生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用
生物素标记抗体的原理应用
生物素标记抗体的原理应用引言生物素标记抗体是一种常用于生物学实验和生物化学研究的工具。
它可以通过结合生物素和抗体来标记目标蛋白，从而实现对目标蛋白的检测和定位。
本文将介绍生物素标记抗体的原理和常见的应用。
生物素标记抗体的原理生物素标记抗体是通过将生物素分子与抗体共价结合来实现标记的。
生物素是一种天然存在于生物体中的小分子，其与生物素受体（如亲和素或亲和力很强的亲和素结合蛋白）之间具有高度的亲和力。
生物素标记抗体的原理基于生物素与生物素受体之间的高亲和力，通过标记抗体即可实现对目标蛋白的检测和定位。
生物素标记抗体的应用生物素标记抗体在生物学实验和生物化学研究中有着广泛的应用。
下面列举了一些常见的应用：1.免疫组化生物素标记抗体可以用于免疫组化实验中的抗原检测和定位。
通过将生物素标记的抗体与目标抗原结合，再将其与亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）复合物结合，可以实现对抗原的检测和可视化。
2.流式细胞术生物素标记抗体可以在流式细胞术中用于细胞表面标记。
通过将生物素标记的抗体与目标细胞结合，再与荧光素-生物素-蛋白（如荧光素结合蛋白）复合物结合，可以实现对目标细胞的检测和定位。
3.免疫沉淀生物素标记抗体在免疫沉淀实验中广泛应用。
通过将生物素标记的抗体与目标蛋白结合，再与琼脂糖颗粒（如琼脂糖颗粒A/G）结合，可以实现对目标蛋白的沉淀和富集。
4.西方印迹生物素标记抗体在西方印迹实验中也起着重要的作用。
通过将生物素标记的抗体与目标蛋白结合，再与亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）复合物结合，可以实现对目标蛋白的检测和定量。
结论生物素标记抗体是一种常用的生物学实验和生物化学研究工具，其原理基于生物素与生物素受体之间的高亲和力。
通过将生物素标记抗体与目标蛋白结合，可以实现对目标蛋白的检测和定位。
生物素标记抗体在免疫组化、流式细胞术、免疫沉淀和西方印迹等实验中有着广泛的应用。
在将来的研究中，生物素标记抗体将继续发挥重要的作用，并为研究人员提供更多的实验选择和研究手段。
emsa实验原理及应用
emsa实验原理及应用EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay），即电泳迁移位移实验，是一种常用的分析蛋白质与核酸相互作用的方法。
该实验基于核酸与蛋白质结合后在凝胶电泳中的迁移速度变慢的原理，通过观察核酸与蛋白质结合复合物的迁移差异，来研究它们之间的相互作用。
EMSA实验的原理是基于核酸与蛋白质相互作用后的电泳迁移差异。
在实验中，首先需要获得核酸分子（通常是DNA或RNA）和蛋白质样品。
然后，将核酸与蛋白质按照一定的比例混合，并进行反应使其结合。
接下来，将反应体系进行凝胶电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在凝胶电泳过程中，核酸与蛋白质复合物的迁移速度会变慢，而未结合的核酸则会较快地迁移。
这是因为核酸与蛋白质结合后形成的复合物比未结合状态下的核酸分子大，电荷密度也增加，从而导致复合物的迁移速度较慢。
通过观察电泳过程中形成的带状图案，可以确定核酸与蛋白质是否发生了结合。
EMSA实验在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用来研究蛋白质与DNA或RNA之间的相互作用。
这对于理解基因表达、调控机制以及疾病的发生发展具有重要意义。
其次，EMSA实验可以用来鉴定蛋白质的结合位点。
通过对不同长度或突变的核酸序列进行EMSA实验，可以确定蛋白质与核酸的结合位点，进一步研究其功能。
此外，EMSA实验还可以用于筛选与特定蛋白质结合的核酸序列，从而寻找潜在的药物靶点。
尽管EMSA实验在研究蛋白质与核酸相互作用方面具有重要的应用价值，但也存在一些限制。
首先，EMSA实验只能提供间接的蛋白质与核酸结合信息，无法直接确定结合的强度或亲和力。
其次，EMSA实验需要一定的实验操作技巧，且耗时耗力。
此外，由于核酸与蛋白质之间的相互作用是动态的，EMSA实验只能提供一瞬间的结合信息，无法反映动态变化过程。
EMSA实验是一种常用的研究蛋白质与核酸相互作用的方法。
通过观察核酸与蛋白质结合复合物的电泳迁移差异，可以研究它们之间的相互作用及其调控机制。
化学发光标记生物素
