最新病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)资料
血凝和血凝抑制实验
3、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul
4、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分 钟
5、结果判定
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7
血凝效价测定
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结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集；
以出现＋＋（50％凝集）的抗原最高稀释 倍数为该抗原的血凝价（1:128）？？？ 。
25ul 1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一 个血凝单位。
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血凝抑制试验
1、将病毒抗原稀释成4个血凝单位（1/128×4=1:32）
2、在血凝板上1－12孔内各加入25ul生理盐水；
3、在第1孔内加入被检血清25ul，然后倍比稀释至第 10孔，最后弃25ul；
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注意事项
• 1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢， 以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡 红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄 色，之后直至清亮为清洗干净）。
• • 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸
取干净。
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1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集；
2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而 稍向孔底集中，即75％凝集；
3、 ＋＋：红细胞形成一个环状，四周有下凝集块， 即50％凝集；
4、 ＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四 周稍有凝集块，即25％凝集；
5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即 无凝集。
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血凝血凝抑制试验说明书
鸡新城疫血凝与血凝抑制实验鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验基本原理：许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。
血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。
器材及试剂:待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水/PBS、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。
实验步骤PBS的配制：1%鸡红细胞的配制：（一）血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。
3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。
4、室温静置10-30分，观察结果（见下表）。
5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。
（二）四单位检测：（三）血凝抑制试验（HI）取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。
2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为21~212 。
3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀；4、室温静置20min；5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。
6、室温静置10-30分，观察结果（见下表）；7、结果判定：第二排为抗原对照，红细胞应全部凝集，第三排为红细胞对照，红细胞应全部沉降。
血凝抑制实验报告三篇
血凝抑制实验报告三篇一、血凝试验操作程序1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。
2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。
3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。
第三排孔至第四排孔同上操作。
4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。
5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。
6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。
以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）二、血凝抑制试验操作程序1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。
（即1HAU抗原除以4）2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。
3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25 μL。
4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。
5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。
6、每孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。
置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。
7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2 log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。
将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。
当被检血清效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。
三、试验过程中的注意事项1样品的保存及试验前处理1.1 采集的血液样品应及时分离血清，最好分装至离心管中，标记清楚，离心后吸出血清，对应编号冷藏送检，并禁止运输过程中剧烈震动。
实训九 病毒的血凝及血凝抑制试验(ok)
实训九 NDV的血凝及血凝抑制试验（微量法）目的要求熟练掌握病毒的血凝及血凝抑制试验（微量法）的操作方法及结果判定，明确其应用价值。
仪器及材料pH7.2生理盐水、1％鸡红细胞悬液、NDV、新城疫病毒待检血清、微量血凝板（96孔V型板）、微量移液器（带吸头）、微型振荡器、温箱、离心机、天平、注射器。
方法与步骤（一）病毒的血凝（HA）试验1．1％鸡红细胞悬液的制备（1）采血先在注射器中吸入抗凝剂（3.8％枸橼酸钠液）1ml，采成年健康鸡血，心脏或静脉采血3-4ml。
（2）离心洗涤共3次，每次2000r/min，5min，每次离心后弃去上清液和白细胞，仅留纯的红细胞，最后读出红细胞的体积。
（3）配制用生理盐水将纯的红细胞稀释成体积比为1%的红细胞悬液。
2．操作术式振荡1min，室温(18℃～20℃)下作用30～40min,或置37℃恒温培养箱中作用15～30min观察结果（1）加生理盐水 1-12孔，每孔中分别加入50μl。
（2）NDV病毒液倍比稀释换吸头，吸取50μl病毒液，加于第1孔的生理盐水中，并用移液器吹打3～5次使液体混和均匀，然后取50μl移入第2孔，混匀后取50μl移入第3孔，依次倍比稀释到第11孔，第11孔中液体混匀后从中吸出50μl弃去。
第12孔不加病毒抗原，作盐水对照。
（3）加1%红细胞悬液换吸头，1-12孔，每孔中分别加入50μl。
加样完毕，振荡1min ，室温（18～20℃）下作用30～40min ，或37℃恒温箱中作用15～30min ，观察并判定结果。
3．结果判定及记录完全凝集（＋）：红细胞呈伞状分布于反应孔底层。
伞完全不凝集（－）：红细胞呈点状沉淀于反应孔底层。
点不完全凝集（±）：介于＋与－之间。
病毒的血凝价（或称血凝滴度）：能使一定量红细胞发生完全凝集的病毒最大稀释倍数为该病毒的血凝滴度，或称血凝价。
（二）病毒的血凝抑制（HI ）试验采用同样的血凝板，每排孔可测1份血清样品。
血凝试验HA及血凝抑制试验HI
25
25
1： 2 1： 4 1： 8 ﹟ ﹟ ﹟
弃去25
37℃ 15-30min 以100%凝集病毒最大稀释孔为该病毒的凝集价
血凝抑制试验(HI)
一、概念： 1 、 HI 试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制， 称HI试验。 2、抗体效价：出现红细胞凝集抑制现象的血清的最大稀释倍数叫抗体 效价。
红细胞悬液
25
25
25
25
……..
