食品微生物检验学实验指导

食品微生物检验学实验指导课时分配及主要实验内容(总学时30,其中动检20,动食安30)实验1 微生物检验常规试验预备 3主要内容：菌落总数测定和大肠菌群检验所需的1）研钵、剪刀、镊子、吸管、平皿的包扎与干热灭菌；2）实验所需培养基（营养琼脂、EMB琼脂、乳糖胆盐发酵管）和生理盐水的配制、分装、包扎和高压蒸汽灭菌。

实验2 菌落总数测定 3主要内容：1）样品的称取、匀浆和稀释；2）接种与琼脂倾注；3）24h后菌落计数及结果报告。

实验3 大肠菌群MPN测定 3主要内容：1）样品的称取、匀浆和稀释；2）接种于乳糖胆盐发酵管，培养；3）24h后观察产酸产气情况，划线于EMB琼脂，培养；3）48h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；4）查MPN检索表，报告结果。

实验4 蜡样芽孢杆菌检验 3主要内容：1）将细菌肉汤培养物划线于普通琼脂、MYP琼脂，点种于卵黄琼脂平板，接种生化培养基，培养；2）24h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；3）观察主要生化试验结果。

4）报告。

实验5 致病性球菌检验 3主要内容：1）将金黄色葡萄球菌和链球菌肉汤培养物划线于普通琼脂、血液琼脂，接种生化培养基，进行纸片法药敏试验，培养；2）24h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；3）观察主要生化试验结果和药敏试验结果。

4）报告。

实验6 魏氏梭菌检验 3主要内容：1）形态及染色特性观察；2）细菌厌氧培养；3）家兔“泡沫肝”试验实验7 霉菌检验 2主要内容：1）观察曲霉、毛霉和青霉在PDA琼脂上的菌落特性；2）挑取霉菌培养物制备压片，在显微镜下观察霉菌菌丝、孢子等结构。

实验8 肉的微生物学检验 2主要内容：1）鲜肉的感官性状观察；2）鲜肉压印片制备与镜检、细菌计数；3）微生物毒素呈色反应。

实验9 乳的微生物学检验 2主要内容：1）鲜乳的感官性状观察；2）乳的涂片制备与镜检、细菌计数；3）美兰还原试验。

实验10 食品中沙门氏菌的检验 6主要内容：1）沙门氏菌检验所需培养基的制备；2）细菌分离与菌落挑选；3）细菌生化试验；4）血清学鉴定；5）结果报告。

实验一微生物检验常规试验预备[目的与要求]1.熟悉菌落总数测定和大肠菌群检验所需的各种培养基的制备。

熟悉高压蒸汽灭菌器的使用。

2.熟悉玻璃器皿的包装与干热灭菌方法。

[主要内容]：1 研钵、剪刀、镊子、吸管、平皿的包扎与干热灭菌。

2 实验所需培养基（营养琼脂、EMB琼脂、乳糖胆盐发酵管）和生理盐水的配制、分装、包扎和高压蒸汽灭菌。

1）配制700 mL生理盐水（0.9%NaCl），分别分装与5个盐水瓶，每瓶90 mL；分装18支试管，每管9 mL。

2）配制乳糖胆盐培养基（发酵管）200 mL，并分装于小试管各3 mL，每管中加入一个充满培养基的小倒管，注意一定不能有气泡。

（配方：2%蛋白胨，0.5%猪胆盐，1%乳糖，调pH7.4，然后加入0.4%溴甲酚紫2.5ml/100ml）3）配制普通琼脂培养基400ML，分装于2 个三角瓶。

（0.5%NaCl，1%蛋白胨，0.3%牛肉粉（膏），pH7.4，琼脂粉1.5%）4）配制伊红美蓝培养基300 mL。

（配方：蛋白胨1%，NaCl 0.5%，牛肉膏0.3%，pH7.4，琼脂粉1.5%，加热溶化后加入乳糖1%、2%伊红水溶液2 mL/1000 mL、0.65%美蓝1 mL/1000 mL）5）TTC培养基（1）2%乳糖发酵管40支，每管2.5ml（2%乳糖，2%蛋白胨）。

（2）TTC培养液100ml（2%蛋白胨，1%Nacl，1%Na2HPO4.12H2O,0.4%十二烷基硫酸钠，PH7.4）（3）灭菌后加10%TTC8ml后分装于（1），每管加2.5ml。

6）DC培养基（0.5%蛋白胨，0.5%Nacl，1%乳糖，0.3%K2HPO4.3H2O，0.2%柠檬酸铁铵，琼脂粉0.7%）溶于水后调PH7.2，加入10%去氧胆酸钠1ml及0.4%溴麝香草酚兰1.6ml。