化学发光标记生物素引言：化学发光技术是一种常用的生物分析技术，在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域发挥着重要作用。
其中，化学发光标记生物素技术是一种常见的应用，通过将生物素与特定的化学发光物质结合，可以实现对生物分子的高灵敏度、高特异性的检测。
本文将介绍化学发光标记生物素的原理、应用和优势。
一、化学发光标记生物素的原理化学发光标记生物素是基于生物素-亲和素系统的原理进行设计与制备的。
生物素是一种维生素B7，具有与亲和素（如蛋白质A、蛋白质G等）结合的特性。
在化学发光标记生物素中，生物素首先与化学发光物质（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）结合，形成生物素-化学发光物质复合物。
然后，生物素-化学发光物质复合物与待检测的目标分子（如蛋白质、核酸等）结合，形成生物素-目标分子-化学发光物质复合物。
最后，在适当的条件下，化学发光物质发生催化反应，产生可见光或荧光信号，从而实现对目标分子的检测。
二、化学发光标记生物素的应用化学发光标记生物素在生物医学研究和临床诊断中得到广泛应用。
以下是几个常见的应用领域：1. 免疫分析：化学发光标记生物素技术可以用于检测抗体和抗原的相互作用，从而实现对疾病标志物的检测。
例如，在HIV感染的诊断中，可以使用化学发光标记生物素技术检测HIV抗体的存在。
2. 基因检测：化学发光标记生物素技术可以用于检测基因的存在和表达水平。
例如，在PCR扩增反应中，可以使用化学发光标记生物素技术检测扩增产物的存在与否，从而实现基因的定性和定量分析。
3. 药物筛选：化学发光标记生物素技术可以用于评估药物与靶标的相互作用强度。
通过将药物与生物素结合，然后与靶标结合，可以利用化学发光技术检测药物-靶标复合物的形成情况，从而评估药物的亲和力和选择性。
三、化学发光标记生物素的优势化学发光标记生物素技术相比传统的染色标记技术具有以下优势：1. 高灵敏度：化学发光标记生物素技术可以实现对目标分子的高灵敏度检测，因为化学发光信号产生的过程具有高放大倍数。
EMSA实验
5、紫外交联
紫外交联仪是一种多用途的254mm紫外辐射系统主要用于将 核酸交为使核苷酸固定在杂交膜上。传统的方法是将膜置于80℃ 真空烘箱中烘2小时，在本紫外交联仪上仅需在254nm紫外光下照 射几秒钟即可。
· 紫外照射可使杂交信号比
传统烘烤法提高5-10倍。
5.洗涤、孵育 用Washing Buffer洗涤(整个 过程避免膜干燥)
倒掉冲洗缓冲液，加入Block Buffer轻微震荡20min
加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素 室温震荡孵育45min。（勿将酶标记
物直接加到膜上）
去掉酶联物稀释液，用Washing Buffer洗膜三次，每次室温轻微震荡1
0min。
配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。 （可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，
使底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）
6、曝光成像
两种方法: 化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像 操作基本和Western 试验操作相当, 只是这个膜是一次性
的,不能重复使用, 一定保存好图片!由于跑得是非变性凝胶,蛋 白保持天然构像和活性,所以条带很可能是一块一块的而不像 WB那样很规整的一条细线,这个很正常。
用TNFa刺激肿瘤细胞后得到的核蛋白的NFKB的EMSA试验 图片
三、常见问题
1、为什么看不到迁移带？
1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。 2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。 3）探针与蛋白无特异性的相互作用。 4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。 5）曝光或者成像时间过短。
二、实验操作步骤
1、实验前准备
（1）合理的实验方案 根据研究目的合理设计特异性探针实验 组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体 组、特异性核酸竞争组等。
emsa实验原理
EMSA实验原理EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质与核酸（一般是DNA）之间的相互作用。
