分子生态学实验步骤及原理总结
分子生物学实验方法与步骤【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
常用分子实验步骤及原理
个人DNA的多态性分析：PV92斑马鱼和小鼠胚胎干细胞（mES）RNA的分离、检测和定量转基因猪的GFP 蛋白质的提取 & Western BlottingⅠ 蛋白质的提取1. 将20ulPMSF 加入2ml 的RIPA buffer ，剧烈涡旋。
2. 用液氮研磨肌肉组织。
3. 将磨好的粉末转移到两个空的1.5ml 的离心管中，加入0.3ml 的PIPA buffer 。
4. 剧烈涡旋约15sec ，涡旋后在冰上放置1min ，重复操作2~3次。
5. 将离心管于冰上孵育10min 。
6. 于4℃下，12000g 离心5min 。
7. 将离心管转移到冰上，此时可以观察到分层的出现，将上清液转移到新的离心管中，弃去沉淀。
8. 使用酶标仪检测蛋白质提取液中蛋白质的含量和纯度。
Ⅱ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 按要求洗干净，擦干，准备好垂直电泳槽。
2. 按照以下比例（10ml 体系）制备20ml12%的分离胶。
每个电泳槽使用7ml ，在室温下为浓缩胶留下足够的空间，轻轻在顶层加满去离子水覆盖，以阻止空气中氧对聚合的抑制作用。
刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合。
再静置片刻使聚合完全。
3.先倒去并已聚合好的分离胶上层的水，再用滤纸吸干残留的水液。
按下列配方制备10混合后分别取3ml注入分离胶上端，插入梳子应小心避免气泡。
4.在浓缩胶聚合的同时，取150样品与50ul的4xloading buffer按比例混合，轻柔混匀，再使用RIPA和PMSF的mix按照相同比例配两个阴性对照。
100℃加热10分钟以变性蛋白（电磁炉、锅），加热后存放于冰上。
5.浓缩胶聚合完全后，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，槽中间和外侧均加入1X电泳缓冲液，检查有无漏液，除去两玻璃板间凝胶底部的气泡，小心拔去梳子。
6.按次序上样：先在一个孔上加入蛋白marker，然后用微量进样器往后面的凝胶梳孔中加样品混合液，40ul/孔，每孔加一个样品，同时安排已知分子量的标准物作对照。
昆虫分子生态学
1.分子标记的方法 分子标记的方法
①同工酶（蛋白质电泳技术）方法； ②限制性片段长度多态性（RFLP）方法； ③随机扩增DNA多态性（RAPD）方法； ④微卫星DNA和小卫星DNA标记方法； ⑤扩增片段长度多态性（AFLP）标记。
表1 昆虫分子生态学常用技术比较
技术名称 同工酶 （蛋白质电泳技 术） RFLP 区别水平及 所获得资料类型 氨基酸所带电荷 及电性，基因频 及电性， 率资料。 率资料。 优点 相对便宜， 相对便宜，已有的方 法较多，产生在生理 法较多， 上重要的共显性孟德 尔遗传。 尔遗传。 缺点 与DNA系列方法相比 系列方法相比 灵敏度较差，较多的试 灵敏度较差， 验数量局限于小型昆虫， 验数量局限于小型昆虫， 酶易受环境条件影响。 酶易受环境条件影响。
1.基本原理 基本原理
通过分子生物学的方法检测昆虫种群或个 体的遗传变异，分析和解释遗传变异的特点与 规律，揭示遗传变异所反映的规律性的东西， 从而进一步阐明昆虫之间以及昆虫与环境之间 的相互作用关系。 其研究的最典型特色是运用分子遗传标记 来检测研究对象的遗传变异特征，以揭示事物 所隐含的演化规律。
三．昆虫分子生态学研究内容
（1）由于昆虫迁飞、扩散或外来种、地理隔离的 昆虫种群在分子水平上的遗传多样性及遗传结构； （2）昆虫种群的生物型； （3）昆虫—植物相互作用的分子机理； （4）昆虫抗药性分子机理； （5）昆虫对环境适应（如耐寒性）的分子机理。
四．昆虫分子生态学的应用
1.昆虫地理种群的遗传变异分析 2.昆虫生物型差异的分子特征 3. 3.昆虫嗅觉的分子识别 4.昆虫与共生菌互作的分子机制
昆虫生态学
一．主要原理
•分子生态学是应用分子进化和群体遗传学的理论、 分子生物学的技术手段、系统发生学和数学的分析 方法以及其他学科的知识（如地学、古气候学等） 去研究种群、进化、生态、行为、分类、生物地理 演化、生物保护等学科领域的各种问题。它主要通 过大量使用分子生物学先进的技术和方法，在分子 水平上研究生态现象，阐明生态现象的分子机制。 •昆虫分子生态学就是以昆虫为研究对象，应用分 子生态学的原理与方法研究昆虫进化与适应机制的 一门学科。
分子生物学基本实验操作
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
生态学实验技术第三讲 分子生态学实验方法与技术
分子生态学的研究方法
主要包括两大类：
基于DNA层次的研究方法和基于蛋白质层次的研究方 法。
DNA层次的主要研究对象是线粒体DNA、叶绿体 DNA、核糖体DNA、基因组DNA；
