高温大曲中酵母菌的分离_鉴定及耐高温性

-
-
+
DDB
-
-
+
在分离出的3株酵母中，S1菌株能利用葡萄糖和麦芽 糖发酵，在利用半乳糖和蔗糖发酵时具有可变性，而S2、 S3菌株不能发酵8种糖中的任何一种。依据BARNETT JA 等著的酵母菌的特征与鉴定手册的糖发酵检索表将S1归 属于假丝酵母属，S2属于三角酵母属，S3红冬酵母属。
在碳源同化试验中，S1菌株可同化半乳糖、木糖、可溶 性淀粉、乳酸、柠檬酸，同化山梨糖、阿拉伯糖时具有可变 性。S2菌株可同化半乳糖、山梨糖柠檬酸，同化木糖和乳酸 时具有可变性。S3菌株只能同化木糖，利用半乳糖、山梨 糖、阿拉伯糖、纤维二糖、菊糖、乳酸、柠檬酸时具有可变性。
酵母菌的鉴定方法有6种，即普通形态学及生理生化 鉴定、API20CAUX系统、傅立叶变换红外吸收光谱（FT-IR） 显微分光仪、Biolog微生物鉴定系统、5.8S-ITS扩增片段的 RFLP分析和微卫星多态性分析。后5种鉴定方法为新型鉴 定方法，它们和传统的普通形态学和生理生化鉴定相比具 有简便、快速、适合实验室及工业化生产过程中酵母菌的 鉴定[11]，但是价格高昂。
造，2008（3）：27-29. [4] 唐先伟，王福庆. 耐高温酒用鲜酵母在白酒生产中的应用[J]. 酿酒，
1999（3）：39-40. [5] 菜信之，黄君红. 微生物学[M]. 北京：高等教育出版社，2002. [6] 吴根福，杨志坚. 发酵工程实验指导[M]. 北京：高等教育出版社，2006. [7] 巴尼特. 酵母菌的特征与鉴定手册[M]. 青岛：青岛海洋大学出版社，
不同温度下的热力致死指标D值表明，菌株S1、S2和 S3分别在45℃、51℃和48℃处理时D值最大，酵母死亡最 慢，耐热性最强，由此表明菌株 S1、S2和S3的最适生长温 度分别为45℃、51℃和48℃，如表5。
表5 不同温度下的热力致死指标D值 Table 5. Thermal death index D value under different temperatures
传统的酿酒酵母酒精发酵的最适温度在28℃~33℃， 一般不会超过36℃，在这种温度下发酵需要大量的冷却水。 若能使发酵在高温下进行，不但可以减少冷却水的用量， 节约生产成本，而且可以从根本上解决糖化与发酵不同步 的问题，缩短发酵周期，提高发酵效率。同时高温发酵能 有效的抑制杂菌生长，减少醪液受污染的机会。但过高的 温度会引起酵母细胞内脂肪酸磷脂等成分的变化，甚至会 导致蛋白质变性，表现出高温对酵母细胞的毒性[1]。因此， 对于耐高温酒精酵母菌的筛选与研究日益受到重视。长期 以来，高温菌株的选育主要集中在自然界筛选和高温驯 化，且获得很好的经济效益[2]，固态发酵中的酵母菌就是 大曲主要的功能微生物之一[3]，高温酵母具有使用方便、 繁殖快、芽胞多、死胞少、用量小、成本低、出酒率高等多方 面优点[4]。高温酿酒酵母为工业发酵提供了广阔的前景。 为此，以宋河酒厂高温大曲中的酵母菌为对象，以期选育 出更为优良耐高温菌株，为应用于工业发酵提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品
温度的敏感指标Z值测定：用45℃、48℃、51℃、54℃， 4个不同温度，分别测出某一个微生物在此4个温度下的D 值。以lgD为纵坐标，温度T为横坐标，用Origin7.5拟合直线 方程，Z值即为此直线斜率负倒数，它表示了菌类对温度的 敏感程度，Z值小的菌类对温度的敏感程度高。 1.2.3 酵母菌存活细胞的计数方法
菌落 透明度
菌落光滑度
菌落 边缘
S1 白色 圆 不透明 光滑，湿润 整齐
S2 乳白色 圆 不透明 光滑，湿润 整齐
S3 粉红色 圆 不透明 不光滑，湿润 不整齐
细胞 形态 椭圆 三角 腊肠
菌丝
有 无 无
2.1.2 生理生化试验结果 在形态学鉴定的基础上，对3株酵母菌进一步测试其
生理生化指标，总共测试了8种糖的发酵、12种碳源的同化 及补充部分的氮源利用结果，如表2~表4。
依据BARNETT JA等著的酵母菌的特征与鉴定手册 的碳同化检索表将S1归属于假丝酵母属，S2属于三角酵 母属，S3红冬酵母属。
在补充试验中S1和S2菌株都不能产酸，且尿素分解 和DDB反应均成阴性。S3菌株不能产酸，而在尿素分解和 DDB反应均成阳性。故依据BARNETT JA等著的酵母菌 的特征与鉴定手册的补充试验检索表将S1归属于假丝酵 母属，S2属于三角酵母属，S3红冬酵母属。 2.2 耐高温性 2.2.1 热力致死指标D值结果
(Department of Life Science, Zhoukou Normal University, Zhoukou 466001, China)
