)芘的测定方法苯并〔a〕芘是多环芳香烃类化合物，又名3，4－苯并芘，简称Bap，分子式C20H12；分子量253.23；沸点475℃；熔点179℃；相对密度1.351。
3，4－苯并芘纯品为无色或微黄色针状结晶，在水中溶解度较小，易溶于苯、氯仿、乙醚、丙酮、环己烷、二甲苯等有机溶剂。
在苯中溶解呈蓝色或紫色荧光，在浓硫酸中呈桔红色并伴有绿色荧光。
3，4－苯并芘是环境中普遍存在的对动物致癌性很强的一种物质，主要是含碳燃料及有机物热解过程中的产物。
煤炭、石油等在无氧加热裂解过程中产生的烷烃、烯烃，经过脱氢、聚合，常可产生一定数量的3，4－苯并芘。
工厂烟气中的悬浮颗粒物上吸附有3，4－苯并芘，散布在大气，一部分降落到水面和陆地上，从而污染水源和土壤。
炼焦、化工、染料等工厂排出的工业废水中以及熏制食品、香烟烟雾中均含有3，4－苯并芘。
3，4－苯并芘对动物具有局部和全身的致癌作用，对猴子反复皮下注射可在局部形成肿瘤，从气管反复滴注可形成肺癌，在小鼠身上涂抹可使小鼠诱发皮肤癌。
流行病学调查认为人的肺癌与环境中3，4－苯并芘的含量之间有着极为密切关系。
虽然目前各国尚无公认3，4－苯并芘的最高容许浓度，但通过动物试验和现场调查提出了一些建议，例如：车间空气中3，4－苯并芘最高容许浓度为0.14μg/m3；居民区大气最高容许浓度为10－3μg/m3。
飘尘上有机物的组分异常复杂，仅其中多环芳烃(简称PAH)就有几百种之多。
测定3，4－苯并芘的方法很多，主要是将3，4－苯并芘与其他多环芳烃分开，常用的有柱层、纸层、薄层、气相色谱、高压液相色谱、气质联机等一系列分离体系。
其中以气相色谱法分离PAH尤为重要。
利用气相色谱法分离迅速、效能高，再与薄层层析结合起来，可以迅速判断提取物中某些PAH的存在。
特别是用毛细管色谱与质谱及核磁共振谱联用，从城市悬浮颗粒物、烟草焦油及汽车废气中，可分离出100多种PAH，极大地发挥了气相色谱的分离效能。
生活饮用水 苯并[a]芘的测定 高压液相色谱法
![生活饮用水 苯并[a]芘的测定 高压液相色谱法](https://img.taocdn.com/s3/m/78dede026bd97f192279e9f4.png)
生活饮用水苯并[a]芘的测定高压液相色谱法1. 适用范围本方法规定了用高压液相色谱法测定生活饮用水及其水源水中的苯并[a]芘。
本法适用于生活饮用水及其水源水中苯并[a]芘的测定。
本法最低检测质量为0.07ng，若取500mL水样测定，本法最低检测质量浓度为1.4ng/L。
2. 原理水中苯并[a]芘及其他芳烃能被环己烷萃取，萃取液经活性氧化铝吸附净化，以苯洗脱、浓缩后，可用液相色谱一荧光检测器定量。
3. 试剂所用试剂和材料应进行空白试验，即通过全部操作过程，证明无干扰物质存在。
所有试剂使用前均应采用0.45µm过滤膜过滤。
3.1 活性氧化铝：取250g100目~200目层析用中性氧化铝(A12O3)于140℃活化4h，冷却后装瓶，储于干燥器内，备用。
3.2 盐酸溶液(1+19)：取5mL盐酸(ρ20=1.19g/mL)，加至95mL纯水中，混匀。
3.3 玻璃棉：用盐酸溶液浸泡过夜，然后用纯水洗至中性。
用氢氧化钠溶液浸泡过夜，再以纯水洗至中性，于105℃烘干备用。
3.4 甲醇：HPLC级。
3.5 超纯水：电阻率大于18.0MΩ。
3.6 活性炭：取50g(20目~40目)活性炭用盐酸溶液浸泡过夜，用纯水洗至中性，于105℃烘干。
再用环己烷浸泡过夜，滤干后在氮气流下于400℃活化4h，冷后储于磨口瓶中备用。
3.7 环己烷：通过活性炭层析柱后重蒸馏，取此环己烷70mL浓缩至1.0mL，浓缩液必须测不出苯并[a]芘的存在，方可使用。
3.8 苯：重蒸馏。
3.9 无水硫酸钠：40℃烘烤4h，冷却后储于磨口瓶中备用。
3.10 氢氧化钠溶液：称取5g氢氧化钠，用纯水溶解，并稀释至100mL。
4. 仪器4.1 髙压液相色谱仪：4.1.1 荧光检测器。
4.1.2 记录仪。
4.1.3 色谱柱。
A色谱柱类型：不锈钢柱，长150mm，内径3.9mm。
B 填充物：用Spherisorb C18(5µm)。
4.2 微量注射器：25µL，针头锥度为90度。