[思考题]1 配制培养基时的一般原则和注意事项？2 使用高压灭菌器和恒温干燥箱的注意事项？实验二菌落总数测定[目的与要求]通过本试验要求掌握食品的菌落总数测定的方法，菌落计数和报告方式，以及经常食用的各类动物性食品的菌落总数标准。

菌落总数是指食品检样经过适当处理，在一定的条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数，其也是判定食品被污染程度的标志。

[实验器材及试剂]温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液，等。

[实验内容]（一）检样稀释及培养：1. 以无菌操作，将检样2 5 g（或2 5mL）剪碎放于含有2 5 0 mL（或2 2 5 mL）灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1：10的均匀稀释液。

2. 用1mL灭菌吸管，吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管中振摇试管混合均匀，作成1：100倍稀释。

3. 另取lmL灭菌吸管，按（2）操作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次换一只1mL 灭菌吸管。

4根据卫生标准要求或对样品污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，用吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作2个平皿。

5. 稀释液移入平皿后，应立即将冷至46 ℃左右营养琼脂培养基（可放置46℃水浴中保温）注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有lmL灭菌稀释液的灭菌平皿内，作空白对照。

6. 待琼脂凝固后，翻转平板，置37℃温箱内培养2 4±2h时（肉、水产、乳、蛋为48±2h）取出，计算平皿内菌落数，乘以稀释倍数，即得每g（mL）样品所含菌落总数。

（二）菌落计数方法作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜观察，以防遗漏。

在记下各皿的菌落数后，求出同稀释度的各皿平均菌落数。

（三）菌落计数的报告包括三步。

1．平板菌落数的选择选取菌落数在30～3 0 0之间的平板作为菌落总数测定标准。

一个稀释度使用两个平板应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。

2. 稀释度选择（1）选择平均菌落数在30～300之间，乘稀释倍数。

（2）若两个稀释度，其菌落数均在30～300之间，则视二者之比来决定。

比值小于或等于2，应报告平均数，大于2则报告其较小的数字。

（3）若所有稀释度的平均菌落数均较大于300，则应按稀释度最高的平均数乘以稀释倍数报告。

（4）若所有稀释度平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低平均数乘以稀释倍数。

（5）若所有稀释度均无菌落的生长，则以小于（＜）1乘以最低稀释倍数报告之。

（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以其稀释倍数。

3．菌落数的报告菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示，详见表2－1。

[思考题]1 菌落总数的食品卫生学意义？2 影响本实验结果的因素有哪些？表2-1 稀释度选择及菌落数报告方式实验三大肠菌群数的测定[目的与要求]1．掌握大肠菌群MPN的测定原理与方法，及实验结果报告方式。

2．熟悉检验中各种培养基的配制。

3．了解大肠菌群的食品卫生学意义[原理]大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。

它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。

食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称MPN）表示。

[实验器材及试剂]样品：乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。

温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液、乳糖胆盐发酵管、伊红美兰琼脂、乳糖发酵管、DC半固体培养基、TTC乳糖培养基、灭菌中性定性滤纸片，等。

[实验内容]一、常规检验法1检样稀释及培养取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同,做成1:10的均匀稀释液为检样。

同一稀释度在做菌落总数的测定的同时接种乳糖胆盐发酵管，并且用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌种作对照。

2乳糖发酵试验根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。

接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵管对照。

置36±1℃温箱内,培养24±2小时,如所有发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。

3 分离培养将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。

然后置36±1℃温箱内，培养18～24小时后取出, 观察菌落形态,并作革兰氏染色和证实试验。

4 证实试验在上述平板上,挑取可疑大肠菌落1～2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱培养24±2小时,观察产气情况,凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性.5 报告根据证实大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表(见附录)报告每100ml(克)食品中大肠菌群的最可能数.二、快速检验法（一）T T C（氯化三苯四氮唑）显色快速法样品处理同常规法。

具体操作步骤：1．接种每份样品以无菌操作接种lmL、0．lmL、0．01mL各三管于TTC乳糖培养基中，如接种量为10mL，则用三倍TTC乳糖培养基。

2．培养接种后，置35－37℃温箱中培养18－24h。

3．结果判定观察TTC乳糖培养基呈色和产气情况。

按下列标准进行判定。

见表3-1，表3－1 显色法的大肠菌群结果判定4．结果报告根据阳性管数查MPN检索表，得出结果并报告之。

5．注意事项观察产气时，如小导管内有肉眼可见气泡，均为产气阳性，另要注意导管有无被沉淀物堵塞，如轻轻振动试管，有小气泡上升者仍为阳性。

（二）DC（去氧胆酸钠）半固体试管快速法样品稀释同常规法，具体操作步骤：1. 接种液体样品选择原液、1：10、l：100三个稀释度的样品液，每个稀释度取三个1mL，分别放入灭菌试管中。