• 蛋白质层次的研究多采用多位点等位酶技术。
有些酶(如ACP、EST、PER等)的结构尚不清楚。这些酶系 统的位点数目很多，酶谱相当复杂，酶谱的解释如无可靠的遗传 分析为基础，会产生多种可能的解释，其结果往往不可靠。
3 电泳胶的制备
酶电泳的介质有多种，最常用：淀粉凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。 与聚丙烯酰胺比较，淀粉无毒，且显色效果和聚丙烯酰胺胶
酶是基因编码的产物，在电场中迁移率的改变可反 映酶蛋白的大小、构形和肽链氨基酸的序列变化，即编 码DNA 顺序上的变化，通过分析酶谱的变化可获得所需 的遗传信息。
在酶谱分析中，等位酶是常用的分析工具。 等位酶是同一基因位点的不同等位基因所编码的同 一种酶的不同形式，等位酶作为基因表达的产物间接反 映酶基因位点及等位基因的变化，是衡量遗传变异的重 要遗传标记。
分子标记的种类与历史
蛋白质：同工酶(等位酶)：六十年代以来 核苷酸序列和片段：tRNA（1965） • 1980年以来：RFLP(限制性片段长度多态） • 1984年以来：SSR(短重复序列标记) • 1990年以来：RAPD(随机扩增长度多态) • 1993年以来：AFLP(扩增片段长度多态)
一 等位酶技术
基本过程包括：
DNA提取、限制性酶切、PCR扩增、分子杂交、基因构 建、DNA测序或指纹谱带测定。
目前，常用分子标记技术包括:
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南1. 引言本指南旨在提供大学生物专业的教师和学生们关于分子生物学实验的具体操作步骤与技巧。
分子生物学是现代生命科学研究中至关重要的一部分，通过实验操作可以加深对分子级别生命现象的理解。
在这个指南中，我们将介绍几个常见的分子生物学实验，并提供详细步骤以及相关注意事项。
2. 实验1：DNA提取2.1 实验原理在本节中，我们将介绍DNA提取实验的基本原理和背景知识。
这包括了DNA 提取方法、材料准备和实验目标等内容。
2.2 实验步骤•样品准备：选择适当来源（如水果、血液等）并根据实验要求进行预处理。
•细胞破碎：使用细胞裂解缓冲液和搅拌器将样品细胞破碎。
•DNA沉淀：添加盐和酒精使DNA沉淀出来，并用无菌水洗涤。
•DNA溶解：使用缓冲液溶解沉淀的DNA。
2.3 注意事项•材料应严格按照实验要求选用，确保实验结果的可重复性。
•使用无菌操作技巧以避免外源性DNA污染。
•注意个人安全，佩戴实验室所需的防护装备。
3. 实验2：PCR扩增反应3.1 实验原理在本节中，我们将介绍PCR（聚合酶链式反应）扩增反应的原理和背景知识。
这包括了PCR技术的基本原理、引物设计和酶选择等内容。
3.2 实验步骤•反应体系准备：根据实验目标计算并配置PCR反应所需的试剂和底物。
•DNA模板制备：提取样品中的DNA，并以适当浓度加入到PCR反应中。
•PCR反应设置：配置好PCR反应管，包括引物、酶和缓冲液等。
•PCR条件设定：根据要扩增的序列特点合理设定温度和时间参数。
3.3 注意事项•注意使用不同样本DNA之间相互污染的可能性，避免交叉污染。
•检查引物设计是否正确并符合预期扩增目标。
4. 实验3：凝胶电泳分析4.1 实验原理在本节中，我们将介绍凝胶电泳分析的原理和背景知识。
这包括了DNA迁移速度、凝胶类型选择和标记物设计等内容。
4.2 实验步骤•凝胶制备：根据实验需要配置适当浓度的琼脂糖凝胶。
分子生物学实验报告全解（有图有真相）讲解
分⼦⽣物学实验报告全解（有图有真相）讲解分⼦⽣物学实验报告慕蓝有志班梦想学院⽬录实验⼀细菌的培养 (2)实验⼆质粒DNA的提取 (4)实验三琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (7)实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (9)实验五聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (11)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (14)实验七RNA分离与纯化 (17)实验⼋RT-PCR扩增⽬的基因cDNA (19)实验九质粒载体和外源DNA的连接反应 (21)实验⼗感受态细胞的制备及转化 (23)实验⼗⼀克隆的筛选和快速鉴定 (25)实验⼗⼆地⾼⾟标记的Southern杂交 (27)实验⼗三阿拉伯糖诱导绿⾊荧光蛋⽩的表达 (31)思考题 (32)分⼦实验⼼得总结 (33)实验⼀细菌的培养⼀、⽬的学习细菌的培养⽅法及培养基的配置。
⼆、原理在基因⼯程实验和分⼦⽣物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因⽂库的建⽴等都离不开细菌。
特别是常⽤的⼤肠杆菌。
⼤肠杆菌是含有长约3000kb的环状染⾊体的棒状细胞。