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二、食品中苯并[a]芘的来源
BaP是含碳燃料及有机化合物热解过程中的产物，是
煤、石油、天然气、木材等不完全燃烧的产物。
空气中BaP含量为0.01~100μg/m3; 地表水中BaP含量为0.03~0.1μg/L;
土壤中BaP含量为0~400μg/kg
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加工环节的污染 设备管道 包装材料 酱油、醋、酒、饮料 糖果、面包、冷饮包装用蜡纸
润滑油等
工业废水、废气的污染 三废的排放 沥青的利用（沥青中苯并芘含量为2.5~3.5%） 细菌、原生生物、淡水藻类及某些高等植物的组织内 合成 藻类、水生植物BaP含量为0.005 μg/kg 植物BaP含量0.01~0.02μg/kg
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在熏烤、烘烤过程中形成 燃烧产物与食品的直接接触、烟尘与食品的直接接触
粮食烘干
高温下脂肪、胆固醇等成分的热解或热聚（10~70倍）
高温下食品的焦化或炭化
淀粉390℃时产生 0.7μg/kg 650 ℃时产生17μg/kg 650 ℃下葡萄糖产生7mg/kg、脂肪酸产生88mg/kg
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0.02~0.14
英国
荷兰
0.48
0.12~0.42
意大利
0.1~0.3
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奥地利
0.36
五、防治措施
加强环境治理
改变生产方式
改进烹调和加工方法 改变饮食习惯 去毒处理
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六、测定方法
（一）分配柱层析净化荧光测定法 1.原理 样品先用有机溶剂提取，或经皂化后提取，再将提 取液经液－液分配或色谱柱净化，然后在乙酰化滤纸上 分离苯并(a)芘，因苯并(a)芘在紫外光照射下呈蓝紫色 荧光斑点，将分离后有苯并(a)芘的滤纸部分剪下，用 溶剂浸出后，用荧光分光光度计测荧光强度与标准比较 定量。
苯并[a]芘标准贮备液：100ug/mL 苯并[a]芘标准使用液：1ug/mL, 0.1ug/mL
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3、仪器 脂肪抽提器 层析柱（10cm×350cm） 层析缸 K-D浓缩器 紫外灯 荧光分光光度计
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4、操作方法 （1）样品提取 粮食及低水分含量食品 回流抽提，碱皂化6~8h（90下） 皂化液趁热转移至分液滤斗 洗涤接收瓶（50mL95%乙醇） 加水（100mL）振摇提取 静臵分层 下层二次提取（70mL环已烷） 合并环已烷 洗涤环已烷层（水，100mL×3） 洗涤水环已烷提取（30mL×2） 浓缩至40mL（60 ℃水浴中）
指标 ≦10 ≦10 ≦10 ≦5 ≦5 ≦5
2、其它一些国家、地区标准
欧共体 德国 意大利 荷兰 调料 肉及肉制品 食品及饮料 肉制品 0.03ug/kg 1.0ug/kg 0.03ug/kg 1.0ug/kg 1.0ug/kg
北欧国家 肉制品
3、一些国家的每日允许摄入量(ug)
美国
德国
0.16~1.6
三、BaP的危害 BaP为致癌、致突变化学物质，可致多种癌症，并具有致 畸性和遗传毒性。 四、限量标准 1、国家标准允许限量标准
品种 肉 制 品 烧烤猪肉、禽肉 叉烧肉、羊肉串 火腿、板鸭 烟熏鱼 熏鸡、熏马肉 熏红肠、香肠
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指标 ≦5 ≦5 ≦5 ≦5 ≦5 ≦5 粮 食 植 物 油
品种 豆油、花生油 植物油 茶油 其它油 稻谷 小麦 大麦
食品中苯并[a]芘的测定
一、苯并[a]芘的结构与性质 简称为BaP
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针状结晶，沸点310~320℃