25
25
振荡1分钟，37℃温箱15—20分钟 结果判定 _ _ _ _
十 十十
#
#
#
﹟
﹟
_
以100%抑制凝集的血清最大稀释度为该血清的滴度，即血清效价
病毒的红细胞凝集试验（HA）
一、 概念 病毒的红细胞凝集现象：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞 表面受体结合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。 二、应用 1 、当以被检动物的某一器官为病料，进行HA试验，结果为阳性者，证明 该被检材料中有能凝集红细胞的某种病毒。 2 、凝集价的测定：将被检病毒材料，稀释成不同的稀释倍数，进行 HA试 验，出现血凝现象的各稀释孔中，以100%能出现病毒的红细胞凝集现象的 病毒的最大稀释倍数者即定为凝集价(血凝价)
HI试验
孔号
血清稀释倍 数 生理盐水 血清 4单位病毒
1
1： 2 25 25 25
2
1：4 25 25 25
3
1：8 25 25 25
4
10
1：1024 25 25 25
病毒对 照
1：2048 25
血清 对照
…….. …….. …….. ……..
25 25
病毒的血凝实验
病毒的血凝试验某些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集试验(HA)，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的血凝可为相应的特异抗体所抑制，即血球凝集抑制试验(HI)，具有特异性。
通过HA—HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
一、目的要求掌握HA和HI的基本操作技术，了解其实用价值。
二、实验材料新城疫病毒液0.1mL，1％鸡红细胞50mL，生理盐水50mL，阳性血清0.5mL,96孔“U”形或“V”形微量反应板，50微升定量移液管，滴头。
实验内容及操作程序1．血球凝集试验(HA)以新城疫病毒为例，操作过程如下(表 8—1)。
(1)在96孔“V”形微量反应板上进行，自左至右各孔加50uL生理盐水。
(2)于左侧第1孔加50uL病毒原液或收获液，混合均匀后，吸50uL至第2孔，混合均匀后，吸50uL至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃 50uL，稀释后病毒稀释度为第1孔1：2，第2孔1：4，第3孔1：8……。
最后1孔为对照。
(3)自左至右依次向各孔加1％鸡红细胞50uL置微型混合器上振荡lmin或以后固定转圈振荡反应板，使血球与病毒充分混合，在37℃温箱中作用15~30min后，待对照红细胞已沉淀可观察结果。
(4)判定结果：以100％凝集(血球呈颗粒性伞状凝集沉于孔底)的病毒最大稀释孔为该病毒血凝价，即一个凝集单位，不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。
表8-1 血细胞凝集(HA)试验表从表7-1看出，本病毒的血凝价为1：128，则1：128的0.1mL中有1个凝集单位，1：64、1：32分别为2、4个凝集单位。
或将128／4=32，即1：32为4个凝集单位，第12孔为血球对照应不凝集。
兽医免疫学实验HA和HI test (课件)
➢ +约有25％血球发生凝集；
➢ －不凝集，表现为血球沉于孔底，呈一致密小圆点，与对照孔相同
结果判定
以红细胞凝集50％的稀释度作为判定终点； 以50％鸡红细胞凝集（++）的最高病毒稀释倍数作
为该病毒的血凝价。 将血凝价规定为1个血凝单位（U）。
将血凝价规定为1个血凝单位（U）。
血凝单位的计算方法： 以血凝价为29(512x)为例 8U=8×1/512=64x,即将原病毒稀释64倍； 4U=4×1/512=128x,即将原病毒稀释128倍.