该技术通过观察蛋白质-核酸复合物在凝胶电泳中的迁移率变化，可以揭示蛋白质与DNA结合的情况。
实验原理在EMSA实验中，首先需要准备一定浓度的DNA片段，通常是已知序列的DNA探针。
接着，将待检测的蛋白质与这些DNA探针一起混合，形成蛋白质-核酸复合物。
随后，将这些混合物加载到聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。
在凝胶电泳过程中，如果DNA片段没有与蛋白质结合，那么它们将会沿着电场方向运动到特定位置。
但是，如果DNA片段与蛋白质结合形成复合物，则复合物的迁移率会受到影响，迁移速度将会减慢。
结果就是在凝胶中观察到不同带电簇的出现，这些带电簇代表了不同的蛋白质-核酸复合物。
通过对凝胶电泳结果进行分析，可以确定哪些蛋白质与DNA结合，并且可以定量检测它们之间结合的强度和亲和力。
这样的信息对于理解蛋白质功能以及基因调控机制至关重要。
实验步骤1.制备实验样品：准备已知序列的DNA探针和待检测的蛋白质溶液。
2.形成蛋白质-核酸复合物：将DNA探针和蛋白质混合，在合适的条件下形成复合物。
3.加载到凝胶中：将混合物加载到琼脂糖凝胶上，进行电泳分离。
4.电泳分离：在合适的电场作用下，观察蛋白质-核酸复合物的迁移情况。
5.结果分析：分析凝胶电泳结果，确定蛋白质-核酸复合物的形成情况以及强度。
结论EMSA实验是一种简单有效的方法，用于研究蛋白质与DNA之间的相互作用。
通过该实验，可以揭示蛋白质在基因调控中的作用，帮助科研人员深入理解这些生物大分子之间的相互作用机制。
EMSA技术在基因编辑、药物研发等领域有着广泛的应用前景，对于推动生命科学的发展起着重要作用。
荧光标记生物素
荧光标记生物素荧光标记生物素是一种常用的实验技术，在生物学和生物化学研究中起着重要作用。
荧光标记生物素利用荧光染料与生物素的特异性结合，将荧光信号与感兴趣的生物分子相结合，从而实现对其位置和表达水平的研究。
本文将介绍荧光标记生物素的原理、应用和优缺点。
一、荧光标记生物素的原理荧光标记生物素的原理基于生物素和荧光染料之间的结合。
生物素是一种小分子有机化合物，具有与细胞膜、细胞器和蛋白质等生物分子的特异性结合能力。
荧光染料可以发射特定波长的光信号，通过与生物素结合，将荧光信号引入到感兴趣的生物分子中。
二、荧光标记生物素的应用1. 免疫荧光染色：荧光标记生物素可以与抗体结合，用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达水平和分布情况。
通过免疫荧光染色技术，可以观察细胞内特定蛋白质的定位和表达变化，从而研究其功能和调控机制。
2. 原位杂交：荧光标记生物素可以与DNA或RNA探针结合，用于检测特定基因在组织或细胞中的表达情况。
原位杂交技术可以帮助研究人员了解基因的表达模式、调控机制和细胞分化过程。
3. 荧光显微镜成像：荧光标记生物素可以用于荧光显微镜成像，观察细胞和组织中特定分子的定位和动态变化。
荧光显微镜成像技术可以提供高分辨率的图像，帮助研究人员深入了解细胞结构和功能。
4. 荧光流式细胞仪：荧光标记生物素可以用于流式细胞仪的分析，实现对细胞表面标记物、细胞周期和细胞凋亡等生物学过程的研究。
荧光流式细胞仪可以高通量地分析大量细胞的荧光信号，帮助研究人员获取更精确的数据。
三、荧光标记生物素的优缺点1. 优点：a. 高灵敏度：荧光标记生物素可以实现对生物分子的高灵敏检测，提供准确的定量数据。
b. 高特异性：荧光标记生物素通过特异性结合，可以选择性地标记感兴趣的生物分子，避免背景干扰。
c. 易于操作：荧光标记生物素的使用方法相对简单，不需要复杂的实验步骤和设备。
2. 缺点：a. 荧光信号衰减：荧光标记生物素的荧光信号会随着时间的推移而衰减，降低观察的时间窗口。
生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用精选 课件
North2South 杂交原理和操作流程RP的催化下反应发光，检测
3、杂交：生物素标记的 探针与靶DNA结合
底物
HRP
SA
│B
B
│
1、DNA电泳，转膜，紫外交联固定
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4、HRP标记的链亲和素与 探针上的生物素结合
2、洗膜封闭
Kit组成
▪ 该试剂盒由探针标记，杂交洗膜和化学发光检测三部分组成 ▪ North2South™生物素随机引物Kit(该试剂盒含有足以完成10次标记反应的试
剂，每次可合成至少1ug的生物素标记的探针) ▪ 化学发光检测Kit 89880可检测1080cm2的杂交膜.