它能在仅含碳⽔化合物和提供氮、磷和微量元素的⽆机盐的培养基上快速⽣长。
当⼤肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进⼊⼀个滞后期。
然后进⼊对数⽣长期，以20~30min复制⼀代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速⽣长的浓度时，菌体密度就达到⼀个⽐较恒定的值，这⼀时期叫做细菌⽣长的饱和期。
此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。
培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。
实验室中最常⽤的是LB培养基。
三、实验材料、试剂与主要仪器（⼀）实验材料⼤肠杆菌（⼆）试剂1. 胰蛋⽩胨2. 酵母提取物3. 氯化钠4. 1mol/L NaOH5. 琼脂粉6. 抗⽣素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1. 培养⽫2. 带帽试管3. 涂布器4. 灭菌锅5. ⽆菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌⽛签等）6. 恒温摇床四、操作步骤（⼀）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离⼦⽔中加⼊：细菌培养⽤胰蛋⽩胨10g细菌培养⽤酵母提取物5gNaCl 10g摇动容器直⾄溶质完全溶解，⽤1mol/L NaOH调节pH位⾄7.0。
分子生物学实验步骤总结超全（共5则范文）
分子生物学实验步骤总结超全（共5则范文）第一篇：分子生物学实验步骤总结超全（共）一目的基因的获得细菌基因组DNA的提取（一）仪器 1）台式高速离心机 2）恒温水浴箱 3）枪式移液器 4）灭菌的EP管和Tip头（二）试剂1）溶液1: 25% 蔗糖50mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 50mmol/LEDTA，pH8.0 500ug/ml溶菌酶（现用现配）100ug/mlRNase 2)溶液Ⅱ：100mmol/LTris-Hcl，pH8.01%SDS400ug/ml蛋白酶K 3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）4）氯仿：异戊醇（24：1）5）3mol/L NaAc(pH5.2)6）异丙醇或无水乙醇 7）70%乙醇8)TE缓冲液： 10mmol/LTris-Hcl，pH8.01mmol/LEDTA，pH8.0(三)实验步骤1)5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。
2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。
3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。
4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。
5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。
6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。
7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。
8）将DNA沉淀溶解于15ul TE缓冲液中，-20°C保存。
9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。
植物DNA的SDS提取法：（一）试验试剂：1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH 调至pH7.0，并定容至1000ml。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（一）基因组DNA提取上海博彩生物科技有限公司：3S DNA Isolation Kit for Environmental Samples V2.2 3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒V2.2DNA抽提方法使用仪器：灭菌锅，无菌操作台，移液枪，漩涡振荡器，台式离心机，水浴锅，分光光度计或者琼脂糖电泳槽灭菌物品：枪头，1.5ml，2ml离心管一、污泥样品前处理样品在处理前首先要混匀，使其中的悬浮物质分布均匀。
取约l0mL污水样品，加入灭菌离心管，400Orpm、离心20min，收集沉淀，加约4倍体积的TENP buffer(50mMTirs，20mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mL PVP，pHl0)，加玻璃珠(d:l mm)充分匀化(解絮凝)。