以抑制50％鸡红细胞凝集（++）的最 高血清稀释倍数作为该血清的血凝抑 制价。
作业
完成实验报告,将实际测定结果， 填写上表, 并说明其血凝价和血凝 抑制价是多少？
（二）血凝抑制试验（HI）
弃50µL
1．做标记；
2.第1孔加8U抗原和被检血清；
3. 从第1孔取样50µL，然后倍比稀释； 4.室温静置10min；
5．加红细胞,立即振荡2min，静置20－30min; 6.观察结果。
➢结果记录中的-、+、++、+++、++++和HA中
结果判定
以抑制50％鸡红细胞凝集的血清稀释 度作为判定终点；
当这些病毒与相应的抗体发生特异性结合 后，失去了与红细胞凝集的能力，称为红 细胞凝集抑制。
HA
HI
三、实验材料
1. 鸡新城疫病毒抗原(NDV)：弱毒株（Lasota） 2. 鸡红细胞：用生理盐水配成1%悬液 3. 抗凝剂：3.8%柠檬酸三钠缓冲液 4. 被检血清 5. V型血凝板、微量移液器，微量振荡器等
实验三 血凝和血凝抑制试验
2023年血凝抑制实验报告
2023年血凝抑制实验报告2023年血凝抑制实验报告1一、原理流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HA试验由此得名。
HA蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。
二、应用该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。
可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。
三、缺点只有当抗原和抗体HA亚型相一致时才能出现HI现象，各亚型间无明显交叉反应；除鸡血清以外，用鸡红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素；需要在每次试验时进行抗原标准化；需要正确判读的技能。
四、试验步骤1阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。
（3.8%枸橼酸钠（3.8g枸橼酸钠，100ml超纯水），101 kPa,20min高压灭菌，4℃保存备用,保存期1个月）。
210%和1%鸡红细胞液的制备2.1采血用注射器吸取阿氏液约1mL（3.8%枸橼酸钠），取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合（3.8%枸橼酸钠），放入装10mL阿氏液（生理盐水）的离心管中混匀。
2.2洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500～1800 r/min离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液（生理盐水），轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL（生理盐水），轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。
2.310%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。
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实践三病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）实践目的：1．掌握血凝（HA）和血凝抑制(HI)试验的原理2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法实践原理：某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。
这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。
实践内容：1．红细胞凝集试验(HA试验) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。
有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。
鸡新城疫病毒的HA试验现采用微量法，在V形微量反应板上进行。
(1)首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴(25µl)。
(2)用微量移液器取病毒抗原液25µl加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25µl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25µl液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2～1:2048，第12孔为红细胞对照。
(3)再以微量移液器每孔加1.0％红细胞悬浮液1滴(25µl)。
(4)在振荡器上振荡混匀约l～2分钟，再置37℃作用15分钟后观察结果。
(5)每次测定样品都应同时做红细胞对照。
表1 鸡新城疫血凝效价(HA)的测定术式(微量法)孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12病毒稀释倍数1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照生理盐水病毒液1％红细胞悬液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
能使100％红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。
如上例：病毒液的HA效价为1:128，HI试验时，病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4＝32倍的稀释液。
2.红细胞凝集抑制试验(HI试验) 有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。
(1)用微量移液器每孔各加入1滴稀释液(即25µl)，从第1孔到第10孔。
第1l孔加稀释液2滴(50µl)。
(2)以微量移液器取被检血清25µl，放入第1孔，，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被检血清与稀释液混合均匀，再吸取25µl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第10孔，最后第十孔吸取25µl液体弃掉；被检血清稀释倍数依为1:2～1:1024，第11孔为红细胞对照，第十二孔为抗原对照。
(3)每孔再加入含有四个单位的病毒液1滴(25µl)至第10孔，第1l孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第十二孔为抗原对照，加病毒液。
(4)置振荡器上振荡l～2分钟后，放37℃静置20分钟。
(5)每孔再加入1.0％红细胞悬浮液1滴(25µl)放振荡器上振荡l～2分钟混匀，置37℃，15分钟后判定结果。