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探针得率高
▪ 高产率 ：模板DNA可以少至100ng，Klenow聚合酶无核酸外切酶活 ，产率提高，每次标记至少产生1-2 ug的生物素标记的探针。
▪ 使用方便：标记好的探针可以在冰箱里保存一年。
Affinity cytochemistry
Localization studies Signal Amplification
Diagnostics Histochemistry
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1.1生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应用
“Everything is possible - with the right tools”
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原理
▪ 标记：采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板， 在随机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dUTP掺入到合 成的DNA探针中，产生可用于Southern或Northern杂交实验的高活性 生物素标记的DNA探针
▪ 检测：杂交形成双链，洗膜后，探针DNA上的生物素与HRP上的链亲和 素结合，HRP与Pierce 的Dura化学发光底物孵育曝光或冷光CCD检测
化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒 D3308 说明书
化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒产品编号 产品名称包装 D3308化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒1000cm 2产品简介：化学发光法生物素检测试剂盒(Chemiluminescent Biotin-labeled Nucleic Acid Detection Kit)是一种通过Streptavidin-HRP 及后续的BeyoECL Moon 试剂来实现化学发光检测Biotin 标记核酸的检测试剂盒。
适用于Southern blot 、Northern blot 、ribonuclease protection assay (RPA)或EMSA 等实验中，采用生物素标记的DNA 或RNA 探针时的检测。
本试剂盒不适用于生物素标记蛋白的检测。
本试剂盒同时还提供了封闭液、洗涤液等检测时所需的配套试剂。
本试剂盒采用了高质量的Streptavidin-HRP Conjugate ，HRP 和Streptavidin 共价交联的比例大于3，这样比采用Streptavidin 和Biotin-HRP conjugate 两种试剂进行检测要更方便，并且灵敏度更高。
采用了非特异性结合比avidin 更低的strepatavidin ，使检测结果背景更低灵敏度更高。
本试剂盒没有提供生物素探针标记相关的试剂，生物素标记的DNA 探针或EMSA 探针的制备可以相应地使用碧云天生产的生物素3'末端DNA 标记试剂盒(D3106)或EMSA 探针生物素标记试剂盒(GS008)。
本试剂盒可以用于检测至少10块10×10cm 有生物素标记EMSA 探针的膜，即共1000cm 2。
包装清单：产品编号 产品名称包装 D3308-1 BeyoECL Moon A 液 55ml D3308-2 BeyoECL Moon B 液 55ml D3308-3 Streptavidin-HRP Conjugate100µl D3308-4 封闭液 380ml D3308-5 洗涤液(5X)250ml D3308-6检测平衡液 250ml —说明书1份保存条件：D3308-3 Streptavidin-HRP Conjugate 在-20ºC 保存，其余可4ºC 保存。
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交联化学： 交联化学：交联剂，修饰试剂，生物素化试剂…
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1. 生物素标记和化学发光检测 技术在核酸杂交和EMSA EMSA中的应用 技术在核酸杂交和EMSA中的应用
The world leader in serving science
关于生物素
别名： Vitamin B 分子量： 244.31 水溶性好 结合对象： 亲和素Avidin 亲和素Avidin 链亲和素Streptavidin 链亲和素Streptavidin 中性亲和素NeutrAvidin 中性亲和素NeutrAvidin 单体亲和素Mono 单体亲和素Mono Avidin
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3. 化学发光检测