4000rpm，离心20min，弃上清(重复两次，直至上清液较澄清)。
加约4倍体积的PBS buffer(8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于lL 水、pH7.4)，旋涡混匀，4000rpm，离心20min，收集沉淀(重复两次)二、基因组DNA提取1.样品准备：100mg样品用200ul Solution SUS 将样品浸泡、悬浮，使样品软化分散开。
2.加入400ul Solution L YS，300mg石英砂，盖上离心管盖，在漩涡振荡器上高速剧烈振荡，10-30min或更长时间。
3.用台式离心机，12000rpm，室温离心5min。
4.将上清液完全转移到无菌1.5ml离心管中，加入120ul Solution BID，盖上离心管盖，上下颠倒混匀。
将溶液用1ml TIP全部转移到3S柱内，柱子放入2ml离心管中，不盖离心管盖，室温放置2min以上。
5.盖上离心管盖，12000rpm，室温离心1min。
6.取下3S柱，弃去离心管中的废液。
将柱子放回同一根离心管中，加入600ul Wash Solution，10000rpm，室温离心1min。
7.重复6一次。
8.取下3S柱，弃去离心管中的全部废液。
将柱子放回同一根离心管中，10000rpm，室温离心2min，以除去残留的Wash Solution。
9.洗脱：在柱子中央加入100ul TE，将柱子放入新的干净1.5ml离心管中，室温放置2min。
12000rpm，室温离心1min。
收集管中的液体即为基因组DNA。
根据用途，样品可以4℃或-20℃保存。
为提高洗脱效率，可以将TE预热到37-55℃。
如果样品中基因组DNA含量很低，用30ul TE洗脱可以提高洗脱液的样品浓度，但产率有所下降。
重复该洗脱步骤一次，可以提高产率20%左右。
三、提取DNA的质量检测(1)DNA纯度和浓度检测用紫外分光光度计测定DNA样品在波长230，260，280nm处的吸光光度值。
DNA纯度的定性检测:通过A260/A280及A260/A230的比值可以检测所提DNA是否纯。
通常纯DNA样品A26O/A280≈1.8，A260/A230>2。
若A260/A280>l.9，可能有RNA污染；若A260/A280<l.6，可能有蛋白质污染；若A260/A230≤2，可能存在酚类等小分子杂质。
DNA浓度的计算：浓度(µg/mL)=A260*50*稀释倍数；注：1OD值相当于50 µg/mL双螺旋DNA。
(2)DNA琼脂糖凝胶电泳检测将所得DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳lh，EB染色后，用紫外凝胶成像系统拍照。
（二）PCR扩增一、PCR扩增引物采用两组对大多数细菌和古细菌的16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对：组合(F34，GC和RS:8)。
引物组合的正向引物5’端中有一个富含GC的40bp的GC发卡结构。
它们各自序列分别为:F341:(5’一eCTACGooAooeAGeAo一3’)，Rsls:(5’一ATTACCGCGGCTGCTGG一3，)，GC发卡结构(5’一CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG一3’)。
引物组合扩增产物片段长度约为220bp。
二、PCR扩增反应体系PCR扩增反应体系，与表3一3相同。
加样后立即进行PCR扩增。
三、PCR扩增程序PCR扩增程序，与表3一4相同。
四、PCR产物电泳检测取5闪PCR产物进行电泳，胶浓度为2.0%，在电压100v条件下电泳lh后检测，经EB染色后用凝胶成像系统观察，保存凝胶图谱。
电泳所用Marker为天根生化科技(北京)有限公司生产的nNAM叭e:nLZo00。
（三）变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析预电泳的作用1.使体系达到反应的条件2.清除过多的变性剂和APS等，保持胶的稳定状态。
聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析。
其装载的样品量大，回收DNA纯度高。
长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。
一、试剂配制(l)50*TAE缓冲液:242g Tris碱，57.1mL冰醋酸，100mL0.5M EDTA(pH8.0)，加水至1L。
混合均匀后高压灭菌20-30min，室温保存。
(2)40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺(37.5：1)：38.93g丙烯酰胺，1.07g双丙烯酰胺，加水至100mL。