Abstract: Three yeasts were isolated from high temperature Daqu of Songhe Company. The morphological and physiological characteristics tests indicated that they belonged to Candida, Trigomopsis and Rhodos poridium, respectively. Thermal lethal index D value showed that the optimum growth temperature of S1, S2 and S3 were 45℃, 51℃ and 48℃, respectively. Temperature sensitive index Z value showed that heat tolerance of S1 was the lowest, and S3 was higher and S2 was highest. Key words: yeast; thermotolerance; sterilization time; remnant microorganism number
菌号
温度/℃
S1
S2
S3
45
164
100
32
48
80
137
46
51
39
164
30
54
37
93
10
2.2.2 温度的敏感指标Z值结果 衡量温度变化时微生物死灭速率变化尺度的Z值结
果表明，S1对温度的敏感程度最高，耐热性最小；S3次之， 耐热性大；S2最大，耐热性最大，如表6。
2011 No．11
·114· Serial No．236
1991. [8] 陈叶福，王正祥，王晨霞，等. 耐高温酵母菌株的分离、鉴定及其酒精
美蓝染色活细胞计数[9]。 2 结果与分析 2.1 酵母菌的鉴定 2.1.1 形态鉴定结果
从宋河酒业提供的高温大曲中经过多次分离纯化， 经镜检确认为3株酵母，分别记为S1、S2、S3。经过单菌落 培养和显微镜检测，其形态学鉴定结果如表1。从纯化菌株 的菌类形态、细胞形态、菌丝的的有无及醋酸钠培养基培 养的结果来看，依据酵母菌分属检索表进行初步分析，S1 多边芽殖，有芽细胞、假菌丝，无冬孢子，菌落无色素，故判
菌号
碳源种类
S1
S2
S3
半乳糖
+
+
V
山梨糖
V
+
V
木糖
+
V
+
阿拉伯糖
V
-
V
鼠李糖
-
-
-
纤维二糖
-
-
V
蜜二糖
-
-
-
菊糖
-
-
V
可溶性淀粉
+
-
-
肌醇
-
-
-
乳酸
+VV来自柠檬酸+
+
V
表4 补充试验结果 Table 4. Results of supplemental tests
菌号
补充试验
S1
S2
S3
产酸
-
-
-
解尿素
中图分类号：TS261.1
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2011）11-0112-03
Isolation, identification and thermotolerance of yeast from high temperature Daqu
ZHANG Jie, HOU Xiaoge, WANG Junying, HU Bingyi*
China Brewing
Research Report
表6 温度的敏感指标Z值 Table 6. Temperature sensitive index Z value
菌号
项目
S1
S2
S3
Z值
13
107
15
3 讨论 从高温大曲中经过分离、初筛、复筛得到3株酵母S1、
S2和S3。经进一步的形态、生理生化的鉴定表明他们分别 隶属于假丝酵母属、三角酵母属和红冬酵母属。这与孝感 凤窝酒曲、卧龙酒厂的中温大曲[3]、贵州茅台酒厂的大曲[10] 鉴定的酵母菌有所不同，表明不同酒厂的大曲中的母菌种 群结构的多样性，造就了中国白酒风格的多样性。
3株酵母的耐高温性的研究表明S1菌株能在45℃环 境中良好生长，S2菌株能在51℃环境中良好生长，S3菌株 能在48℃环境中良好生长。S2菌株比覃晓娟等[12]、邹建忠 等[13]和刘海臣等[14] 分离的酵母菌更耐高温，将其作为耐高 温的菌株资源与其他具有特殊功能菌株采用原生质体融 合或现代生物技术整合出具有更大价值的工程菌株，应用 于生产，从而解决现实生产中存在的问题[15-17]，也是下一步 的研究方向。
表2 糖发酵结果 Table 2. Results of sugar fermentation