Note1:要保证所有缓冲液充分溶解，没有颗粒 1.封闭：封闭液20ml（0.25ml/cm2膜）于37－50°振荡洗膜封闭15分钟 2.抗体孵育：20ml抗体稀释液（ 66.7ulSA-HRP＋20ml封闭液），室温孵育 15分钟 3.洗膜：20ml的1X漂洗缓冲液分别室温轻柔振荡漂洗4次，每次5分钟 4.平衡：杂交膜与30ml的底物平衡液室温轻柔振荡孵育5分钟 5.底物孵育：把湿润的膜放在一个干净的塑料盘（平皿）里，与底物工作液 在室温下孵育5分钟（推荐在暗室中）。确保膜被底物溶液完全淹没或覆 盖底物工作溶液需足够以完全覆盖杂交膜（约0.1ml/cm2）。 6.曝光：滤纸吸附多余底物，作好标记，保鲜膜包裹，确保保鲜膜和杂交膜 间无气泡和皱褶。把包好的杂交膜放在暗夹里，放上X光片，曝光1－5分 钟。曝光时间长短可以稍有变化以获得理想的信号。 7.从暗夹里取出X光片，按厂家的使用说明书显影和定影。 Note2:可与底片背景去除试剂配合使用，以获得更理想的实验结果
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2. 探针制备二之探针纯化 探针制备二之探针纯化
1. 2. 3. 4. 5. 6. 加入5ul醋酸铵于上述50ul反应离心管，吹打混匀 加入110 ul 冰预冷的无水乙醇，充分混匀，冰或－70°放置15分钟 12000rpm 4°离心15分钟 观察沉淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀 用冰预冷的70％乙醇洗涤一次，12000rpm 4°离心15分钟，观察沉 淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀 50ulTE或RNA酶free 的水溶解沉淀（－20℃或－70℃长期保存）
Affinity cytochemistry
Localization studies Signal Amplification Diagnostics Histochemistry
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1.1生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应 1.1生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应 用
“Everything is possible - with the right tools”
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2. 杂交和洗膜之严谨洗膜 杂交和洗膜之严谨洗膜
1. 2. 配制1X严谨洗膜缓冲液，平衡严谨洗膜缓冲液到室温（溶解充分） ，加等体积去离子水配制所需洗膜液（0.2ml/cm2膜） 将膜转移到一个新的容器中（杂交管）。加入1X严谨洗膜液10－ 20ml，旋转洗膜3次（DNA杂交55℃，RNA:RNA杂交65℃），每 次15－20分钟。
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对照DNA点杂交 对照DNA点杂交 DNA
备用试剂：0.1N NaOH 煮沸变性DNA变性成单链（ 对照DNA，5μl，250ng/μl） 准备生物素标记的对照探针或阳性样品探针（见探针标记，纯化和定量 ） 准备目标膜（注意：推荐使用带正电尼龙膜，需带无粉手套并用乙醇净 化的镊子拿膜。） • 0.1N NaOH稀释变性DNA得到1，0.5，0.25，0.125，0.0625， 0.0312，和0.015ng/μl稀释梯度。 • 在膜上平行点两点。点前最好把膜预洗一下，半干的时候点，但 干点同样有用。 • 用1X TE轻轻漂洗膜（～10秒），微波炉高火加热2分钟，紫外交 联（自动交联）或烘干固定。注：如果没有紫外交联仪，则可以 注 将膜置于80度温箱烘烤2－3小时，可达到固定目的 • 交联固定完，用0.1％SDS预湿润膜，进入下面预杂交，杂交以及 底物孵育和曝光 杂交，严谨洗膜和封闭，抗体孵育，洗膜，平衡，底物孵育以及曝光见 前所述
该试剂盒由探针标记，杂交洗膜和化学发光检测三部分组成 North2South™生物素随机引物Kit(该试剂盒含有足以完成10次标记反应的试 剂，每次可合成至少1ug的生物素标记的探针) 化学发光检测Kit 89880可检测1080cm2的杂交膜.
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探针得率高
高产率 ：模板DNA可以少至100ng，Klenow聚合酶无核酸外切酶活， 产率提高，每次标记至少产生1-2 ug的生物素标记的探针。 使用方便：标记好的探针可以在冰箱里保存一年。
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2. 杂交和洗膜之杂交
1. 平衡杂交液到室温 2. 预杂交:将转好的膜置于杂交管，点样面朝上，确保膜被杂交缓冲液均 匀覆盖，杂交炉要缓慢转动以保证杂交液与膜能充分接触，（每平方 厘米膜至少0.1ml杂交液。除了RNA:RNA杂交用65℃外，其他的都用 55℃）,50-100rpm旋转，至少30分钟。 3. 热变性探针：煮沸变性10分钟，迅速在冰/盐水混合物退火5-10分钟 4. 杂交：加入已经变性的DNA探针于杂交液，充分混匀（探针加入到杂交 液，不要加到膜上，要轻轻晃动，使探针均匀分散在杂交液中），探 针浓度约30ng/ml杂交液, 50-100rpm旋转，孵育过夜。
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检测安全
采用非同位素的化学发光系统，免除放射性的危险与处理同位素废物 的麻烦，减少环境污染；无须专门的同位素操作室，易于使用推广 anyone,anywhere and anytime
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高灵敏度与高信噪比