(3)O%变性溶液：20mL40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺，2mL50*TAE缓冲液，加水至100mL，再分别加入80µL APS和5µL TEMED。
4℃条件下保存在棕色瓶中。
(4)100%变性溶液：2OmL40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺，2mL50*TAE缓冲液，40mL甲酰胺，42g尿素，加水至100mL，再分别加入80µL APS和5µL TEMED。
4℃条件下保存在棕色瓶中，100%变性溶液在使用之前需要预先溶解，把瓶子放进水浴锅中加温并快速搅拌。
(5)10%过硫酞胺(APS)：lg过硫酰胺加水至10mL。
现用现配。
(6)对于变性浓度低于100%的溶液，用0%和100%的变性溶液混合配制而成，尿素和甲酰胺含量如下所示：不同浓度的变性溶液尿素、甲酰胺含量二、DGGE胶的制备(l)用无水乙醇清洁制胶用的两块玻璃板，将spacer放在2个玻璃板之间，插入clamp中，将aligment板放入，用螺丝夹子固定，将aligment取出，用手摸底部是否平整，要绝对的平，否则会漏。
(2)将软垫放在底座上，玻璃板放在软垫上固定，用水平器调节。
(3)配制13.5mL高浓度变性梯度液，加入梯度仪高浓度右槽，打开左槽螺旋，溶液流入左槽，关上螺旋，用吸管将它们吸回右槽内(确保两槽无气泡阻隔)。
(4)配制13.5mL低浓度变性梯度液，加入梯度仪低浓度左槽。
(5)轻轻打开两槽间的活塞和梯度仪出口开关，并搅拌。
将长针头插入玻璃板之间，流速保持在2mL/min左右。
(6)胶板灌满后，顶部插入梳子，凝固2小时。
三、DGGE凝胶电泳步骤及染色(l)在DGGE槽中加7L左右1*TAE(DGGE专用)，使槽中的水至Full和Run的中间位置；加盖，注意长杆进入底部的窟窿中，打开电源，将温度设置到60℃，打开heat键。
(2)当梳子位置的胶凝固好后，将玻璃板固定在黄色的凝胶板架上，如果只有1板胶，注意另一侧也要固定玻璃板(不加spacer)，否则漏水。
安装好玻璃板后，将凝胶板架(红点在右边)放入水槽中，之后将温度控制器盖在电泳槽上，注意长杆进入底部的窟窿中。
打开电源，打开heat键和bump键，开bump键后，水位会下降，降至run与maxmum的中间，水若不够的话，关闭电源，打开温度控制器上方的探望口，加1*TAE补足。
(3)温度达到60℃，立即进样，先关掉所有电源，取下温度控制器，小心地拔掉梳子，用移液枪冲洗侮一个进样孔；进样要缓慢，使样品顺着玻璃板均匀地落入到进样孔中。
每一个进样孔加入25µL样品。
(4)将温度控制器盖在电泳槽上，打开电源，将温度调到60℃，打开heat键和bump键，运行5min后，在主机上插入红黑电源线，注意红黑线不要颠倒。
打开主机电源，将电压调到120V，时间调为5h。
(5)电泳结束后，关掉电源，打开盖子，将凝胶板架拿出，控水，卸下玻璃板。
将clamp卸下，手抓住spacer，向内侧拧，揭下短玻璃板，胶粘在长玻璃板上。
(6)将托盘上平铺张保鲜膜后，将长板和胶放入托盘中银染。
银染步骤步骤：时间溶液固定30 min 10%冰醋酸、30%乙醇，100 ml敏化2*10 min 30%乙醇，100 ml洗涤冲洗30 s，漂洗5*5 min 双蒸水银染30 min 新鲜配制的0.1%AgNO3，100 ml，使用前加入370 μl的福尔马林溶液洗涤冲洗30 s，漂洗1 min，再冲洗30 s 双蒸水显影直至显示条带为止，密切观察溶液1：0.2 g硫代硫酸钠于10 ml水中溶液2：2.5 g碳酸钠于100 ml水中将100 μl溶液1加入溶液2中，再加350μl的福尔马林溶液终止30 min 5.84 g EDTA2Na·2H2O以及8 g Glycine于双蒸水中，定容至400 ml（也可用10%的冰醋酸）保存长达数日10%甘油长时间保存干胶自然干燥即可（1）AgNO3母液（20%）：将2 g AgNO3溶解于双蒸水中，定容至10 ml，放置于棕色瓶中密闭保存。
每次使用时取2 ml母液，稀释至400 ml，再加入福尔马林。
（2）10*Tris EDTA（TE）：pH=8.0A．100mmol/L Tris-CI（pH=8.0）B．10mmol/L EDTA (pH=8.0)C．Tris-Cl(1 mol/L)：用800 ml蒸馏水溶解121.1 gTris碱，加浓盐酸调pH值至所需值。
银染原理：银染是一种常用的蛋白质染色方法，具有较高的灵敏度，可以染出SDS-PAGE胶中含量低至0.2ng的蛋白。
虽然这是protocol上的说法，但如果操作得当，检测到5ng左右的蛋白应该不成问题。
如果搜索银染的protocol，可能会得到许多种说法。
为什么这样一种重要的实验手段却得不到统一的应用呢？这可能要从银染本身那复杂而又灵活的原理说起。
简单的讲，银染的原理就是将银离子还原，附着在蛋白表面，形成染色。
银染所用的银，基本上是基于两种试剂，一种是硝酸银，另一种是Silver diammine。