表2 鸡新城疫红细胞凝集抑制(H1)试验(微量法)孔号 1 2 3456 78 9 10 11 12被检血清稀释倍数1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:1281:2561:5121:1024红细胞对照抗原对照生理盐水25µl被检血清弃掉4单位病毒液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl 振荡器上振荡1～2分钟，放37℃作用20分钟1%红细胞悬液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl 振荡器上振荡1～2分钟，放137℃作用15分钟结果例示-------++##-#注：- 表示不凝集、++ 表示部分凝集、# 表示完全凝集。
结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的细细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(10g2)表示。
如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1：128或HI效价为7(10g2)。
结果分析：(1)一般认为鸡的免疫临界水平为1:8(成年)或1:16(雏鸡)，随地区不同而稍有差异。
(2)鸡血清HI抗体效价高于1:16时可适当推迟新城疫免疫的时间，HI抗体效价在1:16以下，须进行新城疫疫苗接疫种，在新城疫流行的地区或鸡场，鸡的免疫临界水平应稍提高。
(3)鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价(㏒2)的平均值表示的。
如果某鸡群的10份样品中，HI抗体效价(㏒2)为8的有3份样品，为7的有5份样品，为6的有2份样品，它们的平均值为：8×3＋7×5＋6×2/3＋5＋2＝7.1平均水平在4(10g2)以上，说明该鸡群为免疫鸡群。
若在检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平，应根据临界水平以下的样品数在全部样品中所占的百分比决定免疫与否。
(4)大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于0.1％一0.5％，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为理想的抽样率应为2.0％。
(5)鸡群接种新城疫疫苗后，经2～3周测血清中的HI抗体效价，若提高2个滴度以上，表示鸡的免疫应答良好，疫苗接种成功；若HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。
作业：1．每三位学生做一个血凝试验，测定出新城疫病毒的血凝效价，记录试验结果。
2．根据血凝价将新城疫病毒稀释成4个单位病毒液，每三位学生做一个血凝抑制试验，检测待检血清的血凝抑制效价，记录试验结果3．回答问题：（1）病毒的血凝和血凝抑制试验的原理是什么？（2）病毒血凝反应是抗原抗体反应吗，为什么？（3）病毒血凝抑制反应是抗原抗体反应吗，为什么？实践三病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）（一）实践目的：1、掌握血凝及血凝抑制试验的基本方法及原理2、掌握鸡新城疫的试验室诊断技术。
（二）实践内容与基本要求：实践原理：某些病毒，如鸡新城疫、禽减蛋综合症等，有能凝集动物红细胞的特性，此即红细胞凝集现象。
这些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素，能与动物的红细胞表面的糖蛋白受体结合，发生红细胞凝集现象。
可以利用这一特性判断被检材料中有无病毒的存在，并可以测定病毒的效价。
1、血凝试验：常多用感染鸡胚液进行，凝集价可达1:160---1:640也可采用急性病例的组织浸出液，但凝集价较低。
本病毒可凝集许多动物的红细胞，但凝集性能不够稳定，故通常作血凝试验时都采用鸡的红细胞采血部位为心脏或翅静脉，取血后加抗凝剂或脱纤维，置于离心机中摇转加生理盐水洗涤三次后，将浓缩的红细胞配成1%生理盐水悬液，即可应用。
操作方法见实习指导。
凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数，称为该病毒的血凝滴度。
2、血凝抑制试验：单纯地使用血凝试验还不能作出明确的诊断，因为还有其它病原也能引起红细胞凝集，如引起慢性呼吸道病的禽败血支原体。
所以需用已知的抗血清作血凝抑制试验，以鉴别病毒。
也可用已知病毒来测定病鸡血清中的抗体，而得明确的诊断。
但不适于急性病例，通常要在感染后的5---10天，或出现呼吸症状后的2天，血清中的抗体到一定水平，就可用试管法。
（三）主要器材与药品器材：离心机、试管架、试管、注射器、针头5-5.5号、感染鸡胚，微量移液器1套，V型、96孔板，滴头，微量振荡器，塑料采血管，药品：病毒：鸡新城疫弱毒疫苗；0.85%生理盐水、1%红细胞浑悬液、血清、4单位病毒。
标准阳性血清；浓缩抗原；0.5%红细胞浑悬液；被检血清；pH7.0—7.2磷酸缓冲盐稀释液；pH7.0—7.2磷酸缓冲盐稀释液：氯化钠（GB1266—77）170g；磷酸二氢钾（GB1274—77）13.6g；氢氧化钠（GB629—77）3.0g；蒸馏水1000ml；高压灭菌，4保存，使用是作20倍稀释。
鸡1%红细胞悬浮液：由健康来航公鸡羽根静脉采血迅速置于装有抗凝血剂（3%柠檬酸钠溶液）的离心管中，用生理盐水洗涤3次，每次以3000r/min离心10分钟，将血浆、白细胞等充分洗去，根据沉淀的红细胞压积，用PH=7的生理盐水稀释成1%悬浮液。
被检血清：每群鸡随机采20—30份血样，分离血清。
采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6~8cm长。
将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以1000r/min离心5分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中，若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于0o C保存。
（四）实践方法操作方法4.1 微量血凝试验4.1.1 于微量血凝板的每孔中滴加磷酸缓冲盐稀释液50ul，共滴四排。
4.1.2 吸取1:5稀释抗原滴加于第一列孔，每孔50ul，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11孔各吸取50ul弃之。
最后一列不加抗原作对照。
4.1.3 于每孔加入0.5%红细胞悬液50ul。
4.1.4 置微型振荡器上振荡1分钟，或手持血凝板绕圆圈混匀。
4.1.5 放室温下（18~20oC）30~40分钟，根据血凝图象判定结果。
以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。
每次四排重复，以几何平均值表示结果。
4.1.6 计算出含4个血凝单位的抗原浓度，按式（B1）进行计算。
抗原应稀释倍数=血凝滴度/4……………………..(B1)上述材料全部按顺序加完后，振荡96孔板，使红细胞与病毒充分接触，然后置于20-22℃室温中静置，自第15分钟开始观察结果，每5分钟检查一次，至60分钟结束，观察结果时注意不要摇震96孔板。
如果被检材料中有病毒的存在，就会出现红细胞的凝集现象，红细胞出现凝集反应者,凝集成片或碎片,呈伞状铺于管底,不凝集的红细胞沉积于管底,呈一小圆点,将板倾斜,可以看到沉积于底板上的红细胞沿倾斜面呈线状流动.（五）结果观察：1．首先观察对照孔，红细胞应无凝集。