生物素标记的dUTP保证了与HRP标记的链亲和素（Kd=10-15M； 抗体10-5～8M ） Kd=10 15M； 抗体10 最大结合，经受最严谨的洗膜条件 优化杂交液和封闭液保证了探针与靶DNA的完美结合 Dura （10-14克）底物保证了保证了高于地高辛（DIG）-AP标记系统，等同 于或者超过同位素的检测灵敏度
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方便快速
0.5－10分钟即可检测到特异性信号 6小时的超长发光时间允许多次曝光 可以使用冷光CCD成像仪扫描成像
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操作流程与时间
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 探针标记与纯化（1小时） 预杂交（0.1mL/cm2 ,55或者65°, 0.5小时） 杂交（8－12小时） 严谨洗膜（3X15分钟,提高温度,降低离子强度） 封闭（ 0.25mL/cm2 , 轻柔振荡15分钟） SA-HRP孵育（,1:300稀释度,轻柔振荡15分钟） 洗膜（ 4X5分钟） 平衡（5分钟） 底物孵育(0.125mL/cm2 , 5分钟) 曝光检测（0.5－ 10分钟）
1.生物素标记和化学发光检测技术在核 1.生物素标记和化学发光检测技术在核 酸杂交和EMSA中的应用 酸杂交和EMSA中的应用 2.Western Blotting的问题与对策 Blotting的问题与对策
The world leader in serving science
Steven Product manager Apr 24 ,2007
有机合成，化学耦联，表面化学和分析化学
Product Focus： Focus：
分子生物学： 分子生物学：各种化学发光Blotting, EMSA,RPA 蛋白质组学： 蛋白质组学：蛋白抽提, 蛋白定量,纯化,样品制备，功能研究以及各种染色 试剂和预染Markers 免疫学 ：抗体制备, 纯化，片断化, 分型和修饰
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North2South 杂交原理和操作流程
5、SuperSignal® Dura 底物在 HRP的催化下反应发光，检测
底物
HRP
4、HRP标记的链亲和素与 探针上的生物素结合
3、杂交：生物素标记的 探针与靶DNA结合 │
B
SA
B
│
2、洗膜封闭
1、DNA电泳，转膜，紫外交联固定
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Kit组成 组成
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原理
标记：采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板，在随 标记：采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板， DNA聚合酶 DNA为模板 机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dUTP dUTP掺入到合成的 机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dUTP掺入到合成的 DNA探针中 产生可用于Southern Northern杂交实验的高活性生物素 探针中， Southern或 DNA探针中，产生可用于Southern或Northern杂交实验的高活性生物素 标记的DNA DNA探针 标记的DNA探针 检测：杂交形成双链，洗膜后，探针DNA上的生物素与HRP DNA上的生物素与HRP上的链亲和素 检测：杂交形成双链，洗膜后，探针DNA上的生物素与HRP上的链亲和素 结合，HRP与 Dura化学发光底物孵育曝光或冷光CCD检测 化学发光底物孵育曝光或冷光CCD 结合，HRP与Pierce 的Dura化学发光底物孵育曝光或冷光CCD检测
O OH
O HN H S NH H
5
关于生物素/ 关于生物素/亲和素复合物
亲和素 亲和素Avidin 亲和素Avidin 链亲和素Streptavidin 链亲和素Streptavidin 中性亲和素NeutrAvidin 中性亲和素NeutrAvidin 单体亲和素Mono 单体亲和素Mono Avidin
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探针制备三之探针定量 探针制备三之探针定量
1. 500ul去离子水，260nm调零 2. 充分混匀2.5ul 探针和47.5ul 去离子水（即稀释20倍）分光光度计测 定OD260值 3. 定量计算公式：1 OD260 dsDNA = 50 μg/ml； 4. 样品浓度（μg/ml）=OD值X50X稀释倍数; 5. 样品浓度μg/ul= OD260值X50X20/1000 6. 样品浓度ng/ul= OD260值X50X20（注：如果稀释20倍，实际测定的 OD260值应该在0.02－0.05之间） Note:大多数情况下，由于各实验室用来测定核酸的仪器不同，检测灵 Note: 敏度不同以及样品中的一些干扰物质，测出的OD值往往是0甚至是负值 ，如果出现这种情况，再进行核酸定量没有实际价值，因此，根据经验 ，保守估计，在每次至少合成1ug探针的前提下，在杂交时，探针的用 量按照每ul含有20ng探针来使用，即每毫升杂交液加入变性的纯化过的 探针1.5-2ul.