溶解特性：水中溶解度为0.004~0.012mg/L 二甲苯、丙酮 稍溶于乙醇、甲醇 化学性质：稳定，常温下不与硫酸作用，能与硝酸、 高氯酸 反应
易溶于石油醚、环已烷、已烷、苯、甲苯、
碱性条件下稳定
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（2）净化 装柱 加样吸附 洗脱（苯30mL） 减压浓缩至0.1~0.5mL
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（3）分离 点样 展开（95%乙醇：二氯甲烷=2：1） 观察（紫外灯照射） 剪下斑点，加苯浸泡溶解。
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（4）测定 测定标准斑点及样品斑点的荧光激发光谱和发射光谱 读取F401nm、F406nm、F411nm （５）计算 相对荧光强度
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（３）富集 加样于Sephadex LH-20柱上， 异丙醇洗脱 浓缩至干 甲醇溶解、定容（１mL） （４）测定 色谱条件：流动相甲醇：水（75:25）流速1.5mL/min 色谱柱ODS 4.6mm×250mm 柱温30℃ 紫外检测器（287nm） 进样测定峰面积，比较定量。
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部分食品中的Bap含量（μg/kg）
种类 熏奶酪 熏鱼 熏香肠 熏火腿 熏排骨 炸油条 烘大饼
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含量 0.01~5.6 1.3~15.2 0.8~2.5 3.2 0.34~5.0 1.4~11 3.0~7.0
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种类 腊肉 烤牛肉 烤羊肉串 烤鸭皮 烤鸭 香肠 蛋清肠
含量 0.86~27.6 0.41~1.58 1~2.84 0.75~2.39 0.06 0.3~0.5 0.18~0.3
溶剂提取 样品 皂化提取
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液液分配 柱层析
纸层析
荧光分析
2、试剂
试剂需重蒸，并检查其荧光特性 吸附剂：硅镁型吸附剂 水洗并活化，加5%水减活 中性氧化铝 活化（120℃ 4h） 乙酰化滤纸制备：
滤纸（30cm×4cm）→乙酰化（180mL苯：130mL乙 酸酐：0.1mL硫酸）6h,并浸泡过夜→取出风干 苯并[a]芘标准液
F F406 ( F401 F411 ) / 2 ms ( Fi F0 ) x F V2 m V1
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（二）HPLC法 １、原理 用KOH-甲醇水（1:1）溶液皂化样品中脂肪，环已烷提 取多环芳烃（PAH），再经60%硫酸净化，Sephadex LH20色谱柱富集样品中PAH，用高效液相色谱仪检测。 ２、操作方法 （１）皂化 称取100g样品直接皂化 （２）提取、净化 环已烷萃取，甲醇水洗涤、水洗涤 浓缩 60%硫酸洗涤、水洗涤 过滤（过硅胶、无水硫酸钠）、滤液浓缩
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植物油
环已烷100mL DMF40mL×3 称样20g 分液滤斗 提取 环已烷层 DMF层
环已烷40mL
环已烷层 弃去 2%硫酸钠240mL DMF层 分液滤斗 混匀 环已烷100mL×2 提取
DMF层
提取
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鱼、肉及其制品 称样， 加无水硫酸钠（1：1或1：2）搅拌 环已烷抽提取 蔬菜 称样、晾干、加丙酮（150mL）捣碎， 过滤至分液滤斗 加水、 环已烷提取 环已烷重复提取 环已烷层洗涤（水，125mL×2） 浓缩至25mL